CN105368830B

CN105368830B - 基于kasp技术开发的用于棉花杂交种鉴定的核心snp标记

Info

Publication number: CN105368830B
Application number: CN201510807650.1A
Authority: CN
Inventors: 匡猛; 魏守军; 杨伟华; 王延琴; 周大云; 马磊; 方丹; 徐双娇; 单峰
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2015-11-19
Filing date: 2015-11-19
Publication date: 2019-01-04
Anticipated expiration: 2035-11-19
Also published as: CN105368830A

Abstract

本发明提供了一种基于KASP技术开发的用于棉花杂交种鉴定的核心SNP标记，这些SNP标记分布于棉花四倍体基因组26条染色体上，每条染色体各1个SNP标记，共26个SNP标记。基于这套核心SNP标记，可实现对棉花杂交种进行高通量的SNP分型检测。

Description

基于KASP技术开发的用于棉花杂交种鉴定的核心SNP标记

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及一种基于KASP技术开发的用于棉花杂交种鉴定的核心SNP标记。

背景技术

棉花是我国主要的经济作物，优良新品种的培育与推广对国民经济的发展与人民生活水平的提高具有重要意义。近年来，随着棉花杂交育种工作的迅速开展，加上杂交种所表现出的杂种优势，棉花杂交种在我国得到了广泛的推广与种植。棉花杂交种具有高产、优质、抗逆性强等优良特征特性，一般较常规品种增产15％左右。然而，棉花杂交种生产为劳动密集型产业，制种成本相对较高，杂交种子棉收购价格一般是普通常规棉种的4-5倍，受利益的驱动，即使在管理严格的情况下，以常规种(或亲本)冒充杂交种、或其他杂交种冒充畅销杂交种等掺杂使假的现象仍时有发生。依据形态性状进行杂交种田间鉴定的传统手段时效性差，且容易受到环境与主观因素的影响，杂交种市场混乱的局面难以得到有效控制。

近年来，分子生物学的发展使品种鉴定进入到基因水平，与传统的形态学方法和蛋白质电泳技术相比，DNA标记技术能揭示更多的多态性，具有准确可靠、简单快速、易于自动化的优点，是品种鉴定技术的发展趋势。国际植物新品种保护联盟(UPOV)于2010年发布了DNA分子标记选择和数据库构建指南(简称BMT指南)，并指出SSR和SNP标记是特别适用于品种鉴定的方法。SSR标记具有多态性高、呈共显性等优点，在品种鉴定工作中得到比较成熟且广泛的应用。但在实践过程中，也暴露出其检测位点较少、结果代表性较差、不宜实现数据共享等难以克服的缺陷。SNP标记作为第三代分子标记，与SSR标记相比具有以下优势：一是在基因组中密度更高分布更均匀；二是更适合数据库整合和数据共享；三是与功能基因甚至植物表型关联度高。因此，SNP标记目前被公认是极具应用前景的分子标记技术。SNP位点有基于测序、芯片及PCR等各种平台的检测方法。其中，KASP(Kompetitive AlleleSpecific PCR，即竞争性等位基因特异性PCR)技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels(Insertions and Deletions，插入和缺失)，可在广泛的基因组DNA样品中(甚至是一些复杂基因组的DNA样品)，对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断，该技术具有高度稳定性与准确性的特点。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于KASP技术开发的用于棉花杂交种鉴定的核心SNP标记。

为了实现本发明目的，本发明的一种基于KASP技术开发的用于棉花杂交种鉴定的核心SNP标记，所述核心SNP标记的编号分别为CS01～CS26，它们的信息见表1：

表1用于棉花杂交种鉴定的核心SNP标记的位点信息

编号

染色体

SNP物理位置

等位基因

编号

染色体

SNP物理位置

等位基因

CS01

A01

84794243

[A/G]

CS14

D01

55679680

[A/C]

CS02

A02

74214559

[A/G]

CS15

D02

9847565

[T/C]

CS03

A03

75052534

[T/C]

CS16

D03

4823185

[A/G]

CS04

A04

2646532

[T/G]

CS17

D04

47958771

[A/C]

CS05

A05

85852566

[A/C]

CS18

D05

52429193

[T/C]

CS06

A06

1810499

[A/G]

CS19

D06

27074415

[A/G]

CS07

A07

25080055

[T/C]

CS20

D07

24142791

[A/C]

CS08

A08

95435276

[A/C]

CS21

D08

17459267

[T/C]

CS09

A09

56254104

[A/G]

CS22

D09

3136498

[T/C]

CS10

A10

96197852

[T/C]

CS23

D10

12418835

[A/G]

CS11

A11

18858237

[A/G]

CS24

D11

51924653

[T/C]

CS12

A12

13185551

[T/C]

CS25

D12

3821224

[A/C]

CS13

A13

66681010

[A/C]

CS26

D13

35604367

[A/G]

表1中SNP物理位置是基于陆地棉遗传标准系TM-1的全基因组序列而确定的，所述陆地棉TM-1全基因组序列的版本号为NBI G.hirsutum genome(https://www.cottongen.org/)。

本发明还提供用于PCR扩增所述核心SNP标记的引物，所述引物序列信息见表2：

表2用于PCR扩增所述核心SNP标记的引物序列信息

编号	正向引物1(5′-3′)	正向引物2(5′-3′)	反向引物(5′-3′)
				CS01	ATCCTATGAACTATTCGAATGTGTTTCTA	CCTATGAACTATTCGAATGTGTTTCTG	CGCACAAAAGGCCATTTAACTTAGAAGAA
CS02	CTGGCTACGAGATCGTAACACA	CTGGCTACGAGATCGTAACACG	AATTTTGATGCCACTGTTAATGGGACAAAA
				CS03	CCCAATGTCTCAGTAACAGGTCA	CCCAATGTCTCAGTAACAGGTCG	CTCGACCTGTTACTCGACCTAGTAT
CS04	GTACAACTTAACCTAATGAATTTAACAATTAA	GTACAACTTAACCTAATGAATTTAACAATTAC	CTGTCCCTCCATTCAATTCAAAACTTCAA
				CS05	CGAACAACCATCTCTATGCTTGCA	GAACAACCATCTCTATGCTTGCC	ACCCGTTCCTGCATGTTAATTTTGATGTT
CS06	CGAGGACAGCAGACCATGTCA	CGAGGACAGCAGACCATGTCG	GCCTCTACGACGGCCATTGGTT
				CS07	AATGGCCAGACTCCACAGCAAATTT	GGCCAGACTCCACAGCAAATTC	GGTCCAACTAATTACAATTTGGCCACTAA
CS08	CAAATCCTTCGTGCTTTCAATCGAAA	CAAATCCTTCGTGCTTTCAATCGAAC	CCTATTCTCTAAGTGTCCAAGAGTTCAAA
				CS09	ACACGTTCACATCACAAACTCAAAGA	CACGTTCACATCACAAACTCAAAGG	CATTTTGAATATGGCGCAATTAGAAGGTTA
CS10	ACCTCTGTGGCTAGTGTTGACAA	CCTCTGTGGCTAGTGTTGACAG	CCACATTACGGACATTCCAGTTTATTGTT
				CS11	GATGCAGTTGACGGATCAGAGTTAA	ATGCAGTTGACGGATCAGAGTTAG	CAGTCTGTACTGCCAGATTGGGTTA
CS12	AACAACTAGAATTAAATTATTATAACACAAATA	AACAACTAGAATTAAATTATTATAACACAAATG	GTGTGGATGTGTGAGTTTTAATTCGATTTT
				CS13	GTATATGTCCGACATACGTATTTATGTTTA	ATATGTCCGACATACGTATTTATGTTTC	AAGAGATACATTCTCGTACCACCATGAAA
CS14	TTTATGTAGTCAACACTTATACCGTAAGA	ATGTAGTCAACACTTATACCGTAAGC	CCCCAAATGAACTTTCGAATCAACTTCTT
				CS15	TGGTAACAAGTTTGCGACTCGA	GGTAACAAGTTTGCGACTCGG	GTTGGATGGGGGTATTACTTGCAATTTTA
CS16	ACCACGAAAAGGGTTTCCCAAACTT	CACGAAAAGGGTTTCCCAAACTC	AGTTTGCCATATTGACTTCCCCCATTTTT
				CS17	GAAATCCAAATACTAGTACAAGTATAATCTAA	GAAATCCAAATACTAGTACAAGTATAATCTAC	CTTGAAATTCAATGAGTCGAAGTAAACAAT
CS18	GCCCGTAAATCAGTCATTGATCTCT	CCCGTAAATCAGTCATTGATCTCC	AAAGGCAATGTTGTGGTAGATGCTCTAT
				CS19	GAATGGCATTGCAATACTAGACTTCA	GAATGGCATTGCAATACTAGACTTCG	GACACTGYCTTCAAATCCTGGATACTT
CS20	CCCTATTTCTTCTTATAACTGAAATA	GCTCCCTATTTCTTCTTATAACTGAAATC	GAAAAAAAGATTCGGGGGGATTTCATTTTT
				CS21	AAGAGAAACCGCTGTGAGTTTGTGA	GAGAAACCGCTGTGAGTTTGTGG	CGAGACGTATAGGACCAATTGACGAA
CS22	AAGAGCTACCTATCGACAGTTGGTA	GAGCTACCTATCGACAGTTGGTG	CGATTTCATACATCTCCCTATTTGTTTCTA
				CS23	GATGCTTTCGCTCAAATGGACCT	GATGCTTTCGCTCAAATGGACCC	AGACCATCGATGCCAAAGGCCTTA
CS24	GTGCGTTAATGAAATGTCTACTAGGTA	GCGTTAATGAAATGTCTACTAGGTG	CCTTTTAACTACTCTGTAAGGAACAGACAT
				CS25	ACATTGATCTTTAAGATAACTTAAACTCTCTTT	CATTGATCTTTAAGATAACTTAAACTCTCTTG	GTGAAGATAGTCTATCTATTCTATGGAGTA
CS26	CAGGTGTCTCGCCATAATCGCTA	AGGTGTCTCGCCATAATCGCTG	GGAGGTGGATGAAGGAAAGAATATACATA

本发明提供的KASP基因分型方法操作简单，只需要将特异的KASP Primer mix和通用的KASP Master mix加入到含有DNA样本的PCR微孔反应板中，进行PCR扩增。最终结果采用荧光检测仪进行PCR产物分析即可。

所述KASP Primer mix含有三种特异性的引物：带有两种通用标签并连接SNP位点的两条正向引物(正向引物1和2)和一条反向引物。

所述KASP Master mix包含通用的FRET cassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl₂等组分，已预置于优化的缓冲液中。

本发明还提供所述核心SNP标记在棉花杂交种鉴定中的应用。

前述的应用，包括以下步骤：

1)提取待测棉花样品的DNA；

2)向步骤1)提取的DNA模板中加入特异的KASP Primer mix和通用的KASP Mastermix，进行PCR扩增；

3)采用荧光检测仪分析PCR产物。

其中，PCR反应体系为：

组分	384孔板	96孔板
			模板DNA	2.5μl	5μl
KASP Master mix	2.5μl	5μl
			KASP Primer mix	0.07μl	0.14μl
反应总体积	5.07μl	10.14μl

PCR反应条件为：

本发明提供了一套基于KASP技术开发的用于棉花杂交种鉴定的核心SNP标记，这些SNP标记分布于棉花四倍体基因组26条染色体上，每条染色体各1个SNP标记，共26个SNP标记。基于这套核心SNP标记，可实现对棉花杂交种进行高通量的SNP分型检测。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的KASP Master mix购自英国LGC公司，货号为KBS-1016-001。

实施例1基于KASP技术开发的26个用于棉花杂交种鉴定的核心SNP标记

基于陆地棉遗传标准系TM-1的全基因组序列，版本号为NBI G.hirsutum genome(https://www.cottongen.org/)进行SNP位点的筛选及定位。

本发明中核心SNP位点的筛选确定：基于遗传背景具有广泛代表性的样品数据，利用63k的Illumina棉花全基因组SNP芯片，根据以下特征进行筛选评估：(a)是否为单位点；(b)位点评估分值GenTrain score是否在0.6以上；(c)位点多态性,最小等位基因频率是否在0.2以上；(d)基因组上的分布情况；(e)杂交种亲本纯合率与杂交种F₁杂合率；(f)三种基因型cluster是否容易区分等因素。对每个位点进行筛选分析，去除不符合要求的位点；最终从每条染色体上挑选1个杂交种杂合率高且分型效果理想的核心SNP位点，合计26个。平均杂合率为0.61，平均最小等位频率为0.38，平均Score值为0.88。26个核心SNP的相关信息见表3。

表3 26个核心SNP的相关信息

根据26个SNP位点的侧翼序列，针对每个SNP位点，采用Kraken^TM软件在SNP位点上游设计两条正向引物，下游设计一条反向引物。26个SNP标记的引物序列信息见表2。

表2用于PCR扩增所述核心SNP标记的引物序列信息

实施例2利用核心SNP标记检测待测棉花杂交种‘中棉所63’的纯度

检测方法如下：

1、DNA提取

随机挑取待测‘中棉所63’杂交种种子96粒进行DNA制备。

(1)将单粒棉花种子去壳，充分粉碎后转入2ml的离心管中。

(2)加入800μl DNA提取液(1％SDS，0.01mol/L EDTA 8.0，0.7mol/L NaCl，0.05mol/L Tris-HCl，0.5％山梨醇，1％PVP，1％β-巯基乙醇)，漩涡至充分混匀后，65℃水浴30min，间隔10min左右轻摇一下。

(3)水浴结束后，加入等体积800μl苯酚、氯仿和异戊醇的混合液(体积比25:24:1)，上下颠倒混匀至不分层，10000rpm离心10min。

(4)将上清液转移到另一2ml离心管中，加入0.7倍体积异丙醇缓慢摇动几次，静置30min，絮状DNA成团析出。

(5)用剪口枪头吸取DNA转移至盛有70％乙醇的离心管中，洗涤两次。

(6)倒掉乙醇，自然通风干燥DNA，加入200μl TE(pH 8.0)或ddH₂O，充分溶解备用。

2、采用KASP技术进行基因分型检测

将实施例1中编号为CS11的SNP标记组成的特异的KASP Primer mix(正向引物1：GATGCAGTTGACGGATCAGAGTTAA；正向引物2：ATGCAGTTGACGGATCAGAGTTAG；反向引物：CAGTCTGTACTGCCAGATTGGGTTA)和通用的KASP Master mix加入到含有DNA样品的96孔板中，封板后进行水浴PCR，然后采用荧光微孔板检测仪读取检测结果。

其中，PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

3、结果分析

通过以上检测，获得96个待测杂交种‘中棉所63’种子样品在编号为CS11的SNP标记基因分型结果，统计结果表明：87个样品表现为杂合基因型AG，9个样品表现为母本基因型AA，即待测样品母本自交率为9.4％，杂交种纯度为90.6％。

实施例3利用核心SNP标记鉴定待测棉种是否为杂交种‘中棉所72’

检测方法如下：

随机挑选待测棉种与‘中棉所72’标准样品种子各24粒，按照实施例2的步骤进行DNA制备，同时使用26个核心SNP标记进行基因分型检测。PCR反应同实施例2的描述。

结果分析：通过以上检测，获得待测棉种与‘中棉所72’在26个SNP位点上的分型结果，比对分析结果表明：待测杂交种在16个SNP位点与‘中棉所72’表现出差异。表明待测杂交种不是‘中棉所72’的真实杂交种。

由于SNP标记检测手段较多，按照检测通量来划分具体情况如下：①传统的低通量SNP分型方法：包括Sanger测序方法、限制性内切酶酶切法、单链构象多态性技术等。这些分型方法或许成本较低，但耗时长、自动化程度差、实验条件需反复调试，因此，只适合检测样品量和位点数目均较少的实验对象。②中通量的SNP分型方法：如SNPlex、SnaPshot、TaqMan、质谱法等。中通量分型方法存在的问题是每个数据的价格较高，性价比低。③高通量的SNP分型方法：主要包括两类，一类是位点高通量的芯片检测平台，可用于SNP位点前期筛选，并且可定制不同位点通量的芯片产品；另一类是样品高通量的检测平台，可实现样品高通量、位点数中低通量检测。KASP技术即属于样品高通量的SNP检测技术，通过筛选与综合评价，获得一批少量的核心SNP位点，可实现对大量样品进行高通量的分型检测，一天内即可完成几十万个SNP位点的检测，尤其适用于品种纯度的快速检测。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.基于KASP技术开发的核心SNP标记组合在棉花杂交种鉴定中的应用，其中，所述组合包括26个核心SNP标记，编号分别为CS01～CS26，它们的信息如下：

编号染色体 SNP物理位置等位基因编号染色体 SNP物理位置等位基因 CS01 A01 84794243 [A/G] CS14 D01 55679680 [A/C] CS02 A02 74214559 [A/G] CS15 D02 9847565 [T/C] CS03 A03 75052534 [T/C] CS16 D03 4823185 [A/G] CS04 A04 2646532 [T/G] CS17 D04 47958771 [A/C] CS05 A05 85852566 [A/C] CS18 D05 52429193 [T/C] CS06 A06 1810499 [A/G] CS19 D06 27074415 [A/G] CS07 A07 25080055 [T/C] CS20 D07 24142791 [A/C] CS08 A08 95435276 [A/C] CS21 D08 17459267 [T/C] CS09 A09 56254104 [A/G] CS22 D09 3136498 [T/C] CS10 A10 96197852 [T/C] CS23 D10 12418835 [A/G] CS11 A11 18858237 [A/G] CS24 D11 51924653 [T/C] CS12 A12 13185551 [T/C] CS25 D12 3821224 [A/C] CS13 A13 66681010 [A/C] CS26 D13 35604367 [A/G]

SNP物理位置是基于陆地棉遗传标准系TM-1的全基因组序列而确定的，所述陆地棉TM-1全基因组序列的版本号为NBI G.hirsutum genome。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测棉花样品的DNA；

3)采用荧光检测仪分析PCR产物；

所述KASP Primer mix含有三种特异性的引物：正向引物1、正向引物2和反向引物；

所述引物序列信息如下：

所述KASP Master mix包含如下各组分：通用的FRET cassette荧光引物，ROX内参染料，KlearTaq DNA聚合酶，dNTP和MgCl₂。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，PCR反应体系如下：

组分 384孔板 96孔板模板DNA 2.5μl 5μl KASP Master mix 2.5μl 5μl KASP Primer mix 0.07μl 0.14μl 反应总体积 5.07μl 10.14μl

PCR反应条件为：94℃15分钟；94℃20秒，61-55℃60秒，每个循环降低0.6℃，10个循环；94℃20秒，55℃60秒，26个循环。