CN105343879A

CN105343879A - 用于捕食线虫的真菌和驱虫药联合药剂盒及其应用

Info

Publication number: CN105343879A
Application number: CN201510376841.7A
Authority: CN
Inventors: 杨晓野; 王瑞; 杨莲茹; 张伟; 乔蕾
Original assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Current assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Priority date: 2015-07-01
Filing date: 2015-07-01
Publication date: 2016-02-24

Abstract

本发明属于微生物学和寄生虫学领域，提出一种用于捕食线虫的真菌和驱虫药联合药剂盒，驱虫药有效成分选自阿苯达唑、伊维菌素、阿维菌素、左旋咪唑等常用驱线虫药；例如阿苯达唑驱虫药或伊维菌素驱虫药和捕食线虫性真菌的比例为每公斤动物体重：10～15mg：1×10⁶个厚壁孢子或0.2mg：1×10⁶个厚壁孢子。本发明针对目前我国无法迅速摒弃化学驱虫药而单独采用捕食线虫性真菌的现状，提出了捕食线虫性真菌与驱虫药联合应用模式，当消化道线虫被药物杀灭崩解后，虫卵以及捕食性真菌共同随粪排到外界，当虫卵发育为幼虫时刺激捕食性真菌产生捕食器-菌环和菌网，对虫体进行捕食杀灭，避免了幼虫扩散，再对家畜造成新的感染。

Description

用于捕食线虫的真菌和驱虫药联合药剂盒及其应用

技术领域

本发明属于微生物学和寄生虫学领域，具体涉及一种捕食线虫性真菌和驱虫药联合的组合物。

背景技术

动物寄生性线虫病是家畜的一类常见疫病，给畜牧业造成严重的损失和危害。长期以来，对其防治主要依靠一些驱虫药物来发挥了作用。但是随着驱虫药产生的抗药性；药物残留在乳、肉、蛋中对人体健康的危害；以及药物代谢产物排出后对环境的污染等问题的日益突出，已经引起人们的普遍关注。

捕食线虫性真菌是线虫的自然天敌，它通过形成菌环和菌网等捕食性器官，来捕获杀灭线虫幼虫，从而达到生物防控寄生性线虫对家畜感染的目的。正是因为此类真菌的这个特点，所以在寄生性线虫病防治方面，捕食线虫性真菌是一个国家极其重要的宝贵生物资源。利用捕食线虫性真菌，来对抗寄生性线虫对动物的感染是一项崭新的生物技术。利用这种方法来防控家畜线虫病，不仅有利于避免虫体产生抗药性，而且对环境保护，食品安全以及可持续的畜牧业发展等方面都有着重要的作用和意义。虽然捕食线虫性真菌在防治家畜线虫病方面有着较好的远景，但在生产实践中的最佳临床应用模式究竟是什么？特别是如何结合中国国情，将其应用于畜牧业生产实际，值得我们深入进行相关研究。

国内目前对家畜线虫病的防控驱虫，实际上是在给予动物驱虫药后，并不局限于家畜的活动，这样导致的结果是虫体被药物杀死后，虫体崩解，含有虫卵的子宫破裂，短期内家畜排出的粪便中会含有大量虫卵，随着家畜的无限制活动，粪便随意排泄，虫卵也到处散布，广泛污染草场。由于驱虫药一般对虫卵几乎没有作用，这些粪中的虫卵还会继续发育成感染性幼虫，家畜放牧吃草时再吃进去，造成感染，再引发疾病，这就是目前我国家畜驱虫现实中存在的一个问题。那么能否不用驱虫药，而单独使用捕食线虫性真菌来防控这类寄生虫感染呢？回答是可以，但究竟采用一种什么方式，国内外都在探讨。把其制成制剂，散布在草场上，需要大量的人力、物力和财力，成本太大，实际上是行不通的；国内外多数学者现在一般认为，最好是给家畜饲喂进去，这样这种对家畜体无害的真菌可以通过家畜消化道，随粪排出后，就能对粪中发育的线虫幼虫发挥作用。但这种纯粹用捕食线虫性真菌来防控寄生虫感染的方法在我国目前还行不通，因为捕食线虫性真菌并不能对家畜体内的线虫成虫作用，它只能对排出虫卵发育形成的幼虫发挥作用，避免家畜继续不断发生新的感染。所以，利用捕食线虫性真菌来生物防控寄生虫病是一个缓慢渐进的过程，需要较长的时间才可以逐渐降低寄生虫的种群数量。因此，从目前我国当前情况来看，单独用捕食线虫性真菌来防控家畜线虫病尚不现实，因为它不如驱虫药效果来的更直观快速。

发明内容

针对本领域存在的问题，本发明的目的是提出一种用于捕食线虫的真菌和驱虫药联合药剂盒。

本发明的第二个目的是提出所述联合药剂盒的应用。

实现本发明目的的技术方案为：

一种用于捕食线虫的真菌和驱虫药联合药剂盒，其特征在于，包括捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)和驱虫药，所述驱虫药有效成分选自阿苯达唑(丙硫咪唑)、伊维菌素、阿维菌素、左旋咪唑、甲苯咪唑、噻苯达唑等常用驱线虫药中的一种或多种；驱虫药和捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)的比例为0.1～15mg：1×10⁶个厚壁孢子。

其中，所述捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)菌株的保藏号为：CGMCCNo.9201。

优选地，所述捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)以冻干制剂的孢子悬液形式存在，每mL冻干制剂的孢子悬液中含有1×10⁶个厚壁孢子。

其中，所述驱虫药有效成分中的阿苯达唑、伊维菌素、阿维菌素、左旋咪唑、甲苯咪唑、噻苯达唑以口服剂或注射剂形式存在。

作为本发明优选技术方案之一，所述驱虫药有效成分中的阿苯达唑、阿维菌素、左旋咪唑、甲苯咪唑、噻苯达唑以口服剂形式存在，有效成分和捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)的比例为10～15mg：1×10⁶个厚壁孢子。

本发明另一优选技术方案为：所述驱虫药中的伊维菌素以注射剂形式存在，有效成分和捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)的比例为0.2mg：1×10⁶个厚壁孢子。

其中，伊维菌素注射剂浓度可为0.01g/ml。

进一步优选地，所述的联合药剂盒包括捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)和驱虫药，所述驱虫药为阿苯达唑；驱虫药和捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)的比例为：12mg：1×10⁶个厚壁孢子。

本发明所述的联合药剂盒是在家畜寄生性线虫病防控中应用。

所述应用，具体到羊的寄生性线虫病，阿苯达唑给药剂量为12mg/千克体重；伊维菌素给药剂量为0.2mg/千克体重，捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)给药剂量为1×10⁶个厚壁孢子/千克体重。

本发明的有益效果在于：

针对目前我国无法迅速摒弃化学驱虫药而单独采用捕食线虫性真菌防治家畜寄生性线虫病的现状，本发明进行了捕食线虫性真菌与驱虫药联合应用模式的研究，以发挥两者在杀灭寄生虫方面的各自优点，同时弥补双方的不足，在短期内起到事半功倍的作用，更使捕食线虫性真菌的临床应用方法接近于生产实际，更符合中国的国情，也更利于其在国内外家畜寄生性线虫病防控中得到推广应用。捕食线虫性真菌与驱虫药联合应用的原理是当消化道线虫被药物杀灭崩解后，大量的虫卵以及捕食性真菌共同随粪排到外界，在粪便小环境中，当虫卵发育为幼虫时，就会刺激捕食性真菌产生捕食器-菌环和菌网，对虫体进行捕食杀灭，从而避免了幼虫扩散到草场上，再对家畜造成新的感染。这样不仅提高了药物杀虫的实际效率，对杀虫后排出虫卵所孵出的幼虫进行杀灭。避免重新感染家畜；而且可以逐步减少化学驱虫药的使用次数，乃至最后停用，从而达到家畜寄生虫病防控的终极目标。

附图说明

图1为实施例1中C组与D组EPG值的比较结果。

图2为实施例1中C组与D组LPG值比较结果。

图3为实施例1中A组、B组与D组LPG比较结果。

图4为实施例2中E组、F组与D组LPG比较结果。

具体实施方式

现以以下实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中使用的手段，如无特别说明，均使用本领域常规的手段。

本发明涉及的捕食线虫性真菌-Duddingtoniaflagrans菌株，该菌株(菌株名称为CIM1)的保藏号为：CGMCCNo.9201，保藏日期：2014年5月5日。所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，电话：(010)64807355。

冻干制剂及混悬液的制备方法如申请号CN201410227501.3专利所公开的方法。

实施例1：

1、试验动物分组：

将40只试验动物分为4组(A组、B组、C组、D组)，每组10只羊。其中A组为捕食线虫性真菌-Duddingtoniaflagrans(D.flagrans)联合阿苯达唑(Albendazole,也叫丙硫咪唑)药物组；B组为单一阿苯达唑药物组；C组为单一捕食线虫性真菌-D.flagrans组；D组为空白对照组。

2、试验动物给药：

(1)A组绵羊按照药品说明书剂量，投喂阿苯达唑药物(12mg/千克体重)；并以1×10⁶个厚壁孢子/千克体重的剂量，投喂捕食线虫性真菌-D.flagrans冻干生物制剂配置的厚壁孢子混悬液。

(2)B组绵羊仅投喂阿苯达唑药物,投喂剂量同A组。

(3)C组绵羊仅投喂捕食线虫性真菌-D.flagrans厚壁孢子混悬液，投喂剂量同A组。

(4)D组绵羊作为空白对照组，仅投喂等量的蒸馏水。

3、试验动物粪便的采集及第三期幼虫培养

在给药和投喂真菌前0h以及投喂后12h、24h、36h、48h、60h、72h时，分别对各组绵羊进行直肠采粪，用于线虫虫卵计数。同时，取各个试验动物一定量的粪便，分别放置于直径为90mm的平皿中，于27℃恒温培养箱中15d，进行第三期幼虫培养；每天加适量蒸馏水于粪便中，并进行搅拌，以保证粪样的湿度与氧气。

4、捕食线虫性真菌-D.flagrans临床杀虫模式比较

(1)克粪便虫卵数(EPG)计数及比较

将采集到的40份粪便采用McMaster氏法进行线虫虫卵计数，得出克粪便虫卵数(EPG)，并得出各组的平均EPG数。结果见图1显示：C组羊在投喂D.flagrans捕食线虫性真菌生物制剂混悬液后，羊粪便中的虫卵数量变化不明显，说明捕食线虫性真菌对试验动物体内的成虫不起任何作用，该试验组线虫成虫象D组(空白对照组)的成虫一样，会持续产生虫卵。也表明捕食线虫性真菌对排出的线虫卵同样也不具有直接捕杀作用。

(2)克粪便幼虫数(LPG)计数及比较

采用贝尔曼氏法，对培养粪便中的线虫第3期幼虫进行分离计数，得出每个试验动物的克粪便幼虫数(LPG)，再计数出各组的平均LPG数。结果见下表和图2、图3。

表1不同试验组在各时间节点LPG值结果

注：同行肩标不同表示差异显著P﹤0.05；*表示同组间不同时间的比较。LPG平均数表示的是各组给药或给菌后的第三期幼虫平均数量。

图2结果显示：C组幼虫数量在12h后降至为0；24～48h内，略有很小的上升趋势；48h后，才开始有一定幅度上升。由此可知，捕食性真菌-D.flagrans厚壁孢子饲喂绵羊后12h，就已经随动物粪便和线虫卵陆续排出体外，因此才能在发育后，对粪便中线虫虫卵孵出的幼虫发挥较强的捕杀作用，在48h内，使幼虫数量维持在较低的水平范围内；而待48h后，投喂的真菌厚壁孢子逐渐被排出干净，此时，真菌密度降低，对幼虫的杀伤作用减弱，虫卵孵出的幼虫数量才开始快速上升。

结果证明，单独使用捕食性真菌-D.flagrans，对家畜的幼虫虽然也具有良好的捕杀作用，可在短时间大量减少粪便中线虫幼虫的数量。但因其对绵羊体内的线虫成虫无作用，所以待喂进羊体内的真菌完全排净后，羊体内继续随粪排出的虫卵仍可孵化出幼虫，因此才出现上升趋势。这种幼虫数量的增加，会造成环境中感染性幼虫的增多，从而导致线虫对家畜反复感染。所以，单独使用捕食线虫性真菌进行线虫病生物防治，需要反复多次投菌，才能逐渐降低线虫种群数量，这是一个持续发挥作用的缓慢过程，需要一定的时间周期。

(3)幼虫减少率统计和比较

计算公式：幼虫减少率(％)＝(对照组LPG-试验组LPG)/(对照组LPG)×100％

图3结果显示：D组(空白对照组)既未给药也未给菌，因此幼虫数量尽管有一定自然的波动，但变动幅度并不大，在正常范围内。A组绵羊在投喂D.flagrans捕食性真菌及阿苯达唑12h时，孵出的幼虫数量几乎接近为0；24h后一直持续到试验结束，幼虫数量完全为0；说明这段时间孵出的幼虫全部被捕食线虫性真菌杀死，而B组绵羊从开始服用阿苯达唑药物到用药后36h时，幼虫数量有一个急剧下降过程；之后才逐渐变为0，并一直保持到试验结束。而用药后12～36h期间，对比A组来看，B组排出的虫卵所孵出的幼虫在生产实际中就可能污染草场，导致家畜新的感染。此结果说明，D.flagrans捕食线虫性真菌联合阿苯达唑组相比单独用药组，更具有较好的实际驱虫效果。

以各组羊给药和/或给菌前所采粪样培养物第三期幼虫数作为对照，然后对每组羊在给药和/或给真菌后不同时间节点所采集的粪便，进行第三期幼虫的培养，分离统计发育的第三期幼虫数量，进行不同组别之间数据的比较。对不同捕食线虫性真菌-D.flagrans冻干生物制剂临床杀虫应用模式(捕食线虫性真菌临床单独应用模式和捕食线虫性真菌和驱虫药临床联合应用模式)进行评价。

表2不同试验组在各时间节点幼虫减少率统计结果

试验结果显示：A组在投喂阿苯达唑及D.flagrans捕食线虫性真菌生物制剂12h后，幼虫减少率达到97.0％；24h后达到100％并持续到试验结束；整个试验期间，平均幼虫减少率为99.5％；说明捕食线虫性真菌对虫卵孵出的线虫幼虫发挥了捕杀作用。相对而言，B组投喂阿苯达唑12h时，幼虫减少率为26.0％，之后逐渐上升；48h后，变为100％，说明此时阿苯达唑药物已将羊体内的线虫成虫驱杀干净，被驱杀的虫体崩解，子宫破裂后排出的虫卵已排除干净，没有新产出的虫卵排出。整个试验期间，平均幼虫减少率为76.9％。

对照A组和B组来看，A组(D.flagrans捕食线虫性真菌及阿苯达唑联合应用组)从给予试验动物绵羊阿苯达唑药物开始，到给药后48h这段时间内，随着虫体被药物杀死崩解后排出的虫卵所孵出的线虫幼虫完全是被D.flagrans捕食线虫性真菌捕获杀灭的，它避免了这些幼虫对家畜的再次感染，起到了预防作用；而B组由于仅给予了药物，这段时间内的虫卵孵出的幼虫就可能对家畜造成新的感染，导致药物驱虫实际效果大打折扣。而C组在投喂D.flagrans捕食线虫性真菌生物制剂12～24h期间，幼虫减少率达到100％；之后逐渐降低到54.6％；整个试验期间，平均幼虫减少率为85.2％。从中可以看出在给菌后一段时间内，由于D.flagrans捕食线虫性真菌排出较多，对虫卵孵出的幼虫发挥了较强的捕杀作用；之后随着时间的延长，排出的真菌数量越来越少，而试验动物体内的成虫不受真菌作用，仍然保持存活，因此会持续不断排出虫卵，而此时真菌的数量已不能完全将虫卵孵出的幼虫杀死，幼虫数量就会陆续上升，导致幼虫减少率逐渐降低。

实施例2：

1、试验动物分组：

将40只试验动物分为4组(E组、F组、C组、D组)，每组10只羊。其中E组为捕食线虫性真菌-Duddingtoniaflagrans(D.flagrans)联合伊维菌素药物组；F组为单一伊维菌素药物组；C组为单一捕食线虫性真菌-D.flagrans组；D组为空白对照组。

2、试验动物给药：

(1)E组绵羊按照药品说明书剂量，注射伊维菌素(0.2mg/千克体重)；并以1×10⁶个厚壁孢子/千克体重的剂量，投喂捕食线虫性真菌-D.flagrans冻干生物制剂配置的厚壁孢子混悬液。

(2)F组绵羊仅注射伊维菌素药物，投喂剂量同A组。

(4)D组绵羊作为空白对照组，仅投喂等量的蒸馏水。

步骤3试验动物粪便的采集及第三期幼虫培养和步骤4捕食线虫性真菌-D.flagrans临床杀虫模式比较的研究方法均和实施例1相同。

结果见图4。

比较实施例1、2联合用药的结果，发现D.flagrans捕食线虫性真菌联合伊维菌素驱虫药使用，不但药物能杀灭成虫，且D.flagrans捕食线虫性真菌捕杀了虫卵孵出的线虫幼虫，特别是在联合给真菌和药物后48h内更为反映的明显一些。但需要说明的是在本试验中，伊维菌素杀虫效果似乎不如阿苯达唑好，原因据分析在进行本试验所在羊场的绵羊可能对伊维菌素药物存在一定的抗药性。因为该地区近几年来，主要是使用伊维菌素进行驱虫，而且当驱虫效果不佳时，养殖者只是盲目地增加注射剂量或反复多次用药以提升驱虫效果。相反，很少使用丙硫咪唑进行驱虫，故而这次丙硫咪唑驱虫取得了良好的杀虫效果。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种用于捕食线虫的真菌和驱虫药联合药剂盒，其特征在于，包括捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)和驱虫药，所述驱虫药选自阿苯达唑、伊维菌素、阿维菌素、左旋咪唑、甲苯咪唑、噻苯达唑中的一种或多种；驱虫药和捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)的比例为0.1～15mg：1×10⁶个厚壁孢子。

2.根据权利要求1所述联合药剂盒，其特征在于，所述捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)菌株的保藏号为：CGMCCNo.9201。

3.根据权利要求1所述的联合药剂盒，其特征在于，所述捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)以冻干制剂的孢子悬液形式存在，每mL冻干制剂的孢子悬液中含有1×10⁶个厚壁孢子。

4.根据权利要求1所述的联合药剂盒，其特征在于，所述驱虫药有效成分中的阿苯达唑、伊维菌素、阿维菌素、左旋咪唑、甲苯咪唑、噻苯达唑以口服剂或注射剂形式存在。

5.根据权利要求4所述的联合药剂盒，其特征在于，所述驱虫药有效成分中的阿苯达唑、阿维菌素、左旋咪唑、甲苯咪唑、噻苯达唑以口服剂形式存在，有效成分和捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)的比例为10～15mg：1×10⁶个厚壁孢子。

6.根据权利要求4所述的联合药剂盒，其特征在于，所述驱虫药中的伊维菌素以注射剂形式存在，有效成分和捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)的比例为0.2mg：1×10⁶个厚壁孢子。

7.根据权利要求6所述的联合药剂盒，其特征在于，伊维菌素注射剂浓度为0.01g/ml。

8.根据权利要求1～7任一所述的联合药剂盒，其特征在于，包括捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)和驱虫药，所述驱虫药为阿苯达唑；驱虫药和捕食线虫性真菌(Duddingtoniaflagrans)的比例为12mg：1×10⁶个厚壁孢子。

9.权利要求1～8任一所述的联合药剂盒在制备家畜寄生性线虫病药物中的应用。