CN105316267A

CN105316267A - 一种全食副球菌菌株及其应用

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Publication number: CN105316267A
Application number: CN201510896873.XA
Authority: CN
Inventors: 孙磊; 刘存歧; 宋彤彤; 王靖飞; 吴亦红
Original assignee: Hebei University
Current assignee: Hebei University
Priority date: 2015-12-08
Filing date: 2015-12-08
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2035-12-08
Also published as: CN105316267B

Abstract

本发明公开了一种全食副球菌菌株，所述菌株保藏名称是全食副球菌(<i>Paracoccus</i><i>？pantotrophus</i>)B21-3，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2015年10月9日，保藏编号为CGMCC？NO.11474；同时公开了所述的全食副球菌菌株在降解吡啶中的应用；还公开了一种降解废水中吡啶的方法，将全食副球菌B21-3的种子液加入到含有吡啶的废水中，于pH值为6-8、20-42℃的条件下静置或振荡降解2-4天，即可高效降解废水中的吡啶。本发明提供的菌株生长速度快、长势好、稳定期长，同时在降解过程中对高浓度底物有较强耐受性，遗传稳定性好，降解率高；提供的降解废水中吡啶的方法操作简单，能够将废水中的吡啶高效分解掉，而且不会造成进一步的污染，适于大规模推广应用。

Description

一种全食副球菌菌株及其应用

技术领域

本发明涉及微生物及用途，具体地说是一种全食副球菌菌株及其在含吡啶废水治理中的应用。

背景技术

吡啶（Pyridine）是含有一个氮原子的六元杂环化合物，属难降解有机污染物；其分子式为C₅H₅N，易燃，有害。吡啶存在于煤焦油中，在化工行业常用作原料和溶剂。吡啶毒性大，吸入就能够对人体产生危害，还会对眼及上呼吸道产生刺激作用，严重时会麻醉中枢神经系统。

吡啶在医药和农药领域使用较为广泛，多用于制造维生素、抗组胺类药、除草剂及塑料等。吡啶是酰化反应的优良溶剂，还能够以络合物的形式催化一些氧化反应、聚合反应和羰基化的反应。随着吡啶需求量的增加，吡啶的排放量势必增长，含吡啶的废水如不经过任何处理而随意排放，不但会对环境造成严重污染，更会影响人类健康。目前，现有技术中对含吡啶的废水的处理主要采用物理化学法。如CN105000616A公开了一种废水中残余吡啶的去除方法，是采用气体吹脱方法将空气通入含吡啶废水中，使废水中的残余吡啶由液相转为气相，然后收集含吡啶气体用RTO焚烧炉焚烧。该方法利用吹脱法将空气通入废水中，改变有机物吡啶溶解于水中所建立的平衡关系，将水相中的吡啶转移到气相中，使吡啶盐转化为吡啶，收集吹脱出的含吡啶空气采用RTO焚烧炉焚烧处理，气相中的吡啶经焚烧后氧化成水、二氧化碳和二氧化氮排放于大气中。该方法去除效率较高，从根本上去除了废水中的吡啶，消除了环境污染；但是存在需要专门的焚烧设备、碳排量较高、处理过程能耗大、成本高、焚烧过程具有较大的安全隐患等弊端。可见，我们非常有必要探究更为安全、环保、实用的降解处理方法。与物理化学方法相比，生物降解法可实现无害化治理，具有处理量大，成本低，条件温和，不产生二次污染等特点，是目前应用最广、最有效的降解有害物质的处理方法，但是生物降解法的有效性往往取决于高效降解菌株，因此，从自然环境中筛选得到能够去除吡啶的有效菌种并将其应用于工业废水的处理中将具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种全食副球菌菌株，以期高效降解废水中含有的吡啶有害物质，为采用生物降解法治理含吡啶废水提供基础；本发明的目的之二是提供一种降解废水中吡啶的方法，以解决现有方法处理废水中的吡啶存在成本高、处理过程复杂以及存在安全隐患的问题。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种全食副球菌菌株，所述菌株保藏名称是全食副球菌(Paracoccuspantotrophus)B21-3，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年10月9日，保藏编号为CGMCCNO.11474；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明所述的全食副球菌B21-3的细胞形态为球形，菌落呈淡粉色，表面粘质，边缘整齐，易挑起；为革兰氏阴性细菌，其氧化酶和接触酶为阳性；甲基红和VP试验结果呈阴性。

本发明所述全食副球菌(Paracoccuspantotrophus)B21-3采用细菌16SrRNA基因通用引物27f和1492r对16SrRNA基因进行PCR扩增，扩增结果经北京宝锐通生物技术有限公司进行序列测定，其16SrRNA基因序列如SEQIDNO:1所示；测定结果提交GenBank数据库经Blast同源性比对，结果表明全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3的16SrRNA基因序列与全食副球菌（ParacoccuspantotrophusATCC35512^T）的同源性为99.49%。

本发明提供的全食副球菌(Paracoccuspantotrophus)B21-3将实验证明其能以吡啶为唯一碳源、氮源进行生长，并将其氧化为氨氮，由此完成了全食副球全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3在降解吡啶中的应用。

本发明提供的全食副球菌(Paracoccuspantotrophus)B21-3具有吡啶降解作用，其生长速度快、长势好、稳定期长，同时在降解过程中对高浓度底物有较强的耐受性，遗传稳定性好，降解率高。

本发明还提供了一种降解废水中吡啶的方法，将保藏名称为全食副球菌B21-3的种子液加入到含有吡啶的废水中，于pH值为6-8、20-42℃的条件下静置或振荡降解2-4天；所述全食副球菌(Paracoccuspantotrophus)B21-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年10月9日，保藏编号为CGMCCNO.11474；保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明所述的降解废水中吡啶的方法中使用的全食副球菌B21-3的种子液的菌种优选为全食副球菌B21-3经过浓度由100mg/L逐渐增大到1000mg/L的吡啶驯化后的菌种。

本发明更为优选的降解方式为振荡降解，振荡速率为180rpm。

本发明提供的降解废水中吡啶的方法中所述全食副球菌B21-3的种子液是将菌株全食副球菌B21-3或高浓度的吡啶驯化后的菌株全食副球菌B21-3接种于LB液体培养基，30℃，180r/min培养2d，将培养液在10000r/min转速下离心5min，弃去上清液，洗涤菌体2-3次，将菌体重悬于无机盐液体培养基中，即得种子液；特别地，当所述废水中吡啶的浓度优选为≤100mg/L，所述驯化后的全食副球菌B21-3的种子液每mL的悬浮液中的活性菌为10⁸个，其接种量为含吡啶废水重量的8-10%；在优选降解温度为25-32℃，更优选为32℃；优选pH值为7时，其菌株对吡啶的降解率可达90%以上。

本发明提供的降解废水中吡啶的方法，操作简单，不仅能够将废水中的吡啶高效分解掉，而且不会造成进一步的污染，有效解决了现有技术中处理废水中吡啶的需要专门的处理设备、成本高以及存在安全隐患的问题。

附图说明

图1为筛选的全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3的平板菌落图。

图2为筛选的全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3的革兰氏染色图。

图3为温度对全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3生长的影响。

图4为温度对全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3降解吡啶的影响。

图5为pH对全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3生长的影响。

图6为pH对全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3降解吡啶的影响。

图7为驯化和未驯化的全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3降解吡啶的结果。

图8为菌株连续传代15代对全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3降解吡啶的影响。

具体实施方式

下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1：全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3的筛选。

（1）培养基的配制

无机盐培养基的配制：先称取NaH₂PO₄1.42g、KH₂PO₄1.36g、MgSO₄·7H₂O0.216g、CaCl₂0.006g，混合，得无机盐混合物；按如下配方配制微量元素混合液：MnSO₄·H₂O1.69g/L，CoCl₂·6H₂O0.24g/L，H₃B₃O1.16g/L，Na₂MoO₄·2H₂O0.024g/L，FeSO₄·7H₂O2.78g/L，ZnSO₄·7H₂O1.15g/L，CuSO₄·5H₂O0.38g/L；吸取lmL微量元素混合液加入到无机盐混合物中，蒸馏水定容至1000mL，pH7.0-7.2，经有机滤膜(0.22μm)过滤除菌后即得无机盐培养基。

吡啶无机盐培养基的配制：在上述无机盐培养基加入吡啶，使培养基中吡啶含量为100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000mg/L，经有机滤膜(0.22μm)过滤除菌后即得吡啶无机盐培养基。

（2）菌株的分离：采集石家庄某污水处理厂曝气池的活性污泥10g，加入到100mL吡啶含量为100mg/L的吡啶无机盐培养基中，在30℃、180r/min培养5d后，吸取5mL的培养液，转接至相同浓度的吡啶无机盐培养基中，连续转接3次；用生理盐水将富集后的培养液进行梯度稀释，分别稀释至10^-4、10^-5、10^-6倍，充分震荡，再从每个浓度的稀释液中分别吸取200μL菌悬液，涂布于吡啶无机盐培养基中，每个浓度设置三个平行，在恒温生化培养箱中30℃培养，挑取颜色、大小不同的单菌落划线纯化，斜面保存；

（3）菌株的筛选：将分离纯化的菌株接种至吡啶无机盐培养基中，摇床180r/min，30℃震荡培养3d；吸取适量菌悬液于1.5mL离心管中，10000r/min离心8min，吸取上清，采用紫外分光光度法进行吡啶含量的定量测定，挑取吡啶降解率高于50%的菌株，即获得所述全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3。以未接种任何菌株的吡啶无机盐培养基为对照。

降解率计算公式为：降解率=[(对照吸光值-样品吸光值)/对照吸光值]×100%

实施例2全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3的鉴定

（1）菌株形态观察及革兰氏染色鉴定：

菌落及菌株观察：全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3在LB培养基30℃培养48h，观察其菌落呈淡粉色，表面粘质，边缘整齐，易挑起；细胞形态为球形，不产芽孢，无鞭毛。平板菌落图如图1所示。

（2）生理生化检测：

根据《常见细菌鉴定手册》中属、种鉴定的相关内容进行了氧化酶、接触酶测定，VP试验，甲基红试验。菌株对碳源的利用采用Biolog实验测定，采用HPLC法测定菌株基因组DNA的G+Cmol%。

经测定全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3为革兰氏染色阴性，革兰氏染色图见图2；氧化酶和接触酶为阳性；甲基红和VP试验结果呈阴性。

Biolog实验测定全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3可利用的单糖包括D-麦芽糖、D-海藻糖、蔗糖、D-松二糖、α-D-葡糖、D-甘露糖、D-果糖、D-半乳糖、D-果糖或L-果糖中的一种或几种；醇类物质包括D-山梨醇、D-阿拉伯醇、肌醇；可利用氨基酸的种类包括L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组胺、L-丝氨酸；已糖酸包括果胶、D-半乳糖醛酸、D-葡糖酸或奎宁酸中的一种或几种；羧酸及酯和脂肪酸包括丙酮酸甲酯、D-乳酸甲酯、L-乳酸、L-苹果酸、溴-丁二酸、γ-氨基-丁酸、β-羟基-D,L丁酸、乙酰乙酸、丙酸、乙酸或甲酸中一种或几种；且在pH值为6、质量百分比浓度为1-4%的NaCl的条件下，可进行生长。经测定G+Cmol%为69.2%。

（3）分子生物学鉴定：

检测得到的全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3的基因组DNA，采用细菌16SrRNA基因通用引物27f和1492r对DNA进行PCR扩增，扩增结果经北京宝锐通生物技术有限公司进行序列测定，测定结果提交GenBank数据库经Blast同源性比对，结果表明全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3的16SrRNA基因序列与全食副球菌（ParacoccuspantotrophusATCC35512^T）的同源性为99.49%。结合形态学及生理生化实验结果，将全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3鉴定为全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3。

实施例3全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3对吡啶的降解特性研究

（1）种子液的制备：将全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3接种于LB液体培养基，30℃，180r/min培养2d，将培养液在10000r/min转速下离心5min，弃去上清液，用已灭菌的所述无机盐培养基洗涤菌体2-3次以便除去LB培养基残余的组分，用所述无机盐培养基将洗涤后的菌体重悬，每mL的悬浮液中的活性菌为10⁸个，此菌悬液即为全食副球菌B21-3种子液。

（2）温度对全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3生长和吡啶降解率的影响：在吡啶浓度为100mg/L的吡啶无机盐培养基，以2%接种量接入全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3的种子液，每个实验组重复3次，以不接全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3的处理作为空白对照。分别置于15℃、20℃、25℃、32℃、37℃、42℃，摇床转速设定为180rpm，培养3天；每12h取样一次，同时测定菌浓度OD₆₀₀和吡啶残余浓度。结果如图3所示；全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3对温度有较宽的适应范围，在20℃-42℃之间生长良好，尤其在32℃时生长最佳，此时对吡啶的降解效果也最好，对吡啶的降解结果如图4所示。

（3）环境pH值对全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3生长和吡啶降解率的影响：吡啶浓度为100mg/L的无机盐培养基以NaOH和HCl调至pH值5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按照2%接种量接入全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3的种子液，每个实验组重复3次，以不接全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3的处理作为空白对照，32℃，180rpm震荡培养3d；每12h取样一次，同时测定菌浓度OD₆₀₀和吡啶残余浓度。结果如图5所示，全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3能在pH值为6-8的范围内生长，在pH值为7的条件下生长最好，此时菌株对吡啶的降解效果最强，对吡啶的降解结果如图6所示。

（4）接种量对全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3降解吡啶的影响：将所述全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3种子液按照2%、4%、6%、8%、10%的接种量接入浓度为100mg/L吡啶无机盐培养基中；在32℃下，180rpm震荡培养3d；每个实验设3次重复，空白对照组不接吡啶降解菌；每12h取样一次，测定吡啶残余浓度。随着接种量的增加，全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3对吡啶的降解效果得到提高，当接种量8%-10%，降解率最佳。

实施例4

（1）将全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3接入吡啶初始浓度为100mg/L的无机盐培养基中，32℃，180rpm的条件下振荡培养，待培养基中的纯菌清晰可见，长势均匀时进行转接，吡啶浓度每次增大100mg/L，当吡啶浓度增大到1000mg/L时，完成驯化，得驯化菌种无机盐培养基；

（2）将驯化菌种无机盐培养基在10000r/min转速下离心，弃去上清液，用已灭菌的无机盐培养基洗涤2-3次以便除去含有吡啶的无机盐培养基组分，最后用不含吡啶的无机盐培养基将驯化菌体重悬，每mL的悬浮液中的活性菌为10⁸个，得驯化全食副球菌种子液；同时以为未进行驯化的菌种制备成全食副球菌种子液作为对照，进行降解实验；

（3）配制吡啶浓度为100mg/L、200mg/L、300mg/L、500mg/L、700mg/L、900mg/L的吡啶无机盐培养基，按8%的接种量将步骤（2）的全食副球菌种子液接种于含不同浓度吡啶的无机盐培养基中，在32℃、180rpm的条件下振荡培养3d，测定菌株对吡啶的降解能力。结果如图7所示，经驯化后全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3较未驯化的菌株，对不同底物浓度的降解能力较高，当吡啶无机培养基中吡啶浓度为100mg/L、300mg/L、500mg/L、700mg/L和900mg/L时，驯化后的全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3对吡啶的降解率分别为90.62%、75.00%、71.50%、67.30%和63.50%。可见，驯化后的菌株较未驯化的菌株降解能力更强，驯化后的菌株对高浓度的底物均有较强的耐受能力。

实施例5全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3遗传稳定性研究

全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3降解吡啶能力的遗传稳定性：驯化后的全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3在含有100mg/L吡啶的无机盐培养基中进行传代，15代后能保持稳定的降解能力。其结果见图8所示。可见，全食副球菌（Paracoccuspantotrophus）B21-3遗传稳定性良好。

上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种全食副球菌菌株，其特征在于，所述菌株保藏名称是全食副球菌(Paracoccuspantotrophus)B21-3，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年10月9日，保藏编号为CGMCCNO.11474。

2.根据权利要求1所述的全食副球菌菌株，其特征在于，所述全食副球菌(Paracoccuspantotrophus)B21-3的16SrRNA基因序列如SEQIDNO:1所示。

3.根据权利要求1所述的全食副球菌菌株，其特征在于，所述菌株的细胞形态为球形，菌落呈淡粉色，表面粘质，边缘整齐，易挑起。

4.一种如权利要求1所述的全食副球菌菌株在降解吡啶中的应用。

5.一种降解废水中吡啶的方法，其特征在于，将保藏名称为全食副球菌B21-3的种子液加入到含有吡啶的废水中，于pH值为6-8、20-42℃的条件下静置或振荡降解2-4天；所述全食副球菌(Paracoccuspantotrophus)B21-3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年10月9日，保藏编号为CGMCCNO.11474。

6.根据权利要求5所述的降解废水中吡啶的方法，其特征在于，所述全食副球菌B21-3的种子液是将所述菌株全食副球菌B21-3接种于LB液体培养基，在30℃下，180rpm培养2d，将培养液在10000r/min转速下离心5min，弃去上清液，洗涤菌体2-3次，将菌体重悬于无机盐液体培养基中，即得种子液。

7.根据权利要求6所述的降解废水中吡啶的方法，其特征在于，所述全食副球菌B21-3的种子液的接种量为含吡啶废水重量的8-10%。