CN110331226B - 一种鉴定甜瓜品种真实性的方法及其专用ssr引物组合 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子标记及其检测领域，具体涉及一种鉴定甜瓜品种真实性的方法及其专用SSR引物组合。鉴定甜瓜品种真实性的SSR位点，选自如下第一SSR位点到第二十三SSR位点中的任1到23种；上述SSR引物组合选自：第一SSR引物对至第二十三SSR引物对，分别用于PCR扩增上述第一SSR位点至第二十三SSR位点，分别优选为与序列表中的SEQ ID NO：1‑46的核苷酸序列的同源性为85％‑100％的核苷酸序列。本发明可用于对甜瓜品种在种子或幼苗期进行早期鉴定，保证品种的真实性，切实保护生产者和育种家的权益，并为甜瓜种质资源和新品种保护提供技术支持。

Description

一种鉴定甜瓜品种真实性的方法及其专用SSR引物组合
技术领域
本发明属于分子标记及其检测领域，具体涉及一种鉴定甜瓜品种真实性的方法及其专用SSR引物组合。
背景技术
甜瓜是我国重要的蔬菜作物，栽培面积已达139.6万公顷，占全国蔬菜栽培面积的6.2％。改革开放以来随着甜瓜产业的快速发展，通过国家和各省审定的品种逐年增多。依据《非主要农作物品种登记办法》，2017年4月农业部公布了第一批非主要农作物品种登记目录，甜瓜位列其中。截止到2019年4月，甜瓜登记品种数量仅在两年内已达到826份。这种“井喷式”爆发现象为开展登记品种管理和市场监管，特别是依赖田间鉴定的方式提出了前所未有的挑战。由于甜瓜育种企业较小且分散，各省市之间品种审定相互不协调，甜瓜的品种管理未能有效跟进，存在很多假冒伪劣品种，其中很多为衍生、派生近似品种。加之良种生产基地管理混乱，盗育、套购品种现象猖獗，同名异种现象严重，种子质量事故时有发生。根据《非主要农作物品种登记指南》的要求，品种特性说明和品种DUS测试报告中涉及的有关性状如有明确关联基因，可以直接提交DNA检测结果。因此，我国急需建立与当前甜瓜品种管理需求相匹配的DNA快速检测技术。
近年来，SSR分子标记以其数量多、变异丰富、遗传稳定等优点广泛应用在品种真实性鉴定方面。目前，我国甜瓜品种鉴定的DNA分子检测主要依据SSR分子标记。但是，当时的SSR引物研发没有参考甜瓜基因组变异组大数据支撑，对扩增片段及SSR Motif内部的序列真实变异情况没有掌握，存在不真实变异情况；SSR引物筛选所用的品种数量较少，且不能代表我国当前市场的销售品种。因此现行标准容易造成扩增不成功，真实性、稳定性不佳等问题，进而造成分子鉴定判定结果假阳性、假阴性。
因此，在利用SSR分子标记鉴定甜瓜品种的工作中，需要一种基于大规模甜瓜重测序和分析甜瓜变异组信息的、稳定高效的SSR位点和测定方法。
发明内容
本发明提供了一种鉴定甜瓜品种真实性的方法及其专用SSR引物组合，可以得出稳定、高效的鉴定结果：待测甜瓜品种是否属于标准甜瓜品种中的某一种，以及具体是哪一种。
本发明是通过以下的技术方案实现的：
鉴定甜瓜品种真实性的SSR位点，所述SSR位点选自如下第一SSR位点到第二十三SSR位点中的任1到23种：第一SSR位点，位于甜瓜参考基因组第1染色体第1847398-1847413位，或其种间同源基因组片段；第二SSR位点，位于甜瓜参考基因组第2染色体第6334477-6334496位，或其种间同源基因组片段；第三SSR位点，位于甜瓜参考基因组第3染色体第200812-200829位，或其种间同源基因组片段；第四SSR位点，位于甜瓜参考基因组第3染色体第22844283-22844300位，或其种间同源基因组片段；第五SSR位点，位于甜瓜参考基因组第4染色体第1018597-1018623位，或其种间同源基因组片段；第六SSR位点，位于甜瓜参考基因组第5染色体第20435127-20435159位，或其种间同源基因组片段；第七SSR位点，位于甜瓜参考基因组第6染色体第8361484-8361531位，或其种间同源基因组片段；第八SSR位点，位于甜瓜参考基因组第7染色体第17712046-17712085位，或其种间同源基因组片段；第九SSR位点，位于甜瓜参考基因组第10染色体第6111025-6111063位，或其种间同源基因组片段；第十SSR位点，位于甜瓜参考基因组第5染色体第27813320-27813343位，或其种间同源基因组片段；第十一SSR位点，位于甜瓜参考基因组第4染色体第27172333-27172360位，或其种间同源基因组片段；第十二SSR位点，位于甜瓜参考基因组第9染色体第9538562-9538593位，或其种间同源基因组片段；第十三SSR位点，位于甜瓜参考基因组第2染色体第3081947-3081988位，或其种间同源基因组片段；第十四SSR位点，位于甜瓜参考基因组第1染色体第25729006-25729025位，或其种间同源基因组片段；第十五SSR位点，位于甜瓜参考基因组第10染色体第20131467-20131481位，或其种间同源基因组片段；第十六SSR位点，位于甜瓜参考基因组第11染色体第2933019-2933042位，或其种间同源基因组片段；第十七SSR位点，位于甜瓜参考基因组第8染色体第328530-328568位，或其种间同源基因组片段；第十八SSR位点，位于甜瓜参考基因组第7染色体第5234064-5234476位，或其种间同源基因组片段；第十九SSR位点，位于甜瓜参考基因组第6染色体第19383985-19384412位，或其种间同源基因组片段；第二十SSR位点，位于甜瓜参考基因组第7染色体第22420310-22420726位，或其种间同源基因组片段；第二十一SSR位点，位于甜瓜参考基因组第2染色体第15897718-15898183位，或其种间同源基因组片段；第二十二SSR位点，位于甜瓜参考基因组第1染色体第861407-861478位，或其种间同源基因组片段；第二十三SSR位点，位于甜瓜参考基因组第6染色体第423226-423240位，或其种间同源基因组片段。
鉴定甜瓜品种真实性的SSR引物组，所述SSR引物组用于分别扩增所述的SSR位点，所述SSR引物组包括：第一SSR引物对，用于扩增所述第一SSR位点；第二SSR引物对，用于扩增所述第二SSR位点；第三SSR引物对，用于扩增所述第三SSR位点；第四SSR引物对，用于扩增所述第四SSR位点；第五SSR引物对，用于扩增所述第五SSR位点；第六SSR引物对，用于扩增所述第六SSR位点；第七SSR引物对，用于扩增所述第七SSR位点；第八SSR引物对，用于扩增所述第八SSR位点；第九SSR引物对，用于扩增所述第九SSR位点；第十SSR引物对，用于扩增所述第十SSR位点；第十一SSR引物对，用于扩增所述第十一SSR位点；第十二SSR引物对，用于扩增所述第十二SSR位点；第十三SSR引物对，用于扩增所述第十三SSR位点；第十四SSR引物对，用于扩增所述第十四SSR位点；第十五SSR引物对，用于扩增所述第十五SSR位点；第十六SSR引物对，用于扩增所述第十六SSR位点；第十七SSR引物对，用于扩增所述第十七SSR位点；第十八SSR引物对，用于扩增所述第十八SSR位点；第十九SSR引物对，用于扩增所述第十九SSR位点；第二十SSR引物对，用于扩增所述第二十SSR位点；第二十一SSR引物对，用于扩增所述第二十一SSR位点；第二十二SSR引物对，用于扩增所述第二十二SSR位点；第二十三SSR引物对，用于扩增所述第二十三SSR位点。
在优选的实施方式中，所述SSR引物组中，所述第一SSR引物对，与序列表中的SEQID NO：1和SEQ ID NO：2的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第二SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第三SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第四SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第五SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第六SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第七SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第八SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第九SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第十SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第十一SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第十二SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第十三SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第十四SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第十五SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第十六SSR引物对，与序列表中的SEQ IDNO：31和SEQ ID NO：32的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第十七SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第十八SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第十九SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第二十SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第二十一SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：41和SEQ IDNO：42的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第二十二SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；所述第二十三SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；优选地，每对所述引物对的一条引物连接有荧光分子，更优选，所述荧光分子选自ROX、TAMRA、FAM、HEX。
鉴定甜瓜品种真实性的SSR试剂盒，所述SSR试剂盒配制为PCR反应体系；所述PCR反应体系包括：
所述SSR引物组，所述SSR引物组中的每一对的上游引物和下游引物在所述体系中浓度之比为1:1；所述上游引物和下游引物在体系中终浓度均优选为0.25μmol/L；
优选地，所述体系还包括：
dNTPs：体系中终浓度为每种0.15mmol/L，
氯化镁：体系中终浓度为2.5mmol/L，
DNA聚合酶：体系中终浓度为0.05U/μL，
PCR缓冲液：由体系中终浓度为10-50mmol/L的氯化钾与体系中终浓度为1-10mmol/L的Tris-HCL(pH7.5-9.0)配制而成。
一种鉴定甜瓜品种真实性的检测方法，包括以下步骤：
步骤一：检测待测甜瓜的如权利要求1所述SSR位点的基因型；步骤二：所述待测甜瓜的品种判定步骤：如果所述待测甜瓜基于所述23个SSR位点的基因型，和甜瓜标准品种中的某指定品种的基于所述23个SSR位点的基因型的差异位点数为0，则待测甜瓜与所述甜瓜标准品种的该品种属于相同的品种；如果所述待测甜瓜基于所述23个SSR位点的基因型，和甜瓜标准品种中的某指定品种的基于所述23个SSR位点的基因型的差异位点数为1，则待测甜瓜与所述甜瓜标准品种的该指定品种属于近似的品种；如果所示待测甜瓜基于所述23个SSR位点的基因型，和甜瓜标准品种中的各个品种的基于所述23个SSR位点的基因型的差异位点数均大于等于2，则待测甜瓜与每个所述甜瓜标准品种的品种均不相同。
在优选的实施方式中，所述检测待测甜瓜的SSR位点基因型步骤包括以下分步骤：分步骤一：分别以所述待测甜瓜的基因组DNA和甜瓜标准品种的基因组DNA为模板，分别采用所述SSR引物组合中的引物组的进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；分步骤二：对所述PCR扩增产物进行检测，获得所述待测甜瓜和所述甜瓜标准品种基于23个所述SSR位点的基因型。
在优选的实施方式中，所述分步骤二的检测方法包括：荧光信号检测：检测所述PCR扩增产物的荧光信号，获得所述待测甜瓜和所述标准甜瓜品种基于所述23个SSR位点的基因型；或：扩增产物片段检测：检测所述PCR扩增产物的片段大小，获得待测甜瓜和标准甜瓜品种基于所述19个SSR位点的基因型。
在优选的实施方式中，所述步骤二中，所述判定结果是根据聚类分析得到的。
在优选的实施方式中，所述标准甜瓜品种选自以下139个甜瓜品种：新红心脆，金龙，雪里红，黄皮9818，RX-99，香瑞一号，金玉，伊丽莎白，红绿早脆，鄂甜瓜5号，世纪蜜，黄冠，贮冠，雪甜一号，丰甜一号，西薄洛托，金露三号，久红瑞，久青蜜，RX-14-3，香瑞一号，玉露一号，鑫橙香，新世纪，银露一号，丰甜七号，黄晶玉，红佳，伊莉莎白，芭苏317，景甜208，香华，金利，金蜜龙，甬甜5号，东方蜜1号，翠甜1号，新辉，江淮蜜三号，红优，众天5号，白云，甘肃白兰瓜，红酥手1401，红酥手1402，艳阳，慈脆2号，江淮蜜六号，甬甜7号，甬越1号，慈溪菜瓜，甬甜8号，小白瓜，众天7号，中甜2号，众天8号，江淮蜜二号，江淮蜜一号，蜜丰一号，玉露一号，香瑞301，金妃，众云20，众天5号，瑞雪8号，丰甜7号，风味4号，热瓜旦子，风味5号，雪里红，墨香玉，白玉满堂，甜香玉，金橙，银露一号，玉如意，青酥，江淮蜜7号，西周蜜25号，众天翠雪，众天翠宝，白玉满堂，东方花脆，花脆，创研脆脆甜，日本甜宝，M16002，东之星，红玉脆，玉红，东方脆蜜，东方蜜1号，丰蜜29，西洲密25号，银蜜58，翠雪5号，香山雪蜜，伊丽莎白，京玉357，京玉280，京玉30，骄傲，京玉2008，京玉羊角酥，京玉10，京玉三号，京玉月亮，京玉绿宝，京域香帅，京玉墨宝，京玉白流星，京玉黄流星，京玉5号，京玉四号，京玉2号，玉美人，伊丽莎白，甜冠三号，京御蜜28，甜冠一号，甜蜜蜜，伊丽莎白，京蜜8号，京蜜10号，早熟一春，久久红，京蜜7号，京蜜15号，一特金，一特白，羊角脆，蜜脆香园，京蜜11号，春棚5号，中蜜198，IV92，精选羊角蜜，IV17，赤子牛。
所述SSR位点，或所述SSR引物组合，或所述SSR试剂盒，或所述检测方法，在以下x1或x2的应用：X1：鉴定待测甜瓜的品种是否属于标准甜瓜品种中的某一种；X2：鉴定待测甜瓜的品种具体为标准甜瓜品种中的哪一种。
本发明相比现有技术具有以下有益效果：
1、本发明提供的SSR引物组合可用于对甜瓜品种在种子或幼苗期进行早期鉴定，保证品种的真实性，切实保护生产者和育种家的权益，并为甜瓜种质资源和新品种保护提供技术支持。
2、本发明提供的方法可以鉴定得出：待测既待测甜瓜品种是否属于标准甜瓜品种中的某一种，以及具体是哪一种。故此方法既可以对未知甜瓜品种进行鉴定，也可以对已知品种的真实性进行鉴定。
3、本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中建立在23个引物组上的139个供试甜瓜品种的聚类图。
图2为实施例2为SSR标记个数(即SSR位点个数)与区分139个供试甜瓜品种的关系图。
图3-图25为实施例2中23个引物组在部分供试甜瓜品种中的SSR分型效果。
具体实施方式
定义如下：
甜瓜品种真实性：是指一个甜瓜品种与其遗传背景的真实对应性。
种间同源基因组片段：是指在甜瓜DHL92参考基因组序列的版本号为V3.6.1之外，其他品种的甜瓜中与甜瓜DHL92参考基因组序列同源的基因组片段。比如，就特定基因组片段，在本发明表3中的品种中与甜瓜DHL92参考基因组序列的版本号为V3.6.1存在相同的基因。
第一方面，本发明提供鉴定甜瓜品种真实性的SSR位点，分别位于甜瓜基因组，数量为23个，可选用其中的1个或多个，具体信息如表1所示。
上述SSR位点选自如下第一SSR位点到第二十三SSR位点中的任1到23种：
第一SSR位点，位于甜瓜参考基因组第1染色体第1847398-1847413位，或其种间同源基因组片段；
第二SSR位点，位于甜瓜参考基因组第2染色体第6334477-6334496位，或其种间同源基因组片段；
第三SSR位点，位于甜瓜参考基因组第3染色体第200812-200829位，或其种间同源基因组片段；
第四SSR位点，位于甜瓜参考基因组第3染色体第22844283-22844300位，或其种间同源基因组片段；
第五SSR位点，位于甜瓜参考基因组第4染色体第1018597-1018623位，或其种间同源基因组片段；
第六SSR位点，位于甜瓜参考基因组第5染色体第20435127-20435159位，或其种间同源基因组片段；
第七SSR位点，位于甜瓜参考基因组第6染色体第8361484-8361531位，或其种间同源基因组片段；
第八SSR位点，位于甜瓜参考基因组第7染色体第17712046-17712085位，或其种间同源基因组片段；
第九SSR位点，位于甜瓜参考基因组第10染色体第6111025-6111063位，或其种间同源基因组片段；
第十SSR位点，位于甜瓜参考基因组第5染色体第27813320-27813343位，或其种间同源基因组片段；
第十一SSR位点，位于甜瓜参考基因组第4染色体第27172333-27172360位，或其种间同源基因组片段；
第十二SSR位点，位于甜瓜参考基因组第9染色体第9538562-9538593位，或其种间同源基因组片段；
第十三SSR位点，位于甜瓜参考基因组第2染色体第3081947-3081988位，或其种间同源基因组片段；
第十四SSR位点，位于甜瓜参考基因组第1染色体第25729006-25729025位，或其种间同源基因组片段；
第十五SSR位点，位于甜瓜参考基因组第10染色体第20131467-20131481位，或其种间同源基因组片段；
第十六SSR位点，位于甜瓜参考基因组第11染色体第2933019-2933042位，或其种间同源基因组片段；
第十七SSR位点，位于甜瓜参考基因组第8染色体第328530-328568位，或其种间同源基因组片段；
第十八SSR位点，位于甜瓜参考基因组第7染色体第5234265-5234276位，或其种间同源基因组片段；
第十九SSR位点，位于甜瓜参考基因组第6染色体第19384185-19384204位，或其种间同源基因组片段；
第二十SSR位点，位于甜瓜参考基因组第7染色体第22420505-22420526位，或其种间同源基因组片段；
第二十一SSR位点，位于甜瓜参考基因组第2染色体第15897948-15897959位，或其种间同源基因组片段；
第二十二SSR位点，位于甜瓜参考基因组第1染色体第861433-861478位，或其种间同源基因组片段；
第二十三SSR位点，位于甜瓜参考基因组第6染色体第423226-423240位，或其种间同源基因组片段。
第二方面，本发明提供鉴定甜瓜品种真实性的SSR引物组，可以通过PCR扩增反应得基于上述SSR位点的PCR扩增产物。
上述SSR引物组合选自：第一SSR引物对至第十九SSR引物对，分别用于PCR扩增上述第一SSR位点至第十九SSR位点。
上述第一SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第二SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第三SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第四SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第五SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第六SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第七SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第八SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第九SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第十SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第十一SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第十二SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第十三SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第十四SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第十五SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第十六SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第十七SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第十八SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第十九SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第二十SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第二十一SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第二十二SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％；
上述第二十三SSR引物对，与序列表中的SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38的核苷酸序列的同源性大于等于85％，优选为100％。
在优选的实施方式中，上述SSR引物组合选自引物组01-23中的一组或多组；上述引物组01-23的DNA序列信息如序列表SEQ ID：1-46所示，参见表2。
上述引物组中，上游引物的5′端可带有荧光标签序列以便荧光PCR检测，例如FAM荧光标签序列的荧光信号为蓝色，HEX荧光标签序列的荧光信号为红色。
第三方面，本发明提供鉴定甜瓜品种真实性的SSR试剂盒，SSR试剂配制为PCR反应体系，该体系优选包括：
Figure BDA0002112129340000111
上述SSR引物组，上游引物和下游引物的终浓度之比为1:1。
第四方面，本发明提供一种鉴定甜瓜品种真实性的检测方法，包括以下步骤：
步骤一：检测待测甜瓜的SSR位点基因型。
分步骤一：分别以上述待测甜瓜的基因组DNA和甜瓜标准品种的基因组DNA为模板，分别采用上述SSR引物组合中的引物组的进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物；
分步骤二：对上述PCR扩增产物进行检测，获得待测甜瓜和甜瓜标准品种基于23个上述SSR位点的基因型。
所述检测可以为荧光信号检测：检测上述PCR扩增产物的荧光信号，获得待测甜瓜和标准甜瓜品种基于上述23个SSR位点的基因型；
上述检测也可以为扩增产物片段检测：利用毛细管电泳检测上述PCR扩增产物的片段大小，获得待测甜瓜和标准甜瓜品种基于上述23个SSR位点的基因型。
步骤二：待测甜瓜的品种判定步骤：
通过优选利用MEGA7软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis)，聚类分析待测甜瓜和标准甜瓜品种基于上述23个SSR位点的基因型得出结论以下结果：
如果上述待测甜瓜基于上述23个SSR位点的基因型，和甜瓜标准品种中的某品种基于上述23个SSR位点的基因型的差异位点数为0，即完全一致，则待测甜瓜与上述甜瓜标准品种中的某品种属于同一个品种；
如果上述待测甜瓜基于上述23个SSR位点的基因型，和甜瓜标准品种中的某品种基于上述23个SSR位点的基因型的差异位点数为1，则待测甜瓜与上述甜瓜标准品种中的某品种属于近似的品种；
如果待测甜瓜基于所述23个SSR位点的基因型，和甜瓜标准品种中的各个品种的基于上述23个SSR位点的基因型的差异位点数均大于等于2，则待测甜瓜与每个甜瓜标准品种的品种均不相同。
上述PCR扩增反应的程序优选为：
94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s，每循环降0.8℃，共12个循环；94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸45s，共25个循环；72℃终延伸10min。扩增产物电泳前于-20℃或冰上保存。
上述标准甜瓜品种包括以下139个甜瓜品种：新红心脆，金龙，雪里红，黄皮9818，RX-99，香瑞一号，金玉，伊丽莎白，红绿早脆，鄂甜瓜5号，世纪蜜，黄冠，贮冠，雪甜一号，丰甜一号，西薄洛托，金露三号，久红瑞，久青蜜，RX-14-3，香瑞一号，玉露一号，鑫橙香，新世纪，银露一号，丰甜七号，黄晶玉，红佳，伊莉莎白，芭苏317，景甜208，香华，金利，金蜜龙，甬甜5号，东方蜜1号，翠甜1号，新辉，江淮蜜三号，红优，众天5号，白云，甘肃白兰瓜，红酥手1401，红酥手1402，艳阳，慈脆2号，江淮蜜六号，甬甜7号，甬越1号，慈溪菜瓜，甬甜8号，小白瓜，众天7号，中甜2号，众天8号，江淮蜜二号，江淮蜜一号，蜜丰一号，玉露一号，香瑞301，金妃，众云20，众天5号，瑞雪8号，丰甜7号，风味4号，热瓜旦子，风味5号，雪里红，墨香玉，白玉满堂，甜香玉，金橙，银露一号，玉如意，青酥，江淮蜜7号，西周蜜25号，众天翠雪，众天翠宝，白玉满堂，东方花脆，花脆，创研脆脆甜，日本甜宝，M16002，东之星，红玉脆，玉红，东方脆蜜，东方蜜1号，丰蜜29，西洲密25号，银蜜58，翠雪5号，香山雪蜜，伊丽莎白，京玉357，京玉280，京玉30，骄傲，京玉2008，京玉羊角酥，京玉10，京玉三号，京玉月亮，京玉绿宝，京域香帅，京玉墨宝，京玉白流星，京玉黄流星，京玉5号，京玉四号，京玉2号，玉美人，伊丽莎白，甜冠三号，京御蜜28，甜冠一号，甜蜜蜜，伊丽莎白，京蜜8号，京蜜10号，早熟一春，久久红，京蜜7号，京蜜15号，一特金，一特白，羊角脆，蜜脆香园，京蜜11号，春棚5号，中蜜198，IV92，精选羊角蜜，IV17，赤子牛。
第五方面，本发明提供上述SSR位点，SSR引物组合，SSR试剂盒，述检测方法，在以下x1或x2的应用：
X1：鉴定待测甜瓜的品种是否属于标准甜瓜品种中的某一种；
X2：鉴定待测甜瓜的品种具体为标准甜瓜品种中的哪一种。
X1和X2均属于鉴定甜瓜品种真实性的应用。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1：用于鉴定甜瓜品种真实性的SSR引物组合的获得
一、23个SSR位点的发现
本发明基于72份甜瓜代表资源的重测序数据(NCBI序列号PRJNA327175)，首次发现并获得23个SSR位点。这72份甜瓜资源类型丰富，涵盖厚皮型、薄皮型以及中间型，基本包括了市场上现有的甜瓜主要的生态类型与农艺性状，尽可能多地体现了种质代表性，具有较高的遗传多样性(Genotyping-by-sequencing of a melon(Cucumis melo L.)germplasm collection from a secondary center of diversity highlights patternsof genetic variation and genomic features of different gene pools，2017，PMID:28068911)。
具体的，SSR位点的筛选标准如下：
在全基因组范围内选择位置均匀、多态性好、杂合度小、MAF>0.3、PCA聚类效果好、区分度高且两翼50bp序列保守(无InDel，无SSR，无其它SSR)的SSR位点。19个SSR位点的基本信息详见表1中第1至4列。其中SSR位点在染色体上的位置和motif信息是基于甜瓜DHL92参考基因组序列比对确定的，所述甜瓜DHL92参考基因组序列的版本号为V3.6.1(下载地址为：ftp://cucurbitgenomics.org/pub/cucurbit/genome/melon/v3.6.1/，以及https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/10697)。
表1. 23个SSR位点的基本信息
Figure BDA0002112129340000141
Figure BDA0002112129340000151
Figure BDA0002112129340000161
其中，“主要等位变异”是根据表3中139个供试甜瓜品种统计得到的。例如：某样品在某个位点仅出现1个等位变异，大小为281bp，则在该位点的主要等位变异的基因型写作281/281；某样品在某个位点有两个等位变异，大小分别为123bp、128bp，则在该位点的主要等位变异的基因型写作123/128。
二、用于鉴定甜瓜品种真实性的SSR引物组合的获得
基于步骤一发现的23个SSR位点，本发明的发明人开发了具有较高的多态性信息量(即PIC值，PIC值指的是一个标记，用于在群体检测多态性的价值；PIC值取决于检测的等位基因的数目和等位基因它们的频率分布；PIC值等于1减去所有等位基因频率的平方的总和。见表1中第5列)的用于鉴定甜瓜品种真实性的SSR引物组合。基于前述SSR位点在甜瓜DHL92参考基因组序列的版本号为V3.6.1中的上下游序列设计引物，SSR引物组合由23个引物组组成，每个引物组的名称见表2中第2列。每个引物组由2条引物序列组成，用于扩增一个SSR位点。23个引物组中各个引物的核苷酸序列如表2中第3列所示。
表2
Figure BDA0002112129340000162
Figure BDA0002112129340000171
实施例2：本实施例为实施例1开发的SSR引物组合的有效性检验。
本实施例中的139个供试甜瓜品种的基本信息见表3。139个供试甜瓜品种均为常见的优良品种或部分国外引进品种。
表3：139个供试甜瓜品种的基本信息
Figure BDA0002112129340000181
Figure BDA0002112129340000191
1、供试甜瓜品种的基因组DNA的获得
采用CTAB法分别提取139个供试甜瓜品种的叶片(混取30粒种子的真叶，即每个品种取30粒种子长出来的真叶，指的是：同一品种取30个不同植株的真叶混合)的基因组DNA，得到供试甜瓜品种的基因组DNA。
上述CTAB法的操作具体为：
分别摘取幼苗期的上述139个品种的叶片，置于冷冻干燥仪(CoolSafe 55-4)中脱水；然后用高通量研磨仪(Geno/Grind6875)打碎叶片，再取20μg叶片干粉，向其中加入800μL CTAB提取液(2％CTAB，1.4mM NaCl，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1％PVP-40，0.2％β-巯基乙醇)，混匀，于65℃水浴30min，加入等体积的氯仿/异戊醇(24：1)，在10000rpm/min条件下离心10分钟，吸取上清液转移至新的离心管中，加入0.8倍体积预冷的异丙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃放置30min后在4℃、12,000r/min离心10min。弃上清液，加入70％乙醇溶液洗涤2遍，自然条件下干燥加100μL ddH2O溶解DNA，得到供试甜瓜品种基因组DNA，检测浓度后4℃备用。
供试甜瓜品种的基因组DNA的质量和浓度均须满足PCR要求，达标标准为：紫外分光光度计Nanodrop2000(Thermo)检测A260/A280比值在1.8左右，A260/A230比值大于1.8；供试甜瓜品种的基因组DNA的浓度在10-30ng/μL。
2、分别以139个供试甜瓜品种的基因组DNA为模板，分别采用19个引物组进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。各个PCR反应体系中，名称中含有“F”的引物和名称中含有“R”的引物浓度比为1:1。
反应体系包括：
上游引物(名称中含有“F”)和下游引物(名称中含有“R”)在体系中浓度之比为1:1。
Figure BDA0002112129340000201
反应程序为：预变性：94℃5min；扩增：94℃变性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s，每循环降0.8℃，共12个循环；94℃变性30s，50℃退火45s，72℃延伸45s，共25个循环；终延伸：72℃10min。形成的扩增产物电泳前于4℃保存。
3、荧光毛细管电泳
完成步骤2后，根据SSR分子标记扩增片段大小的不同，可以根据不同仪器选用多个引物组合进行电泳。按照预先确定的组合引物，分别取等体积同一组合引物的不同荧光标记的扩增产物，TAMRA稀释50倍，其它荧光产物稀释100倍后充分混匀。从混合液中吸取2μL，加入到DNA分析仪专用上样板孔中。各孔再分别加入0.1μL分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺，在PCR仪上95℃变性5min，取出立即置-20℃冰箱内或冰上，冷却5min。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上。打开DNA分析仪，检查仪器工作状态和试剂状态。将装有样品的上样板放置于样品架基座上，将装有电极缓冲液的buffer板放置于buffer板架基座上，打开数据收集软件，按照DNA分析仪的使用手册进行操作。DNA分析仪将自动运行参数，并保存电泳原始数据。检测荧光引物所用激发波长及颜色参照仪器默认值(FAM的最大激发波长494nm，HEX的最大激发波长535nm，TAMRA的最大激发波长560nm，ROX的最大激发波长587nm)，需要定期对毛细管电泳设备进行光谱校正。
部分结果见图3。结果表明，各个引物组在供试甜瓜品种中可以得到很好的分型效果。
4、聚类分析
根据139个供试甜瓜品种基于23个SSR位点的基因型，利用MEGA7软件对139个供试甜瓜品种进行聚类分析。
建立在23个引物组上的139个供试甜瓜品种的聚类图如图1所示。结果表明，19个引物组可以完全区分表3中的139个供试甜瓜品种。由此可见，实施例1开发的SSR引物组合可以应用于甜瓜品种DNA指纹数据库构建和品种真实性鉴定。
5、效率评价
品种真实性鉴定可以采用序贯分析方式减少工作量。本发明的发明人比较了SSR标记个数(即引物组数)与区分139个供试甜瓜品种区分率的关系。
如图2所示的139个品种两两之间比较并统计的差异标记数，其中两两之间比较的结果的个数为C139 2＝139×128÷2＝9591个；在这9591个结果中，差异位点个数为14的约占总数的8％，差异位点个数为15的约占总数的9％，差异位点个数为16的约占总数的11％，差异位点个数为17的约占总数的12％，差异位点个数为18的约占总数的13％，差异位点个数为19的约占总数的13％，差异位点个数为20的约占总数的10％，差异位点个数为21的约占总数的6％，差异位点个数为22的约占总数的2％，差异位点个数为23的约占总数的0％，故14个以上差异位点的结果约占总数的86％，此结果说明用这些标记在139个品种的多态性好；23个引物组(即23个SSR标记个数)在139个供试甜瓜品种中的区分率达到100％。
实施例3：检测待测甜瓜品种是否属于139个供试甜瓜品种中的品种的方法
1、待测甜瓜品种的基因组DNA的获得
待测甜瓜品种的叶片取自北京市农林科学院蔬菜研究中心试验基地。
按照实施例2中的步骤1的方法，将“供试甜瓜品种的叶片”替换为“待测甜瓜品种的叶片”，其它步骤均不变，得到待测甜瓜品种的基因组DNA。
2、SSR引物及PCR反应体系的配置
按照实施例2中的步骤2的方法，将“供试甜瓜品种的基因组DNA”替换为“待测甜瓜品种的基因组DNA”，其它步骤均不变，得到待测甜瓜品种的PCR产物。
3、荧光毛细管电泳检测
取待测甜瓜品种的PCR产物。
将待测甜瓜品种的23个SSR扩增产物的片段大小分别与139个供试甜瓜品种(表3所示)的23个SSR位点进行对比，统计待测甜瓜品种和23个标准甜瓜品种的差异位点数，然后进行如下判断：
如果待测甜瓜品种与某标准甜瓜品种的差异位点数为2个及以上，则待测甜瓜品种和该标准甜瓜品种属于不同的甜瓜品种；差异位点数越多，遗传亲缘关系越远。
如果待测甜瓜品种与某标准甜瓜品种的差异位点数为1个或0，则待测甜瓜品种和该标准甜瓜品种为或疑似为同一甜瓜品种。
结果表明，待测甜瓜品种在23个SSR位点上与139个供试甜瓜品种的差异位点数均为4个以上，因此，待测甜瓜品种不属于139个供试甜瓜品种中的任何一个品种，即待测甜瓜品种与139个供试甜瓜品种中的任何一个品种都不相同。
实施例4
本实施例是采用毛细管电泳对比片段大小来判定甜瓜品种，而不是采用荧光信号判定。
本案例是以ABI 3730荧光毛细管检测平台为参考，如使用其他平台则根据设备操作要求做相应调整。
根据SSR分子标记扩增片段大小的不同，可以根据不同仪器选用多个引物组合进行电泳。
S1：按照预先确定的组合引物，分别取等体积同一组合引物的不同荧光标记的扩增产物，TAMRA稀释50倍，其它荧光产物稀释100倍后充分混匀。从混合液中吸取1μL，加入到DNA分析仪专用上样板孔中。各孔再分别加入0.1μL分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺，在PCR仪上95℃变性1min，取出立即置冰上，冷却5min。瞬时离心10s后置放到DNA分析仪上。
S2：打开ABI 3730 DNA分析仪，检查仪器工作状态和试剂状态。将装有样品的上样板放置于样品架基座上，将装有电极缓冲液的buffer板放置于buffer板架基座上，打开数据收集软件，按照DNA分析仪的使用手册进行操作。DNA分析仪将自动运行参数，并保存电泳原始数据。检测荧光引物所用激发波长及颜色参照仪器默认值。
S3：导出电泳原始数据文件，采用数据分析软件按照下列步骤进行数据甄别：在数据分析软件中预先设置好SSR引物名称及荧光类别、分子量内标、相应引物的扩增片段大小；将电泳原始数据文件导入分析软件，选择panel、分子量内标、Bin、质量控制参数等进行分析；分析软件会对检测质量赋以颜色标志进行评分，绿色表示质量可靠无需干预，红色表示质量不过关或未落入规定片段大小范围内，黄色表示有疑问需要查验原始图像进行确认。
S4：分别通过同时进行试验的标准样品、参照样品(依据引物选择少量的对照)，校准不同电泳板间的数据偏差后再读取扩增片段大小。甄别后的特异峰如果落入规定的片段大小范围内，则直接读取扩增片段大小；若其峰大多不在规定范围内，可将其整体平移尽量使峰落设置范围内后读取数据。
S5：将待测甜瓜品种的23个SSR扩增产物的片段大小分别与139个供试甜瓜品种(表3所示)的23个SSR位点进行对比，统计待测甜瓜品种和23个标准甜瓜品种的差异位点数，然后进行如下判断：
如果待测甜瓜品种与某标准甜瓜品种的差异位点数为2个及以上，则待测甜瓜品种和该标准甜瓜品种属于不同的甜瓜品种；差异位点数越多，遗传亲缘关系越远。
如果待测甜瓜品种与某标准甜瓜品种的差异位点数为1个或0，则待测甜瓜品种和该标准甜瓜品种为或疑似为同一甜瓜品种。
最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 一种鉴定甜瓜品种真实性的方法及其专用SSR引物组合
<160> 46
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctaacaaac acccaaacac tcttt 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttaatgtcct gggaaagagc ttttt 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaccttgaga gagaaatgga atggt 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tctatcccct ctaccatttc tgtct 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggtgagttga gctaatccat tgttt 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atccaattgc acgtcattga ctatc 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agagaagaaa aatgtcggga tctga 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaatttatgt tgaacccatg aggca 25
<210> 9
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
agacaatgaa gaagaagaag aagaaga 27
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
caattttagt gtcattgaat ctccaactc 29
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctccgttttg gttttcggtt taaag 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccaaggccta aaccatgttt catat 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tcaatgtgag atcaacacca tcatc 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcaaagacag tgccttttca tatga 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tttgtcttct tgtggtatcc ctaca 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgtccaaaat gtttaatggg atgga 25
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgcttgatga ttaaactatg ttcaaca 27
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
tattgatcgc catgaaaatg aagca 25
<210> 19
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gattgaagga gctggaatta tgctc 25
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tccactcgat acttctgatt ccttc 25
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aatctccgtg gccatactaa ataca 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tttttcgatt cgtttccttc tcctc 25
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cttttgccgt ttggatcaca tagaa 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aaacacaatc ctacactaca cacct 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
agcagataga ccctgtttga catta 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
atttctttcc ctcatcctac attcc 25
<210> 27
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tgtcttgggt ttattctctt cttcac 26
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
acatttgggt tgtttaggtt ctatct 26
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gaccgattaa ttgcgggagt atttt 25
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
acctgcattg acaacaaaaa tgaag 25
<210> 31
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ttctctctct ctctctcgtt tctct 25
<210> 32
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agtagagacg gagaatttct gatcg 25
<210> 33
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ctccgttttg gttttcggtt taaag 25
<210> 34
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ccaaggccta aaccatgttt catat 25
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gagaaaccag cagtagaaga acaag 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tcaacagatt tccctcattt ctcct 25
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tgcaaatatt gtgaaggcga 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aatccccact tgttggtttg 20
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
caatcaaaca tgaacccaca tcaga 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
atttcagcat tgttttgcct tctct 25
<210> 41
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tgcctcctat ttcatctcta cataact 27
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
aaatcttgtt gttgttgttg ttgtt 25
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tctcttgttg atcgaaaccc tagaa 25
<210> 44
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tcgtgaacca gaatgctcaa taaac 25
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ctctctcaat atgttcgcaa ttggt 25
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
aaatggttgg atttgtagag tgcag 25

Claims (6)

1.鉴定甜瓜品种真实性的SSR引物组，其特征在于，所述SSR引物组包括：
第一SSR引物对，序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；
第二SSR引物对，序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示；
第三SSR引物对，序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；
第四SSR引物对，序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示；
第五SSR引物对，序列如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示；
第六SSR引物对，序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示；
第七SSR引物对，序列如SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示；
第八SSR引物对，序列如SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示；
第九SSR引物对，序列如SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示；
第十SSR引物对，序列如SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20所示；
第十一SSR引物对，序列如SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22所示；
第十二SSR引物对，序列如SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示；
第十三SSR引物对，序列如SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：26所示；
第十四SSR引物对，序列如SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示；
第十五SSR引物对，序列如SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30所示；
第十六SSR引物对，序列如SEQ ID NO：31和SEQ ID NO：32所示；
第十七SSR引物对，序列如SEQ ID NO：33和SEQ ID NO：34所示；
第十八SSR引物对，序列如SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36所示；
第十九SSR引物对，序列如SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38所示；
第二十SSR引物对，序列如SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：40所示；
第二十一SSR引物对，序列如SEQ ID NO：41和SEQ ID NO：42所示；
第二十二SSR引物对，序列如SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44所示；
第二十三SSR引物对，序列如SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46所示。
2.根据权利要求1所述SSR引物组，其特征在于：
每对所述引物对的一条引物连接有荧光分子。
3.根据权利要求2所述SSR引物组，其特征在于：
所述荧光分子选自ROX、TAMRA、FAM、HEX。
4.鉴定甜瓜品种真实性的SSR试剂盒，其特征在于：所述SSR试剂盒配制为PCR反应体系；所述PCR反应体系包括：
权利要求1-3中任一项所述SSR引物组，所述SSR引物组中的每一对的上游引物和下游引物在所述体系中浓度之比为1:1；所述上游引物和下游引物在体系中终浓度均为0.25μmol/L。
5.根据权利要求4所述的鉴定甜瓜品种真实性的SSR试剂盒，其特征在于：所述体系还包括：
dNTPs：体系中终浓度为每种0.15mmol/L，
氯化镁：体系中终浓度为2.5mmol/L，
DNA聚合酶：体系中终浓度为0.05U/μL，
PCR缓冲液：由体系中终浓度为10-50mmol/L的氯化钾与体系中终浓度为1-10mmol/L的pH7.5-9.0的Tris-HCL配制而成。
6.权利要求1-3中任一项所述SSR引物组合，或权利要求4或5所述SSR试剂盒，在以下X1或X 2的应用：
X1：鉴定待测甜瓜的品种是否属于标准甜瓜品种中的某一种；
X2：鉴定待测甜瓜的品种具体为标准甜瓜品种中的哪一种；
所述待测甜瓜的品种选自：
新红心脆，金龙，雪里红，黄皮9818，RX-99，香瑞一号，金玉，伊丽莎白，红绿早脆，鄂甜瓜5号，世纪蜜，黄冠，贮冠，雪甜一号，丰甜一号，西薄洛托，金露三号，久红瑞，久青蜜，RX-14-3，香瑞一号，玉露一号，鑫橙香，新世纪，银露一号，丰甜七号，黄晶玉，红佳，伊莉莎白，芭苏317，景甜208，香华，金利，金蜜龙，甬甜5号，东方蜜1号，翠甜1号，新辉，江淮蜜三号，红优，众天5号，白云，甘肃白兰瓜，红酥手1401，红酥手1402，艳阳，慈脆2号，江淮蜜六号，甬甜7号，甬越1号，慈溪菜瓜，甬甜8号，小白瓜，众天7号，中甜2号，众天8号，江淮蜜二号，江淮蜜一号，蜜丰一号，玉露一号，香瑞301，金妃，众云20，众天5号，瑞雪8号，丰甜7号，风味4号，热瓜旦子，风味5号，雪里红，墨香玉，白玉满堂，甜香玉，金橙，银露一号，玉如意，青酥，江淮蜜7号，西周蜜25号，众天翠雪，众天翠宝，白玉满堂，东方花脆，花脆，创研脆脆甜，日本甜宝，M16002，东之星，红玉脆，玉红，东方脆蜜，东方蜜1号，丰蜜29，西洲密25号，银蜜58，翠雪5号，香山雪蜜，伊丽莎白，京玉357，京玉280，京玉30，骄傲，京玉2008，京玉羊角酥，京玉10，京玉三号，京玉月亮，京玉绿宝，京域香帅，京玉墨宝，京玉白流星，京玉黄流星，京玉5号，京玉四号，京玉2号，玉美人，伊丽莎白，甜冠三号，京御蜜28，甜冠一号，甜蜜蜜，伊丽莎白，京蜜8号，京蜜10号，早熟一春，久久红，京蜜7号，京蜜15号，一特金，一特白，羊角脆，蜜脆香园，京蜜11号，春棚5号，中蜜198，IV92，精选羊角蜜，IV17，赤子牛。
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