CN105331541B - 硅藻工程藻株及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及硅藻工程藻株及其制备方法、应用。本发明提供了二羟酸脱水酶基因的mRNA水平高于其相对应的野生型藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平的工程藻株，其在提高微藻油脂产量同时又不降低藻株自身的生长速率。同时，本发明还提供了一种获得二羟酸脱水酶基因的表达盒的工程藻株的制备方法以及工程藻株和所述制备方法在生物产油中的应用。

Description

硅藻工程藻株及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及生物产油技术领域，尤其涉及经过改良硅藻产油遗传特征的工程藻株及其制备方法、应用。

背景技术

地球上化石燃料的大规模持续消耗造成全球性能源短缺和油价飙升，根据有关专家估计，本世纪末地球上的石油资源将枯竭，特别是中国的石油资源25年内会开采殆尽；同时化石燃料的使用释放了大量的二氧化碳等有害气体，加速了全球变暖和空气污染，我国在2012年底开始一直到目前的大面积雾霾天气也给我们敲响了大气环境危机的警钟。因此，低污染的可再生新能源形式的开发和利用迫在眉睫。生物柴油作为一种优质的液体燃料替代品越来越受到青睐。生物柴油是以动物脂肪、植物油、微藻和微生物油脂或废弃油中的甘油三酯与甲醇或乙醇进行转酯反应而获得的，其物理和化学性质与柴油非常相近，并具有闪点高、硫污染物少等优点。

生产生物柴油的原料往往根据各地区可以得到的原料种类不同而不同。实际产油效率和技术不同。有人根据现有技术所能够产出的原料效率计算，微藻的产油效率远远超过其它高等植物和油料作物，因此被认为是制备生物柴油最有应用潜力的原料。微藻生产周期短，能够以工厂化方式培养、收集、提油；但是生产成本需要进一步降低，借助遗传改造的方法进一步提高微藻的产油量是途径之一。以往对于微藻产油率进行基因改造的思路主要有两种：一种是试图表达产油途径中某个基因，但至今没有真正成功的报道；另一种是阻断或削弱其他碳贮藏物的合成，提高油含量，这种方式一般会导致生长速率下降。

发明内容

本发明的目的就在于解决现有技术中一些具有商业价值的微藻产油量需要进一步提高、对产油途径的某些基因过表达或其他代谢途径基因进行重组，虽提高产油量却抑制其生长的问题，提供了通过二羟酸脱水酶基因过量表达提高微藻油脂产量的同时又不降低其生长速率的藻株。

本发明中提供的硅藻工程藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平高于其相对应的野生型藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平。

在一个具体的实施方式中，所述工程藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平为其相 对应的野生型藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平的2倍以上，优选为2-50倍，更加优选为5-20倍。藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平的高低与藻株的产油量成正相关，也就是说，藻株中二羟酸脱水酶基因的mRNA水平的含量相对高的话，该藻株的产油量也相对高；藻株中二羟酸脱水酶基因的mRNA水平的含量相对低的话，该藻株的产油量也相对低。通过分子生物学的方法来提高藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平，其相对应的产油量也相应的提高。

在一个具体的实施方式中，所述工程藻株的生长速率大于或等于其相对应的野生型藻株的生长速率。因为油的总得率决定于含油量和生物量的乘积，所以较高的生长速率对于生产是很重要的。而且产油藻株生长慢的话，容易被其他生物污染，从这方面来讲，产油藻株生长的慢对生产生物油也是不利的，因此有必要克服这一弊端。

在一个具体的实施方式中，所述工程藻株中含有通过基因重组方式而获得的二羟酸脱水酶基因的表达盒，且所述二羟酸脱水酶基因的表达盒中包括依次序的启动子序列、所述二羟酸脱水酶基因的序列和终止子序列。

在一个具体的实施方式中，所述二羟酸脱水酶的基因选自于其翻译成氨基酸后的序列与如SEQ ID NO:15(来源于三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)CCAP1055/1)翻译成氨基酸后的序列的一致性在60％以上，且具有二羟酸脱水酶活性的序列。

在一个具体的实施方式中，所述二羟酸脱水酶的基因所使用的启动子选自能够在硅藻中启动所述二羟酸脱水酶的基因转录的启动子，例如选自来源于硅藻的fcpA启动子或fcpB启动子；和/或其所使用的终止子选自能够在硅藻中终止所述二羟酸脱水酶的基因转录的终止子，例如选自来源于硅藻的fcpC终止子或fcpA终止子。

在一个具体的实施方式中，所述二羟酸脱水酶基因的表达盒中还包括与所述二羟酸脱水酶基因的表达方向相同的标记基因的序列，且所述标记基因的序列位于所述启动子序列和所述二羟酸脱水酶基因的序列之间，或位于所述二羟酸脱水酶基因的序列和终止子序列之间；或所述工程藻株含有通过基因重组方式获得的标记基因的表达盒，且所述标记基因的表达盒中包括依次的启动子序列、所述标记基因的序列和终止子序列。

在一个优选的实施方式中，所述标记基因选自博来霉素的抗性基因、新霉素磷酸转移酶基因、诺斯霉素抗性基因和荧光蛋白标记基因中的一种。

在一个具体的实施方式中，所述标记基因的表达盒的所述启动子序列选自来源于硅藻的启动子序列，例如fcpA启动子序列或fcpB启动子序列，且与所述二羟酸脱水酶基因的表达盒的所述启动子序列不同；

和/或所述标记基因的表达盒的所述终止子序列选自来源于硅藻的终止子序列，例如fcpC终止子序列或fcpA终止子序列，且与所述二羟酸脱水酶基因的表达盒的所述终止子序 列不同。

在一个具体地实施方式中，所述野生型硅藻选自褐指藻(Phaeodactylum)、小环藻(Cyclotella)、舟形藻(Navicula)、筒柱藻(Cylindrotheca)、海链藻(Thalassiosira)中的一种。

在一个优选地实施方式中，所述野生型硅藻选三角褐指藻(P.tricornutum)、隐秘小环藻(C.cryptica)、腐生舟形藻(N.saprophila)、梭形筒柱藻(C.fusiformis)、假微型海链藻(T.pseudonana)中的一种。

在一个具体的实施方式中，含有所述二羟酸脱水酶基因的表达盒和所述标记基因的表达盒的所述工程藻株选自保藏于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO：M2014341的三角褐指藻：：P_fcpA-ilvD-T_fcpC pHB5370-22(Phaeodactylum tricornutum：：P_fcpA-ilvD-T_fcpC pHB5370-22)。所述的三角褐指藻(P.tricornutum)CCTCC NO：M2014341的保藏地址为中国.武汉.武汉大学。邮编：430072，保藏日期为2014年7月16日。

本发明还提供了一种改良硅藻产油遗传特征的工程藻株的制备方法，包括如下步骤：

1)依照启动子、二羟酸脱水酶的基因、终止子的连接顺序将此三个元件克隆到基因载体上，获得二羟酸脱水酶基因的表达盒；

2)将所述步骤1)获得的二羟酸脱水酶基因的表达盒转化到硅藻中，获得重组子，并对重组子进行DNA鉴定，获得阳性的工程藻株；

3)比较所述工程藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平与其相对应的野生型藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平，以及任选的比较所述工程藻株与其相对应的野生型藻株的生长速率；

4)比较所述工程藻株与其相对应的野生型藻株的产油量。

其中，所述二羟酸脱水酶基因的表达盒可以克隆到适宜的质粒载体上。所述二羟酸脱水酶基因的mRNA水平高于其相对应的野生型藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平，则所述工程藻株的油产量高于其相对应的野生型藻株的产油量。或者所述二羟酸脱水酶基因的mRNA水平高于其相对应的野生型藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平，且述工程藻株的生长速率高于其相对应的野生型藻株的生长速率，则所述工程藻株的油产量高于其相对应的野生型藻株的产油量。

在一个具体的实施方式中，所述制备方法中的所述二羟酸脱水酶的基因选自于其翻译成氨基酸后的序列与如SEQ ID NO:15(来源于三角褐指藻CCAP1055/1)翻译成氨基酸后的序列的一致性在60％以上，且具有二羟酸脱水酶活性的序列。

在一个具体的实施方式中，所述制备方法中的所述二羟酸脱水酶的基因所使用的启动子选自能够在硅藻中启动所述二羟酸脱水酶的基因转录的启动子，例如选自来源于硅藻的fcpA启动子或fcpB启动子；和/或其所使用的终止子选自能够在硅藻中终止所述二羟酸脱 水酶的基因转录的终止子，例如选自来源于硅藻的fcpC终止子或fcpA终止子。

在一个具体的实施方式中，所述制备方法中的所述步骤1)和2)之间还包括步骤i)，将与所述二羟酸脱水酶基因的表达方向相同的标记基因的序列克隆到所述启动子序列和所述二羟酸脱水酶基因的序列之间的位置，或将其克隆到所述二羟酸脱水酶基因的序列和终止子序列之间的位置；或当所述的二羟酸脱水酶基因的表达盒克隆在质粒载体上时，依照启动子序列、标记基因的序列和终止子序列的连接顺序将此三个元件克隆到所述的二羟酸脱水酶基因的表达盒所在的质粒载体上，获得标记基因的表达盒；且所述标记基因的表达盒与所述二羟酸脱水酶基因的表达盒相邻。所述二羟酸脱水酶基因的表达盒的表达方向与所述标记基因的表达盒的表达方向可以相同或不同。

在一个优选的实施方式中，所述制备方法中的所述标记基因选自博来霉素的抗性基因、新霉素磷酸转移酶基因、诺斯霉素抗性基因和荧光蛋白标记基因中的一种。

在一个具体的实施方式中，所述制备方法中的所述标记基因的表达盒的所述启动子序列选自来源于硅藻的启动子序列，例如fcpA启动子序列或fcpB启动子序列，且与所述二羟酸脱水酶基因的表达盒的所述启动子序列不同；和/或所述标记基因的表达盒的所述终止子序列选自来源于硅藻的终止子序列，例如fcpC终止子序列或fcpA终止子序列，且与所述二羟酸脱水酶基因的表达盒的所述终止子序列不同。

在一个具体地实施方式中，所述制备方法中的所述野生型硅藻选自褐指藻指藻(Phaeodactylum)、小环藻(Cyclotella)、舟形藻(Navicula)、筒柱藻(Cylindrotheca)、海链藻(Thalassiosira)中的一种。

在一个优选地实施方式中，所述制备方法中的所述野生型硅藻选三角褐指藻(P.tricornutum)、隐秘小环藻(C.cryptica)、腐生舟形藻(N.saprophila)、梭形筒柱藻(C.fusiformis)、假微型海链藻(T.pseudonana)中的一种。

另外，本发明还提供了所述工程藻株或所述方法在硅藻产油中的应用。

进一步地，本发明提供了所述工程藻株或所述方法在硅藻产甘油三酯中的应用。其中，所述甘油三酯是生产生物柴油的主要原料。

有益效果和显著优点：

按照本发明，可以针对性的利用二羟酸脱水酶基因，在过量表达二羟酸脱水酶基因的含油硅藻三角褐指藻的工程藻株中，不仅含油量提高了，而且生长速率比野生型没有下降，往往还略有提升。得到的优良高产油的工程藻株，为生物柴油的生产降低了成本，提高了市场竞争力。

通过采取以上方法，得到的高产油株甘油三酯含量最高的一株比野生型藻株高5.39％。根据文献中报道，生长速率为10gm^-2d^-1、含油量(甘油三酯)为30％的藻株，每公顷年产 生物柴油大约为12000L，因而每增加1％的含油量，每年每公顷就要多产出400L的生物柴油。以现有的生物柴油价格6.0元/L为标准，该工程藻株每年每公顷会增加大约1.3万元的产值。

附图说明

图1是构建的pHB5370的质粒图谱，其中，ori为pHB5370在大肠杆菌中复制的复制区，Amp^r为氨苄霉素抗性基因，P_fcpA为fcpA的启动子，ilvD为二羟酸脱水酶基因，T_fcpC为fcpC的终止子，P_fcpB为fcpB的启动子，sh ble为博来霉素抗性基因，T_fcpA为fcpA的终止子。

图2是针对博来霉素(Zeocin)抗性重组子的PfcpA-ilvD片段的PCR检测图[以fcpA-2F(SEQ ID NO：5)和ilvD-2-R(SEQ ID NO：2)为引物]，其中，图中的M为1.0kb DNA分子量标准；序号1-39为筛选的抗性重组子；wt为工程藻株的相对应的野生型藻株CCAP1055/1；从检测图可以看出，序号为1、2、9、16、17、20、21、22、24、25、27、33、35、36和39的抗性重组子的PCR片段的大小为2.5kb，为其所对应的藻株为阳性的工程藻株。

图3是随机挑选的代号分别为pHB5370-1、pHB5370-16、pHB5370-17、pHB5370-21和pHB5370-22的5个工程藻株的二羟酸脱水酶基因转录水平的qRT-PCR[以ilvD-qRT-F(SEQID NO：11)和ilvD-qRT-R(SEQ ID NO：12)为引物]检测结果；wt为工程藻株的相对应的野生型藻株三角褐指藻CCAP1055/1；图中显示5个重组子均为二羟酸脱水酶基因过表达工程藻株，且5个工程藻株的表达水平均高于其相对应的野生型藻株CCAP1055/1。其中pHB5370-1和pHB5370-17的二羟酸脱水酶基因转录水平相当，且在5个工程藻株中的转录水平相对最低，但与wt相比，pHB5370-1和pHB5370-17的二羟酸脱水酶基因转录水平是wt的5倍以上，而转录水平最高的pHB5370-22是wt的19倍之多。

图4是代号分别为pHB5370-1、pHB5370-16、pHB5370-17、pHB5370-21和pHB5370-22的5个二羟酸脱水酶基因过表达工程藻株细胞中的总脂含量。从图中可以看出，5个工程藻株的总脂含量均高于wt，也就是说，均高于其对应的野生型藻株CCAP1055/1，其中，总脂含量最低的是藻株pHB5370-16，比wt的总脂含量提高了0.5％；总脂含量最高的是藻株pHB5370-22，比wt的总脂含量提高了18.7％。

图5是代号分别为pHB5370-1、pHB5370-16、pHB5370-17、pHB5370-21和pHB5370-22的5个二羟酸脱水酶基因过表达的工程藻株细胞中的甘油三酯含量；wt为所述工程藻株相对应的野生型藻株CCAP1055/1，图中显示所述工程藻株中的甘油三酯含量均高于wt，也就是说，均高于其对应的野生型藻株CCAP1055/1，其中，甘油三酯脂含量最低的是藻株pHB5370-21，比wt的总脂含量提高了12.6％；总脂含量最高的是藻株pHB5370-22，比wt的总脂含量提高了20.4％。

图6是代号分别为pHB5370-1、pHB5370-16、pHB5370-17、pHB5370-21和pHB5370-22的5个二羟酸脱水酶基因过表达工程藻株与其相对应的野生型藻株CCAP1055/1的生长曲线的比较；图中显示两株工程藻株与其相对应的野生型藻株CCAP1055/1生长速率相当，另外3株工程藻株略高于相对应的野生型藻株CCAP1055/1。

具体实施方式

下面结合具体的实施例及附图对本发明做详细说明。

实施例1

构建过量表达二羟酸脱水酶基因(ilvD)的质粒

构建质粒所用限制性内切酶、T4DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶和T4DNA连接酶均为大连宝生物有限公司(Takara)产品。

以ilvD-1-F(SEQ ID NO：1)和ilvD-2-R(SEQ ID NO：2)为引物，硅藻研究的模式种三角褐指藻(P.tricornutum CCAP1055/1)(英国藻类和原生动物培养中心CCAP1055/1)基因组为模板，PCR扩增出2.3kb的ilvD片段，克隆到pMD18-T中，得到质粒pHB5342。PstI和EcoR V酶切pHB2983(刘飞飞等，水生生物学报，2013,37:799-802)，利用T₄DNA聚合酶补平[补平反应体系为：18.5μl的DNA限制性内切酶反应体系中直接加入1μl的2.5mM dNTPs和0.5μl的T₄DNA聚合酶(5u/μl，Takara)，16℃，反应30min，70℃灭活10min。]回收400bp的fcpA启动子片段(也可以通过以三角褐指藻的基因组为模板进行PCR扩增得到)，与Xba I酶切pHB5342后补平回收的5kb的质粒线性片段连接，将fcpA启动子片段连至ilvD基因前端，用引物PfcpA-2F(SEQ ID NO：5)和ilvD-3-R(SEQ ID NO：6)筛选fcpA启动子与ilvD基因方向相同的克隆，得到质粒pHB5354。用TfcpC-1-F(SEQ ID NO：3)和TfcpC-2-R(SEQ ID NO：4)为引物，三角褐指藻基因组为模板，PCR扩增出520bp的fcpC终止子片段，与Sph I酶切pHB5354补平后回收的5.4kb的质粒线性片段连接，插入ilvD基因后端，用引物ilvD-3-F(SEQ ID NO：7)和TfcpC-2-R(SEQ ID NO：4)筛选fcpC终止子与ilvD基因方向一致的克隆，得到pHB5369质粒。Kpn I酶切pHB5369补平后回收6kb的质粒线性片段，与Pst I和EcoR I酶切pHB3174(刘飞飞等，水生生物学报，2013,37:799-802)补平回收1.2kb的P_fcpB-sh ble-T_fcpA小片段连接，用ble-F(SEQ ID NO：8)/PfcpA-R(SEQ ID NO：10)和ble-R(SEQ ID NO：9)/PfcpA-R(SEQ ID NO：10)两对引物检验P_fcpB-sh ble-T_fcpA插入方向(sh ble基因和ilvD基因的方向相反)，得到其插入方向与ilvD基因相反的克隆，最终得到质粒pHB5370(见图1)。

该质粒中以三角褐指藻fcpB启动子和fcpA终止子分别驱动和终止sh ble基因的表达，fcpA启动子和fcpC终止子分别驱动和终止ilvD基因的表达。质粒结构如图1所示。

实施例2

转化三角褐指藻

基因枪法：原理是被金属微粒(金粉或钨粉)吸附在其表面的外源DNA在一定的高压气体驱动作用下，高速被射入受体细胞中，并整合到受体基因组中。

采用GJ-1000高压气体基因枪(宁波新芝生物科技股份有限公司)进行转化，所用压力为10.5Mpa。首先制备金粉悬液，称取30mg直径为1.0μm的金粉(宁波新芝生物科技股份有限公司)，置于1.5mL的Eppendorf管中，(1)加入1mL 75％乙醇，于涡旋仪上剧烈涡旋震荡20min，使金粉充分分散，在75％乙醇中浸泡15min，6000rpm离心5s，去上清。(2)加1mL无菌ddH₂O，剧烈涡旋震荡3min，静置1min，6000rpm离心5s，去上清。重复该步骤3次。(3)加500μL50％的灭菌甘油水溶液(v/v)，震荡悬浮，金粉的最终浓度为60mg·mL^-1，分装于灭菌的1.5mL的Eppendorf管中，保存于-20℃备用。

然后制备DNA微弹，取处理好的金粉悬液在涡旋仪上震荡5min，使聚集的金粉充分散开。向50μL金粉悬浮液中依次加入以下组分:5μL质粒DNA(浓度为1μg·μL^-1)，震荡30s；20μL 0.1M的三盐酸亚精胺(Spermidine trihydrochloride，经过0.22μm滤器除菌，分成小份于-20℃贮存，时间不能超过1个月)；50μL 2.5M的CaCl₂(经过0.22μm滤器除菌，分成小份于-20℃贮存)；以上溶液均需慢慢加，每次加入10μL，边加边震荡。继续震荡10min，冰上静置10min，3000rpm离心10s，小心去上清。加250μL预冷的无水乙醇洗涤3次，弃上清。用60μL无水乙醇重悬，置于冰上待用。此管可供3枪使用。

轰击前取约1×10⁸个藻细胞涂布于无抗性固体人工海水培养基(人工海水培养基加1.2％琼脂)平板中央约1/3处。将平板放置在样品室内进行轰击。被轰击过的平板放在20℃光照培养箱中复苏24—48h之后加500μL液体人工海水培养基[人工海水基本成分(Harrison et al,1980，J.Phycol.16,28–35)外加1/2f营养盐(Guillard，1975，In:Smith,W.L.,Canley,M.H.(Eds.),Culture of Marine Invertebrate Animals.Plenum Press,New York,pp.29–60)]至每个平板上，将藻细胞轻轻冲洗下来，将被轰击过的培养皿放在20℃光照培养箱中弱光复苏24–48小时后，将藻细胞转入含75μg·mL^-1的博来霉素(zeocin)1/2人工海水培养基平板，轻轻地涂布均匀，在温度为20℃，光强为50-70μE·m^-2·s^-1条件下持续光照培养，等待抗性工程藻株的长出。转化以不加质粒DNA金粉轰击细胞作为阴性对照。以zeocin筛选工程藻株，从中挑选39株工程藻株，提取其基因组DNA做为模板，以PfcpA-2F(SEQ ID NO：5)和ilvD-2-R(SEQ ID NO：2)为引物，进行PCR扩增fcpA启动子和ilvD 全长片段(P_fcpA-ilvD)，同时以野生型藻株CCAP1055/1的基因组DNA作为模板进行PCR(图2)。共选出15株工程藻的核基因组中有完整的外源片段P_fcpA-ilvD插入的工程藻株。

15株工程藻株挑选其中5个进一步通过荧光定量PCR实验鉴定ilvD基因的转录水平，首先将藻株接种于人工海水培养基中，于20℃，50—70μE·m^-2·s^-1光照通气培养7天，离心收集液氮保存。参照TRIzol Reagent(invitrogen)试剂盒使用说明书进行mRNA提取，所用内参基因为H4基因。利用公式R＝(1/2)^{(ilvDCt-H4Ct)}，计算出野生型藻株CCAP1055/1和各个工程藻株ilvD基因的R值，得出与野生型藻株CCAP1055/1的倍数关系作图。

试剂盒消化和反转录反应使用Prime Script reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect for Real Time)试剂盒，参照其说明书进行。

(1)试剂盒消化：12μL体系中加入以下物质

混匀后，置于PCR仪上42℃反应2min,4℃保存。

(2)反转录：20μL体系加入以下物质

混匀后，置于PCR仪上37℃ 15min；85℃ 5S,4℃保存。反转录完成后用管家基因H4的引物H4-qRT-F(SEQ ID NO:13)和H4-qRT-R(SEQ ID NO:14)进行检测。

实时荧光定量PCR反应使用SYBR Premix Ex Taq^TM II(Takara)进行，20μl反应体系中加入10μL SYBR Premix Ex Taq^TM(2×)，引物各0.4μM，0.4μLROX，2μL的cDNA和去离子水定容至20μL。目的基因引物为ilvD-qRT-F(SEQ ID NO:11)/ilvD-qRT-R(SEQ ID NO:12)，内参基因H₄的引物为H4-qRT-F(SEQ ID NO:13)/H4-qRT-R(SEQ ID NO:14)。

实时荧光定量PCR是在ABI公司的Applied Biosystems StepOne^TM Real-Time PCRSystems中操作的，具体程序如下：预变性95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s，72℃ 31s，40个循环，溶解曲线的生成：95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s。

结果显示，5个转化株的ilvD基因的转录水平均比野生型藻株CCAP1055/1高，荧光定量PCR结果如图3所示。

实施例3

工程藻株含油量测定和生长测定

将以上5个过表达ilvD基因的藻株及野生型三角褐指藻CCAP1055/1分别接种至400mL人工海水培养基中，每个藻株设置3个平行，在单侧光照为60-80μE·m^-2·s^-1条件下通空气培养至第17天到达平台期分别收集，冷冻干燥，称取约100mg藻粉提取总脂,按每100mg干藻粉加入4mL氯仿/甲醇(1:1)的比例，再按1mL的比例加入H₂O，振荡混匀后,3000rpm离心5-10min使溶液分层,将下层氯仿相转移到另一容器中通氮气挥发氯仿，得到总油脂，称重，计算各工程藻株总脂占细胞干重的百分比。再利用总脂在薄层层析板上分离纯化甘油三酯，称取30mg总脂，用100μL的氯仿溶解，在硅胶薄层层析板(Slica gel60F254,Merk KgaA Darmstadt,German)的一端约0.5cm处沿直线上样，至样品全部用完。在点样线的旁边以0.02mg三油酸甘油酯(triolein，sigma)标准品作为参照。展层剂体系为正己烷:乙醚:乙酸混合溶液(体积比为85:15:1)，将上样后的层析板放入层析缸，平衡15min后进行层析，展层后取出层析板，置于通风橱中并等待层析板上的展层剂挥发干，用玻璃刀在三油酸甘油酯点样的那一侧割下一条带有一小段样品的硅胶板，将这一小条硅胶板放在加有一定量的固体碘的显色缸中加热显色后，将小块硅胶板重新拼回去，指示出样品展层后甘油三酯所在的位置。用小刀刮取该位置的全部硅胶粉，硅胶粉转移至15mL的玻璃离心管中，加入4mL的氯仿萃取硅胶粉中的甘油三酯，震荡2min，静置30min后，2000rpm离心10min，上层有机相经塞有棉花的玻璃管过滤，用已知重量的称量瓶接收有机相，重复氯仿萃取步骤三次，用氮气吹干有机相，称重含甘油三酯的称量瓶减掉瓶重，计算甘油三酯的含量及甘油三酯占细胞干重的百分比，结果见图4和图5。野生型藻株CCAP1055/1的总脂含量为43.08％±0.656％，工程藻株pHB5370-1、pHB5370-16、pHB5370-17、pHB5370-21和pHB5370-22的总脂含量分别是48.00％±2.05％、45.36％±1.39％、48.38％±2.00％、47.41％±2.04％、51.15％±0.92％，其中pHB5370-1、pHB5370-17、pHB5370-21的总脂含量显著高于野生型藻株CCAP1055/1(P<0.05)，pHB5370-22总脂含量显著高于野生型藻株CCAP1055/1(P<0.01)。野生型藻株CCAP1055/1的甘油三酯含量为26.36％±0.86％，转化株pHB5370-1、pHB5370-16、pHB5370-17、pHB5370-21、pHB5370-22的甘油三酯含量分别是31.28％±2.70％、29.72％±1.52％、30.18％±0.32％、29.68％±1.25％、31.75％±1.55％，均显著高于野生型藻株CCAP1055/1(P<0.05)。证明过表达二羟酸脱水酶基因可以提高三角褐指藻的总脂和甘油三酯的含量。

分别取上述5个ilvD基因过表达株和野生型藻株CCAP1055/1接种培养，每个藻株设三个平行，接种起始OD₇₅₀值为0.012，置于光照培养箱中，在温度为20℃，单侧光强为 60-80μE·m^-2·s^-1连续光照条件下通空气培养，隔一天测定OD₇₅₀值，培养至15天，测量了7次，绘制生长曲线。结果如图6所示，5个过表达株的生长有3个比野生型藻株CCAP1055/1略高，两个与野生型藻株CCAP1055/1几乎没有差别，因此，基因的过表达并未削弱工程藻株的生长。

虽然本发明已作了详细描述，但对本领域技术人员来说，在本发明精神和范围内的修改将是显而易见的。应当理解的是，本发明记载的各方面、不同具体实施方式的各部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部分互换。在上述的各个具体实施方式中，那些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当地与其它实施方式组合，这是将由本领域技术人员所能理解的。此外，本领域技术人员将会理解，前面的描述仅是示例的方式，并不旨在限制本发明。

Claims (9)

1.一种三角褐指藻的工程藻株，其特征在于，所述工程藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平高于其相对应的野生型藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平；

所述工程藻株中含有通过基因重组方式而获得的二羟酸脱水酶基因的表达盒，且所述二羟酸脱水酶基因的表达盒克隆在质粒载体上；

所述工程藻株还含有通过基因重组方式获得的标记基因的表达盒，且所述标记基因的表达盒中包括依次的启动子序列、所述标记基因的序列和终止子序列；依照启动子序列、标记基因的序列和终止子序列的连接顺序将此三个元件克隆到所述的二羟酸脱水酶基因的表达盒所在的质粒载体上，获得标记基因的表达盒；且所述标记基因的表达盒与所述二羟酸脱水酶基因的表达盒相邻；

所述二羟酸脱水酶基因的DNA序列如SEQ ID NO:15所示。

2.根据权利要求1所述的工程藻株，其特征在于，所述工程藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平为其相对应的野生型藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平的2倍以上。

3.根据权利要求2所述的工程藻株，其特征在于，所述工程藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平为其相对应的野生型藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平的2-50倍。

4.根据权利要求1所述的工程藻株，其特征在于，所述工程藻株的生长速率大于或等于其相对应的野生型藻株的生长速率。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的工程藻株，其特征在于，所述二羟酸脱水酶基因的表达盒中包括依次序的启动子序列、所述二羟酸脱水酶基因的序列和终止子序列。

6.根据权利要求1所述的工程藻株，其特征在于，含有所述二羟酸脱水酶基因的表达盒和所述标记基因的表达盒的所述工程藻株选自保藏于中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC NO:M2014341的三角褐指藻pHB5370-22。

7.一种根据权利要求5所述的工程藻株的制备方法，包括如下步骤：

1)依照启动子、二羟酸脱水酶的基因、终止子的连接顺序将此三个元件克隆到基因载体上，获得二羟酸脱水酶基因的表达盒；

2)将所述步骤1)获得的二羟酸脱水酶基因的表达盒转化到三角褐指藻中，获得重组子，并对重组子进行DNA鉴定，获得阳性的工程藻株；

3)比较所述工程藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平与其相对应的野生型藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平；

4)比较所述工程藻株与其相对应的野生型藻株的产油量。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)依照启动子、二羟酸脱水酶的基因、终止子的连接顺序将此三个元件克隆到基因载体上，获得二羟酸脱水酶基因的表达盒；

2)将所述步骤1)获得的二羟酸脱水酶基因的表达盒转化到三角褐指藻中，获得重组子，并对重组子进行DNA鉴定，获得阳性的工程藻株；

3)比较所述工程藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平与其相对应的野生型藻株中的二羟酸脱水酶基因的mRNA水平，以及比较所述工程藻株与其相对应的野生型藻株的生长速率；

4)比较所述工程藻株与其相对应的野生型藻株的产油量。

9.根据权利要求1所述工程藻株或权利要求8所述的方法制备的工程藻株在三角褐指藻产油中的应用。