CN105326840B

CN105326840B - 一种含有青蒿素的联合用药物

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Publication number: CN105326840B
Application number: CN201410321212.XA
Authority: CN
Inventors: 宋健平; 袁捷; 邓长生; 郑绍琴; 陈颖; 黄博; 高岩; 徐勤; 周玖瑶; 王振华; 关业枝
Original assignee: Science & Technology Industry Garden Co Ltd Guangzhou Traditional Chinese Medic
Current assignee: Science & Technology Industry Garden Co Ltd Guangzhou Traditional Chinese Medic
Priority date: 2014-07-07
Filing date: 2014-07-07
Publication date: 2018-10-30
Anticipated expiration: 2034-07-07
Also published as: CN105326840A

Abstract

本发明提供一种联合用药物，含有第一活性成分青蒿素，和第二活性成分硫酸羟基氯喹，以及任选的药学可接受的辅料。该联合用药物可以更有效地用于治疗疟疾，并且可以减少药物毒性和延缓抗药性的产生。

Description

一种含有青蒿素的联合用药物

技术领域

本发明涉及一种含有青蒿素的联合用药物，该联合用药物的活性成分为青蒿素和羟基氯喹，该联合用药物可以用于治疗疟疾。

背景技术

疟疾是热带、亚热带主要的传染病。据世界卫生组织(WHO)报告，全球每年疟疾患病人数达3亿-5亿人，因疟疾而死亡的人数至少60万，其中80％为儿童。疟疾不仅是发展中国家严重的卫生问题，而且是阻碍经济发展、社会进步的社会问题。抗药性恶性疟原虫株的出现及其全球蔓延态势，加大了疟疾防治的难度，使全球疟疾防治的形势日益严峻。恶性疟原虫对药物产生抗性，可导致一个抗疟新药在上市10年左右由于疗效下降而失去其应用价值，而一个新药研制的周期却往往需要10-15年。

青蒿素(Artemisinin，ART)及复发制剂是目前临床上治疗恶性疟最有效的抗疟药，其优点是速效、高效、低毒。青蒿素通过复发配伍能延续抗药性的产生。鉴于当前防治抗药性恶性疟严峻的形势，WHO于2001年要求，今后开发的抗疟药应使用复方，而复方中都应含有青蒿素类药。

目前，已进入市场的青蒿素类复方有：青蒿素哌喹复方、青蒿素蒿甲醚复方、双氢青蒿素磷酸哌喹复方、青蒿琥酯阿莫地喹复方、青蒿琥酯磺胺多辛-乙胺嘧啶复方和蒿甲醚本芴醇复方等。蒿甲醚苯芴醇复方由于苯芴醇存在脂溶性的问题，导致疟疾流行区病人服药后吸收不足，在柬泰边境恶性疟治愈率不足80％。与青蒿素类药配伍的药物如阿莫地喹、磷酸哌喹和磺胺多辛-乙胺嘧啶，均广泛用于疟疾治疗，并产生了抗药性。所以，选择一种没有广泛使用而且没有抗性的抗疟药，与青蒿素类药配伍形成新的有效青蒿素复方，具有广阔的运用前景。

硫酸羟基氯喹(Hydroxychloroquine Sulfate，HCQ)是氯喹的衍生物，同属于4-氨基喹啉类药物，氯喹在临床上由于抗药性严重其应用受到了限制，硫酸羟基氯喹是作为类风湿性关节的首选药物，临床上很少有应用在抗疟药上。目前还没有发现硫酸羟基氯喹与青蒿素能够联合应用，特别是在抗疟疾和治疗自身免疫性疾病方面的应用。

提供一个疗效好、毒副作用小、性能稳定、成本价格相对低廉，并且符合WHO抗疟药指南的青蒿素类新复方，对于全球疟疾防治具有重要意义。

发明内容

本申请的发明人令人惊讶地发现青蒿素与羟基氯喹联合应用，能够起到协同作用，大大提高治疗疟疾的效果，降低羟基氯喹的毒副作用，同时能够延缓单药的抗药性问题。因此，本发明主要涉及以下几个方面。

本发明的第一方面涉及一种联合用药物，含有第一活性成分青蒿素，和第二活性成分硫酸羟基氯喹，以及任选的药学可接受的辅料。

根据本发明第一方面任一项所述的联合用药物，其中第一活性成分与第二活性成分的重量比为0.01～99.99﹕1。

根据本发明第一方面任一项所述的联合用药物，其中第一活性成分与第二活性成分的重量比为1～27﹕1。

根据本发明第一方面任一项所述的联合用药物，其中第一活性成分和第二活性成分在同一种制剂单元中，或者第一活性成分和第二活性成分分别在不同的规格制剂单元中。

根据本发明第一方面任一项所述的联合用药物，其中第一活性成分和第二活性成分同时、分别或者依次给药。

本发明的第二方面涉及本发明第一方面任一项所述的联合用药物在制备用于治疗疟疾的药物中的用途。

本发明的第三方面涉及第一活性成分青蒿素和第二活性成分硫酸羟基氯喹联合用于制备用于治疗疟疾的药物中的用途。

本发明的第四方面涉及一种用于治疗疟疾的方法，该方法是将第一活性成分青蒿素和第二活性成分硫酸羟基氯喹联合施用到需要治疗的个体中，或者是本发明第一方面任一项所述的联合用药物施用到需要治疗的个体中。其中第一活性成分和第二活性成分可以同时施用到需要治疗的个体中，也可以分别施用到需要治疗的个体中，还可以依次施用到需要治疗的个体中，例如先施用第一活性成分，间隔一定时间再施用第二活性成分；也可以先施用第二活性成分，间隔一定时间再施用第一活性成分。

本发明中，所述的疟疾为恶性疟、间日疟、三日疟或卵形疟。

发明的有益效果

本发明的联合用药物中，第一活性成分青蒿素与第二活性成分硫酸羟基氯喹二者连用能够起到协同增效作用，能够显著提高治疗疟疾的效果，降低羟基氯喹的毒副作用，同时能够延缓单药的抗药性问题。

附图说明

图1青蒿素和硫酸羟基氯喹复方配伍协同增效作用图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实验例1青蒿素和硫酸羟基氯喹(以下简称AH)复方配伍协同增效作用

1.材料

1.1供试品

1.1.1青蒿素(Artemisinin，ART，以下简称“A”)：四川同人泰药业有限公司，批号：130602，纯度98.8％；

1.1.2硫酸羟基氯喹(Hydroxychloroquine Sulfate，HCQ，以下简称“H”)：重庆康乐制药有限公司，批号：SQK-130403,纯度98.7％，碱基含量77.40％。

1.1.3磷酸哌喹：重庆康乐制药有限公司，批号：LPK-100302-M，LPK-111003。

1.2药物配制

使用BS210S电子天平(万分之一)称量，加入2～3滴吐温80于乳钵中充分研磨配成混悬液，再以蒸馏水稀释成试验设计所需浓度，每次用药均在给药前配制。使用时根据实验中两种活性成分的配比和给药剂量灌胃给药，小鼠每次灌胃给药体积为每20g小鼠体重0.4ml，给药浓度根据实际给药剂量配制。

1.3动物及分组

1.3.1试验动物：昆明远交系小白鼠(KM)，体重20±2g，鼠龄4～5周。每组4～10只，雌雄各半。合格证号：SCXK(粤)2013-0020，符合GB14922.0—2001试验动物SPF级。小鼠及饲料、垫料均购于广东省医学试验动物中心。小鼠自由进食及饮水。

1.3.2试验动物房：动物饲养室温度23±2℃，相对湿度70±10％。日通气4次，每次1小时，日照明12小时。

1.4鼠疟原虫

1.4.1伯氏疟原虫(Plasmodium berghei)K₁₇₃株，1998年3月引自美国国立卫生研究院。以液氮冻存或小鼠血传保种。

1.4.2伯氏疟原虫抗青蒿素(RART/K₁₇₃)，引自英国伦敦卫生与热带医学院Peters试验室。以液氮冻存或小鼠血传保种。1997年4月引自美国NIH。

1.4.3伯氏疟原虫抗哌喹株(RPQ/K₁₇₃)，引自英国伦敦卫生与热带医学院Peters试验室。以液氮冻存或小鼠血传保种。

1.4.4原虫接种：取感染4～5天的供血鼠混合血，0.5％肝素抗凝。按红细胞常规计数方法，计数红细胞数/mm³及红细胞原虫寄生率。计算出每0.1毫升全血中含被寄生的红细胞数，再以生理盐水稀释成每0.2ml中含10⁷个被原虫寄生的红细胞。每只小鼠腹腔接种0.2ml。

2.试验方法

抑制性试验

采用Peters“4天抑制试验”法。即接种原虫日为D₀，次日为D₁，依此类推。具体方法是接种原虫1h后开始给药，D₀～D₃连续给药4天，每天1次。给药剂量见表1至表7，其中MKD表示mg/kg/天。D₄每组动物定量取血混合后涂制薄血膜，甲醇固定，Giemsa染色，镜检疟原虫。按50个视野未发现原虫者为阴性；红细胞原虫寄生率<0.2％，计数1万个红细胞；<10％计数1000个红细胞；>10％计数500个红细胞的标准计数。按下式计算原虫被抑制率，并用直线回归法(y＝a+bx)求出ED₅₀和ED₉₀，以此判断药物对疟原虫的抑制作用。AH复方不同配比及单药的ED₅₀和ED₉₀测定结果见表1至表7。

采用Peters正交设计试验方法。测得青蒿素(以下简称“A”)和羟基氯喹(以下简称“H”)单药及系列不同配比的ED₅₀，并用Berenbaum法计算增效系数。计算公式：Ac/Ae+Hc/He，式中Ae和He表示组方单药的ED₅₀；Ac和Hc表示复方中组分药的ED₅₀量。增效系数提示的意义为：增效系数<1为增效作用；＝1为相加作用；>1为拮抗作用。并以A的剂量为横坐标，以H的剂量为纵坐标建立“复方正交试验坐标图”。以分别测得的A和H的ED₅₀，将横坐标上的A点和纵坐标上的H点连接，直线AH即为复方AH的“等效线”，等效线AH上的点代表了复方配伍为“相加”作用的情况下所有复方配伍的系列比例(A从0％～100％，H从100％～0％)。另外再分别求得A和H两药ED₅₀的95％可信限，在坐标上用虚线连接，复方配伍作用类型统计学上的意义为：以抑制性试验测出各剂量系列的ED₅₀如果落在两条虚线之间区域则判为“相加”作用，如果落在区域下方则判为“增效(协同)”作用，如果落在区域上方则判为“拮抗”作用(如图1所示)。以此标准来判定两药组方的作用类型。

AH复方正交试验不同配比的设计：在等效线AH上平均取四个点，其对应的复方配伍比例分别为：A:H＝1.7:1、4.4:1、10:1、27:1，结合临床用药的实践经验，再增加一个1:1的配比，共5种不同的配比。

表1青蒿素对伯氏疟原虫K-173株的4天抑制试验(ED_50/90检测)

回归方程：Y＝2.8253+2.2460X (r＝0.9622)

ED₅₀＝9.30MKD×4

ED₉₀＝34.58MKD×4

表2 硫酸羟氯喹对伯氏疟原虫K-173株的4天抑制试验(ED_50/90检测)

回归方程：Y＝4.5617+2.9817X(r＝0.9216)

ED₅₀＝1.40MKD×4

ED₉₀＝3.77MKD×4

表3 AH复方(1:1)对伯氏疟原虫K-173株的4天抑制试验(ED_50/90检测)

回归方程：Y＝4.5538+2.0561X (r＝0.9143)

ED₅₀＝1.65MKD×4

ED₉₀＝6.92MKD×4

表4 AH复方(1.7:1)对伯氏疟原虫K-173株的4天抑制试验(ED_50/90检测)

回归方程：Y＝4.9920+1.0248X (r＝0.8971)

ED₅₀＝1.02MKD×4

ED₉₀＝18.13MKD×4

表5 AH复方(4.4:1)对伯氏疟原虫K-173株的4天抑制试验(ED^50/90检测)

回归方程：Y＝4.7289+1.0172X (r＝0.9623)

ED₅₀＝1.85MKD×4

ED₉₀＝33.61MKD×4

表6 AH复方(10:1)对伯氏疟原虫K-173株的4天抑制试验(ED_50/90检测)

回归方程：Y＝4.4339+1.2706X (r＝0.9346)

ED₅₀＝2.79MKD×4

ED₉₀＝28.46MKD×4

表7 AH复方(27:1)对伯氏疟原虫K-173株的4天抑制试验(ED_50/90检测)

回归方程：Y＝4.2035+1.2109X (r＝0.8306)

ED₅₀＝4.55MKD×4

ED₉₀＝52.02MKD×4

3.试验结果

各复方配伍及单药的ED₅₀和ED₉₀的数据源和回归方程见表1至表7，AH复方配伍的增效系数见表8

表8 AH复方配伍的增效系数

根据表8结果可见，A单药的ED₅₀为9.30MKD×4，H单药的ED₅₀为1.40MKD×4，AH复方按照1:1、1.7:1、4.4:1、10:1和27:1的比例测出各自的ED₅₀并计算增效系数为0.682、0.340、0.405、0.452和0.586，均小于1，显示AH复方配伍具有协同增效作用。

图1结果显示：测得5个复方配比的ED₅₀值在正交试验坐标图上，均落在AH等效线95％可信区间下限的下方区域，因此可以得出结论：AH复方配伍对鼠疟K-173株的4天抑制性试验具有显著的增效作用。

实验例2.AH复方配伍的抗药性研究

测定AH复方对青蒿素抗性株以及哌喹抗性株的4天抑制性疗效，评价AH复方对青蒿素有无抗药性，对哌喹有无交叉抗药性。

1.材料

同实验例1

2.试验方法

采用4天抑制性试验方法分别测出AH复方的ED_50/90，并与敏感株的ED_50/90相比较，求出抗性指数I_50/90，以I_50/90判断交叉抗药性的程度(I_50/90＝抗性株的ED_50/90/敏感株ED_50/90)。其标准是I₉₀≤2为敏感；I₉₀＝2～10为轻度抗性交叉；I₉₀＝10～100为中度抗性交叉；I₉₀＞100为重度抗性交叉。

3.试验结果

青蒿素单药及AH复方对抗青蒿素株的ED₅₀数据源和回归方程、磷酸哌喹单药及AH复方对抗哌喹株的ED₅₀数据源和回归方程见表9至表13，AH复方在抗青蒿素株上抗性指数I_50/90结果见表14，AH复方在鼠疟抗哌喹株上抗性指数I_50/90结果见表15。

表9 青蒿素对抗青蒿素株第50代的ED_50/90检测定

回归方程：Y＝2.9752+1.3702X (r＝0.9991)

ED₅₀＝30.04MKD×4

ED₉₀＝258.84MKD×4

表10 AH复方(3:2)对抗青蒿素株第50代ED_50/90测定

回归方程：Y＝4.3127+2.4265X (r＝0.8916)

ED₅₀＝1.92MKD×4

ED₉₀＝6.48MKD×4

表11 磷酸哌喹对伯氏疟原虫K-173株的4天抑制试验结果

备注：磷酸哌喹对伯氏疟原虫K-173株的ED₅₀、ED₉₀为三个试验所得结果的平均值。

表12 磷酸哌喹对其抗性系培育第40代抗性测定结果

表13 AH复方(3:2)对磷酸哌喹抗性株第40代的ED_50/90测定

回归方程：Y＝3.9399+2.2449X (r＝0.9960)

ED₅₀＝2.97MDK×4

ED₉₀＝11.04MDK×4

表14 AH复方在抗青蒿素株上抗性指数I_50/90结果

由表14结果可见：单用青蒿素在抗青蒿素株上的I_50/90为3.23～7.49，具有轻度抗药性，而AH复方在抗青蒿素株上的I_50/90为0.36～1.88，表现出为敏感，不具有任何抗药性。说明该AH复方中虽然含有2/3的青蒿素成份，但通过复方配伍，在青蒿素的抗性株上依然未表现出任何抗药性，显示了AH复方配伍具有延缓和克服抗药性的优势。

表15 AH复方在鼠疟抗哌喹株上抗性指数I_50/90结果

由表15结果可见：磷酸哌喹抗哌喹株的抗性指数I_50/90为5.71～34.14，表现为中度抗药性，而AH复方在哌喹株上的抗性指数I_50/90为0.61～2.91，表现为敏感，由于硫酸羟基氯喹与磷酸哌喹都同属于“4-氨基喹啉类药物”，说明AH复方配伍对4-氨基喹啉类药物同样不存在交叉抗药性。

实验例3 AH复方配伍减毒作用研究

通过测定1:1配伍的AH复方及其各组分单药A和H的小鼠LD₅₀，计算复方配伍的毒性联合作用系数Q，为评价AH复方配伍减毒作用提供理论和实验依据。

以Bliss法计算各药的LD₅₀，用Finney公式计算复方配伍(混合毒物)的联合作用系数：Q＝复方LD₅₀理论值/复方LD₅₀实测值，若小于1则为减毒；大于1为增毒；等于1为相加。联合作用系数计算结果见表16。

(式中a、h分别为A药和H药在复方中比例，即各占50％)

表16 AH复方及其组分LD₅₀和联合作用系数结果

注：表16中的LD₅₀的数据的获得见附件1-3。

由表16结果可知，AH复方的LD₅₀为5022.5mg/kg，组分H的LD₅₀为2156.2mg/kg，A测得最大耐受量为18000mg/kg，因此可以认为A药的LD₅₀为>18000mg/kg。通过Finney公式计算AH复方LD₅₀的理论值为3852.1～4314.1，药物毒性联合作用系数Q值为0.767～0.859<1，说明AH复方配伍具有减毒作用。

附件1青蒿素急性毒性试验

观察研究昆明种(KM)小鼠24h内3次灌胃给予青蒿素，在一定时间内所产生的毒性反应，了解其急性毒性作用剂量。

1.材料

同实验例1。

2.实验方法

按预试验结果，急性毒性试验采取最大给药量方法。KM小鼠按性别及体重分层，随机分为2组[给药组(18.0g青蒿素/kg)和溶媒组(纯净水)]，每组20只，♀♂各10只，各组均按40mL/kg体重灌胃给药3次，两次给药间隔4小时；每次灌胃给药后连续4小时观察小鼠出现的症状及症状起始的时间等情况。药后连续观察14天，每天上下午各1次，观察小鼠外观、行为、精神、对刺激的反应、分泌物、排泄物等。所有小鼠均进行大体解剖，肉眼观察其器官体积、颜色、质地的改变(若任何器官出现体积、颜色、质地等改变时，均进行组织病理学检查)；在D₀、D₁、D₇、D₁₄测量体重，在D_0～1、D_6～7、D_13～14测量摄食量；并计算最大给药量。

3.实验结果

一般临床观察：给药组20只小鼠(♀♂各10只)每次给药后，鼻孔无明显阻塞，未见竖毛现象；未见异常分泌物及排泄物，眼睑未见异常表现，体温正常，皮肤未见水肿和红斑。给药组小鼠给药后症状主要表现为少动、呼吸急促，一般出现在每次灌胃后1min～3min，症状持续时间1min～3min；分析原因可能与小鼠灌服高浓度高体积的药液有关。溶媒组20只小鼠(♀♂各10只)由试验开始至第3次灌胃给药后4小时未见明显异常症状。从D₁～D₁₄每天上下午各观察1次，在此期间，小鼠精神状态较好，外观未见异常表现，行为活动正常，未见异常分泌物及排泄物，至试验结束时无小鼠死亡。

体重：给药组雌性小鼠、雄性小鼠在D₀、D₁、D₇、D₁₄与溶媒组比较，差异无显著性(P＞0.05)；

摄食量：给药组雌性小鼠、雄性小鼠在D_0～1、D_6～7、D_13～14与溶媒组比较，差异无显著性(P＞0.05)；

病理学检查：给药组与溶媒组小鼠在观察期结束时按计划处死，大体解剖肉眼观察其体表完整、被毛柔顺、无外伤及破溃等；皮下无出血点及色素沉着等；腹腔、胸腔无积水，脏器位置正常；各器官的体积、颜色及质地等均未发现明显病变及异常。

4.结论

在本实验条件下，对KM小鼠24h内3次灌胃给予青蒿素，给药浓度为150mg青蒿素/mL，给药容积为40mL/kg，两次给药间隔4h，每次给药后连续观察4小时；给药组小鼠药后少动、呼吸急促症状，判断可能是小鼠灌服高浓度高体积的药液所致。连续观察14天，在此期间，小鼠精神状态较好，外观未见异常表现，行为活动正常，未见异常分泌物及排泄物，至试验结束时无小鼠死亡。青蒿素对小鼠体重、摄食量无明显影响。给药组小鼠观察期结束时按计划处死，大体解剖肉眼观察各器官的体积、颜色及质地等均未发现明显病变及异常。青蒿素对KM小鼠最大给药量为18.0g青蒿素/kg，为临床人拟用剂量的4320倍。

附件2硫酸羟基氯喹急性毒性试验

观察研究KM小鼠1次灌胃给予硫酸羟基氯喹，在一定时间内所产生的毒性反应，了解其急性毒性作用剂量。

1.材料

同实验例1。

2.实验方法

按预试验的D_m(100％死亡的最大剂量)和D_n(0％死亡的最小剂量)结果，D_m取4000mg/kg，D_n取1500mg/kg，组间距为1﹕0.78，将KM小鼠随机分为5个给药组[4000mg/kg、3120mg/kg、2434mg/kg、1898mg/kg、1481mg/kg]和1个溶媒对照组(纯净水)，每组10只，♀♂各5只。各组均按10mL/kg体重灌胃给药1次；药后连续6小时观察小鼠出现的症状、症状起始的时间、持续时间、死亡时间、濒死前反应等情况。药后连续观察14天，每天上下午各1次，观察小鼠外观、行为、精神、对刺激的反应、分泌物、排泄物等。所有小鼠均进行大体解剖，肉眼观察其器官体积、颜色、质地的改变(若任何器官出现体积、颜色、质地等改变时，均进行组织病理学检查)。在D₀、D₁、D₇、D₁₄测量体重。用Bliss法计算半数致死量(LD₅₀)及其95％可信限。

3.实验结果

一般临床观察：给药组小鼠灌胃给予各剂量硫酸羟基氯喹，给药后出现活动减少、抽搐、呼吸困难等毒性症状。60％小鼠死亡发生在药后1h内，存活小鼠大部分出现毒性症状后逐渐恢复正常。给药剂量越大，中毒症状出现的时间越早，小鼠死亡数越多。溶媒对照组(纯净水)：10只小鼠(♀♂各5只)由试验开始至给药后6小时未见明显异常症状；至试验结束未见小鼠死亡。连续观察14天，每天上下午各1次；在此期间，存活小鼠精神状态较好，外观未见异常表现，行为活动正常，未见异常分泌物及排泄物。

体重：2434mg/kg组雄鼠在D₁、D₇较溶媒对照组体重降低，1898mg/kg组雌鼠在D₁较溶媒对照组体重降低，1481mg/kg组雌鼠、雄鼠在D₁较溶媒对照组体重降低，差异有统计学意义(P＜0.05)；其它剂量组雌性、雄性小鼠在D₀、D₁、D₇、D₁₄与溶媒对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

病理学检查：对观察期内死亡小鼠及观察期结束时按计划处死的小鼠进行大体剖检，肉眼观察其体表完整、被毛柔顺，无外伤及破溃等；皮下无出血点及色素沉着等；腹腔胸腔无积水、脏器位置正常；各器官的体积、颜色及质地等均未发现明显病变及异常。

硫酸羟基氯喹对KM小鼠灌胃给药急性毒性试验死亡时间和死亡情况见表17。

表17 硫酸羟基氯喹对KM小鼠灌胃给药急性毒性试验死亡时间和死亡情况

硫酸羟基氯喹对KM小鼠灌胃给药急性毒性试验LD₅₀的计算如下表18所示。

表18硫酸羟基氯喹对KM小鼠灌胃给药急性毒性试验LD₅₀的计算

计算结果 (本底死亡率为:0％)

注:g值＝0.214 g>0.1,不可忽略应作Feiller校正

异质性的全面校正

注:χ2值＝3.676 P值＝0.299 不必作异质性校正

根据表17和表18结果计算LD₅₀：硫酸羟基氯喹半数致死量LD₅₀＝2156.178mg/kg，95％可信限＝(1895.476～2452.736)mg/kg。

4.结果讨论

给药组小鼠中毒症状一般表现在药后6小时内，在此期间，给药组小鼠不进食或少进食，而溶媒对照组小鼠在此期间则正常进食，故给药组小鼠在D₁与溶媒对照组比较体重降低，2434mg/kg组雄鼠体重在D₇天仍降低，其它剂量组小鼠体重D₇、D₁₄未见异常。由于动物数较少，且只有个别给药组表现出体重与溶媒对照组比较有显著性差异，故不能认为对硫酸羟基氯喹KM小鼠体重有明显影响。

5.结论

在本实验条件下，硫酸羟基氯喹对KM小鼠24小时内1次灌胃给药，给药后出现少动、抽搐、呼吸困难等毒性症状，病理学检查结果显示未见异常。硫酸羟基氯喹半数致死量LD₅₀＝2156.178mg/kg，95％可信限＝(1895.476～2452.736)mg/kg。

附件3青蒿素硫酸羟基氯喹(AH复方1﹕1)小鼠急性毒性试验

观察研究KM小鼠1次灌胃给予青蒿素硫酸羟基氯喹(AH复方1﹕1)，在一定时间内所产生的毒性反应，了解其急性毒性作用剂量。

1.材料

同实验例1。

2.实验方法

按预试验的D_m(100％死亡的最大剂量)和D_n(0％死亡的最小剂量)结果，D_m取8000mg/kg，D_n取4000mg/kg，组间距为1﹕0.84，将KM小鼠随机分为5个给药组[8000mg/kg、6720mg/kg、5645mg/kg、4742mg/kg、3983mg/kg]和1个溶媒对照组(纯净水)，每组10只，♀♂各5只。各组均按20mL/kg体重灌胃给药1次；药后连续6小时观察小鼠出现的症状、症状起始的时间、持续时间、死亡时间、濒死前反应等情况。药后连续观察14天，每天上下午各1次，观察小鼠外观、行为、精神、对刺激的反应、分泌物、排泄物等。所有小鼠均进行大体解剖，肉眼观察其器官体积、颜色、质地的改变(若任何器官出现体积、颜色、质地等改变时，均进行组织病理学检查)。在D₀、D₁、D₇、D₁₄测量体重。用Bliss法计算半数致死量(LD₅₀)及其95％可信限。

3.实验结果

一般临床观察：给药组小鼠灌胃给予各剂量青蒿素硫酸羟基氯喹，给药后出现活动减少、抽搐、呼吸困难等毒性症状。64％小鼠死亡发生在药后1小时内，存活小鼠大部分出现毒性症状后逐渐恢复正常。给药剂量越大，中毒症状出现的时间越早，小鼠死亡数越多。溶媒对照组(纯净水)：10只小鼠(♀♂各5只)由试验开始至给药后6h未见明显异常症状；至试验结束未见小鼠死亡。连续观察14天，每天上下午各1次；在此期间，存活小鼠精神状态较好，外观未见异常表现，行为活动正常，未见异常分泌物及排泄物。

体重：各剂量组雌性、雄性小鼠在D₀、D₁、D₇、D₁₄与溶媒对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

青蒿素硫酸羟基氯喹(AH复方1﹕1)对KM小鼠灌胃给药急性毒性试验死亡时间和死亡情况见表19。

表19 AH复方对小鼠灌胃给药急性毒性试验死亡时间和死亡情况

青蒿素硫酸羟基氯喹(AH复方1﹕1)对小鼠灌胃给药急性毒性试验LD₅₀的计算如表20所示。

表20AH复方对小鼠灌胃给药急性毒性试验LD₅₀的计算

计算结果 (本底死亡率为:0％)

注:g值＝0.226 g>0.1,不可忽略应作Feiller校正

异质性的全面校正

注:χ2值＝2.695 P值＝0.441 不必作异质性校正

由表19、表20结果计算LD₅₀：青蒿素硫酸羟基氯喹(AH复方)半数致死量LD₅₀＝5022.517mg/kg，95％可信限＝(4633.736～5443.917)mg/kg。

4.实验结论

在本实验条件下，青蒿素硫酸羟基氯喹对KM小鼠24h内1次灌胃给药，给药后出现活动减少、抽搐、呼吸困难等毒性症状，病理学检查结果显示未见异常。青蒿素硫酸羟基氯喹半数致死量LD₅₀＝5022.517mg/kg，95％可信限＝(4633.736～5443.917)mg/kg。

Claims

1.一种联合用药物，含有第一活性成分青蒿素，和第二活性成分硫酸羟基氯喹，以及任选的药学可接受的辅料，其中第一活性成分与第二活性成分的重量比为1～27﹕1，所述联合用药物用于治疗疟疾。

2.权利要求1的联合用药物，其中所述的疟疾为恶性疟、间日疟、三日疟或卵形疟。

3.权利要求1的联合用药物，其中第一活性成分和第二活性成分在同一种制剂单元中，或者第一活性成分和第二活性成分分别在不同的规格制剂单元中。

4.权利要求1的联合用药物，其中第一活性成分和第二活性成分同时、分别或者依次给药。

5.权利要求1-4任一项所述的联合用药物在制备用于治疗疟疾的药物中的用途。

6.第一活性成分青蒿素和第二活性成分硫酸羟基氯喹联合用于制备用于治疗疟疾的药物中的用途，其中第一活性成分与第二活性成分的重量比为1～27﹕1。

7.权利要求5或6的用途，其中所述的疟疾为恶性疟、间日疟、三日疟或卵形疟。