CN105316256A - 海洋芽孢杆菌、海洋右旋糖苷酶及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明的提供了一种海洋芽孢杆菌，将其应用于药物开发、日用化妆品、中，拓展了生物医疗微生物的范围。通过在海洋芽孢杆菌(Bacillus？sp.)L-1中提取分离出海洋右旋糖苷酶的基因及其表达翻译的右旋糖苷酶，与其它的右旋糖苷酶相比，本发明所述的海洋右旋糖苷酶来源于海洋低温高盐环境，该酶在25～30℃海水中具有很高的右旋糖苷降解效率，常温下就可以发挥作用，而且40℃以上极不稳定，中温就可以使酶失活，从而确保了其安全性。

Description

海洋芽孢杆菌、海洋右旋糖苷酶及其应用

【技术领域】

本发明涉及微生物医疗技术领域，具体涉及一种海洋芽孢杆菌、海洋右旋糖苷酶及其应用。

【背景技术】

右旋糖酐酶(dextranase,EC3.2.1.11)是专一性切割α-1，6糖苷键葡聚糖中α-1，6糖苷键的酶。按切割方式分类将右旋糖酐酶分成外切型和内切型。右旋糖酐是一种葡萄糖分子以α-1，6糖苷键为主链，同时含有少量α-1，3、α-1，4等糖苷键构成的支链，而形成的葡聚糖大分子。外切型右旋糖酐酶从右旋糖酐的非还原端开始，逐一将葡萄糖分子切割下来，其终产物为葡萄糖分子及无法切割的部分；内切型右旋糖酐酶在右旋糖酐分子的内部随机切割，生成少量的葡萄糖和异麦芽寡糖。经研究发现霉菌、酵母菌和细菌都能产生右旋糖酐酶。

1968年Fitzgerald首次报道了右旋糖酐酶在龋病防治方面的可行性，自此多国科学家参与研究，进行动物实验、体外人工牙菌斑实验，最终证明此酶确实有抑制牙菌斑生物膜形成的作用。1969年Gibbons和Keyes在仓鼠的饮用水中加入右旋糖酐酶，在龋病防治中效果明显。2004年，Wiater等人研究了真菌葡聚糖酶对口腔链球菌生物膜中变聚糖的影响,结果表明变聚糖酶与右旋糖苷酶可以有效地预防牙菌斑生物膜的形成，尤其是两种酶联用时作用效果更好。2010年，Yano等人研究发现右旋糖苷酶与香菇多糖共同存在时抑制生物膜形成的能力增强且对已形成的生物膜也具有降解作用，单独使用右旋糖苷酶时则对已形成的生物膜的作用效果甚微。近年来还出现了各种通过基因工程手段治疗牙菌斑生物膜的研究，例如将编码右旋糖苷酶的基因在口腔细菌中克隆表达。目前丹麦Novo公司、美国Miles公司已有商品右旋糖苷酶制品出售。Novo公司右旋糖苷酶的生产主要由青霉属发酵获得，美国Miles公司生产的右旋糖苷酶则主要通过毛壳菌属发酵生产获得。这些酶主要应用于制糖工业。这两种微生物来源的右旋糖苷酶尚未被美国食品药物管理局批准认可用于食品行业。为了预防牙菌斑生物膜的形成，目前国外已经设计了多种含右旋糖苷酶的口腔护理产品。2001年，Song等人对斯氏油脂酵母Lipomycesstarkeyi突变株KSM22右旋糖苷酶漱口液进行了临床实验。结果表明，与使用含0.12％洗必泰漱口液的实验组相比，Lipomycesstarkeyi突变株KSM22右旋糖苷酶漱口液在牙菌斑及牙龈炎的防治方面效果要好，而且引起的副作用较小。2004年Masaru等人再次证实了右旋糖苷酶漱口液可以有效地预防牙菌斑生物膜的形成，而且长期使用后效果会越来越好。

目前国内关于右旋糖苷酶在牙菌斑生物膜防治中的应用的报道并不多见，而且相对集中。1988年中国科学院微生物研究所孙晋武等人证明了淡紫拟青霉右旋糖苷酶可以抑制变异链球菌产生胞外多糖，降低形成牙菌斑的可能性。此后北京口腔医院赵宝荣等人通过动物实验及临床实验再次证实了淡紫拟青霉右旋糖苷酶对牙菌斑的抑制作用。2007年四川大学华西口腔医学院蒋丹研究了美国Sigma公司青霉属右旋糖苷酶对变异链球菌单菌种生物膜的作用效果，结果显示右旋糖苷酶能降解变异链球菌生物膜中的胞外多糖。

尽管国内已出现关于右旋糖苷酶的部分防龋报道，但尚未出现含右旋糖苷酶的口腔护理产品。究其原因主要包括右旋糖苷酶的微生物来源及右旋糖苷酶的酶学特性。右旋糖苷酶的产生菌主要为霉菌，用霉菌来生产预防口腔牙菌斑的右旋糖苷酶存在一定的安全性问题，且产酶时间长，如果用在牙膏中，还存在碱性条件下不稳定的问题。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题在于扩展口腔护理微生物的种类，特别是开发安全性能高的海洋芽孢杆菌在口腔护理中的应用，以改善现有技术存在的缺陷。

为此，本发明提供一种海洋芽孢杆菌(Bacillussp.)，所述菌株为L-1，保藏单位：武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2015年7月9日，保藏号：CCTCCM2015437。

所述海洋芽孢杆菌筛选于中国渤海沉积物。

本发明另一方面提供了一种海洋右旋糖苷酶基因，由所述海洋芽孢杆菌的菌株L-1提取，所述海洋右旋糖苷酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

本发明另一方面提供了一种含有所述SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的表达载体。

本发明再一方面提供了一种所述的表达载体重组细胞。

本发明另一方面提供了一种含有所述海洋右旋糖苷酶基因表达翻译的右旋糖苷酶，所述右旋糖苷酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明再一方面提供了一种海洋右旋糖苷酶在药物开发中的应用。

本发明再一方面提供了一种海洋右旋糖苷酶在日用化妆品开发中的应用。

本发明的提供了一种海洋芽孢杆菌，将其应用于药物开发、日用化妆品、中，拓展了生物医疗微生物的范围。通过在海洋芽孢杆菌(Bacillussp.)L-1中提取分离出海洋右旋糖苷酶的基因及其表达翻译的右旋糖苷酶，，与其它的右旋糖苷酶相比，本发明所述的海洋右旋糖苷酶来源于海洋低温高盐环境，该酶在25～30℃海水中具有很高的右旋糖苷降解效率，常温下就可以发挥作用，而且40℃以上极不稳定，中温就可以使酶失活，从而确保了其安全性。

【附图说明】

图1为本发明提取的海洋芽孢杆菌(Bacillussp.)L-1的基因组DNA的电泳图；

图2为通过PCR和TailPCR扩增克隆的编码海洋右旋糖苷酶的基因片段的电泳图；

图3表示温度对海洋右旋糖苷酶酶活的影响曲线图；

图4表示为pH值对海洋右旋糖苷酶酶活的影响曲线图。

【具体实施方式】

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，而非限定本发明。

在详细描述本发明技术方案之前，先对本发明涉及的基本术语进行说明，以便更好地了解本方案。

PCR技术：链式聚合酶反应，利用DNA聚合酶，模板，引物以及dNTP进行体外扩增特定DNA片段的技术。

TailPCR技术：热不对称链式聚合酶反应，使用两种不同长度的引物，从而使两种引物的退火温度不同。长引物是以已知序列设计的三个嵌套引物，退火温度58-63℃，短引物是任意简并引物，可与DNA随机结合，退火温度47-48℃。PCR温度循环的每一个循环包括：两个高温退火反应，这时只有长引物退火并延伸；一次低温退火反应，这时两种引物同时退火并扩增。

CDD分析软件：NCBI网站上提供的一种用来推测和分析特定氨基酸序列形成的结构域信息的软件。

本发明基本原理如下：首先分离纯化了海洋芽孢杆菌(Bacillussp.)L-1所产的右旋糖苷酶(dextranase)，测定了该酶的N端序列，根据其N端序列和原核生物右旋糖苷酶保守基因序列设计引物；利用PCR和TailPCR技术从海洋芽孢杆菌L-1的基因组DNA中克隆了编码右旋糖酐酶的基因，对该基因的核酸序列进行了测定；该基因DNA片段共1812bp，其中含有一个1812bp的开放阅读框架编码右旋糖苷酶，起始密码子位于1bp，终止密码子位于1809bp，共编码603个氨基酸。因此，右旋糖苷酶的前体是一个含有603个氨基酸的多肽，无信号肽但具有催化结构域。

本发明下述实施例提供的株海洋芽孢杆菌(Bacillussp.)L-1，保藏单位：武汉大学中国典型培养物保藏中心(请提供)，保藏日期：2015年7月9日，保藏号：CCTCCM2015437(请提供)。所述海洋芽孢杆菌筛选于中国渤海沉积物。

实施例1-海洋右旋糖苷酶编码基因的克隆

1、海洋芽孢杆菌(Bacillussp.)L-1基因组DNA的提取。

(1)取1ml海洋芽孢杆菌(Bacillussp.)L-1，10000rpm离心30sec,弃上清，收集菌体；

(2)加入200μl缓冲液RB重悬洗涤细胞，10000rpm离心30sec，弃上清后将细胞震荡或者吹打重悬于200μl缓冲液RB中；

(3)加入200μl结合液CB，充分混匀，再加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混匀，70℃放置10min；

(4)冷却后加入100μl异丙醇，充分混匀，得混合溶液；

(5)将步骤(4)制得的混合溶液加入吸附柱AC中，10000rpm离心30sec，倒掉收集管中的废液；

(6)加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30sec，弃废液；

(7)加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30sec，弃掉废液；

(8)加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心30sec，弃掉废液；

(9)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，除去漂洗液；

(10)取出吸附柱AC放入离心管中，在吸附膜的中间部位添加在65～70℃水浴中预热后的洗脱缓冲液EB100μl，室温放置3～5min，12000rpm离心1min；将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min；取离心得到的溶液即为海洋芽孢杆菌(Bacillussp.)L-1基因组DNA溶液；

(11)海洋芽孢杆菌(Bacillussp.)L-1基因组DNA溶液置于4℃冰箱保存待用。

请参阅图1，为本发明提取的海洋芽孢杆菌(Bacillussp.)L-1的基因组DNA的电泳图。

2、引物的设计与合成

根据右旋糖苷酶的成熟酶N端序列和保守区序列，设计引物：

*引物序列(5'--3')	*引物名称
		5’-TTYCCNMGNTAYGGNTTYYT-3’	DEXT-S1
5’-AAYGGNHTNCARTTYTAYGAYTGG-3’	DEXT-S2
		5’-ATGGCNTAYAAYYTNYTNTAYGG-3’	DEXT-S3
5’-TTYGAYGGNTGGCAYATHGAYCA-3’	DEXT-S4
		5’-TGTRCDATRTGCCANCCRTC-3’	DEXT-X1
5’-CCRWAYTGRTTNACNGCRTTCAT-3’	DEXT-X2
		5’-TTCATRTANGCNGCNARNACNGTRTT-3’	DEXT-X3
5’-TCYTTNSKNARCATRTGYTC-3’	DEXT-X4

上述引物均由上海生工生物技术公司合成。

3、利用PCR进行海洋右旋糖苷酶编码基因部分序列扩增

(1)分别以S1\S2\S3\S4和X1\X2\X3\X4为引物，以基因组DNA为模板，进行PCR扩增；PCR反应条件为：95℃，5分钟；然后95℃，1分钟；55℃，1分钟；72℃，2分钟，30个循环后；72℃，延伸10分钟；

(2)对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果获得一条约780bp的目的DNA片段，然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其使用说明书回收扩增DNA片段。

(3)DNA片段与克隆载体连接

将回收得到的扩增DNA片段连接到Promega公司的pGEMT载体上，步骤可参考pGEMT载体使用说明书。连接反应体系：

混匀样品，在离心机上转2sec，把样品集中在管底，16℃水浴中连接过夜。

(4)按《分子克隆实验指南》(科学出版社，ISBN：7030103386，出版日期：2005-3-1)制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态。

(5)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pGEMT载体转至大肠杆菌DH5α感受态。

(6)转化的大肠杆菌DH5α涂于含50μg/L氨苄青霉素的麦康凯培养基(购自挚诚生物技术公司)，37℃过夜培养，挑选白色转化子作为模板，用M1和M2作为引物，通过菌落PCR验证白色转化子中质粒是否含有PCR扩增的DNA片段。

(7)将质粒含有PCR扩增的DNA片段的转化子送上海生工生物技术有限公司测序，获得一段目的序列。

4.TailPCR继续进行海洋右旋糖苷酶编码基因全序列扩增

对于已得片段N端方向的未知序列，先以S3和X3为引物，以基因组为模板，进行第一轮PCR，条件为：94℃，30秒钟；53℃，1分钟；72℃，2分钟，5个循环。然后94℃，30秒钟；28℃，3分钟；72℃，2分钟；94℃，20秒钟；40℃，1分钟；72℃，2分钟，10个循环。然后94℃，20秒钟；53℃，1分钟；72℃，2分钟；94℃，20秒钟；53℃，1分钟；72℃，2分钟；94℃，30秒钟；40℃，1分钟；72℃，2分钟，12个循环。然后72℃延伸10分钟。

再将所得PCR产物作为模板以S2和X3为引物进行第二轮PCR，条件为：94℃，20秒钟；55℃，1分钟；72℃，2分钟；94℃，20秒钟；55℃，1分钟；72℃，2分钟；94℃，20秒钟；40℃，1.5分钟；72℃，2分钟，16个循环。然后72℃，延伸10分钟。

再以第二轮PCR产物为模板，以S2和X4为模板进行第三轮PCR，条件为：94℃，30秒钟；55℃，1分钟；72℃，2分钟，25个循环。然后72℃，延伸10分钟。

对第三轮PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，获得一条780bp左右的DNA片段。对已知序列C端方向的未知序列用相同方法进行PCR扩增。结果出现一条300bp左右的DNA片段。

然后用本实施例3中相同方法对这两个DNA片段进行测序。根据这两条片段的序列，将它们和3中获得DNA片段拼接成一条DNA片段。对拼接DNA片段的序列通过NCBI网站的blastX软件分析发现。该基因DNA片段共1812bp，其中含有一个1812bp的开放阅读框架编码右旋糖苷酶，起始密码子位于1bp，终止密码子位于1809bp，共编码603个氨基酸。因此，右旋糖苷酶的前体是一个含有603个氨基酸的多肽，无信号肽但具有催化结构域。请参阅图2，为通过PCR和TailPCR扩增克隆的编码海洋右旋糖苷酶的基因片段的电泳图。

实施例2-海洋芽胞杆菌L-1分泌的海洋右旋糖苷酶的纯化

海洋芽胞杆菌L-1接种于发酵培养基(人工海水(按照青岛海之盐水族科技有限公司的海水素配制方法配制)中酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，右旋糖酐T201％，氯化钠2％，pH8.0。)，在30℃培养48h。发酵液，10000r/min离心后，将上清过0.45μm滤膜，然后利用截留分子量为30kDa的中空管纤维柱超滤，浓缩5倍后，冻干制备成酶干粉，低温保存。

实施例3-右旋糖苷酶的性质测定

(1)、右旋糖苷酶活力测定

DNS(3,5-二硝基水杨酸)试剂的配制:称取3.15g的3,5-二硝基水杨酸,用约500mL水溶解,加热有利于溶解但不要超过45℃；称取氢氧化钠20.0g,用约l00mL水溶解,然后与前者混合；接着加入四水合酒石酸钾钠91.0g,无水亚硫酸钠2.5g，苯酚2.5g，待完全溶解后,定容到l000mL，然后室温下，在棕色试剂瓶储存7-10天以后使用；

标准曲线的绘制：取蒸溜水、0.2、0.4、0.6、0.8、l.0mg/mL标准葡萄糖溶液各1mL至25mL具塞试管，加入DNS试剂2mL，沸水浴5min后冷却至室温，定容至25mL，摇匀。以加入蒸馏水的样本为空白，测量各个样本在540nm波长下的吸光值，并以其为纵坐标,以标准葡萄糖浓度为横坐标，绘制出标准曲线；

预备反应底物：将标准葡聚糖底物T-2000粉末用PH5.5的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解，配成质量体积比为2％的底物溶液，取900μL放入25mL比色管中，置于45℃恒温水浴中保温不少于5min；

酶促反应：取经适当稀释的酶液100μL，加入经预热的底物当中，准确反应l0min后立即加入2mL的DNS试剂中止反应，沸水浴5min，然后冷却至室温,定容至定容至25mL，并测定其OD540；

酶活定义：每分钟在标准葡聚糖底物T-2000中释放出1μmoL还原糖所需的酶量为1个酶活单位,以表示。

(2)、最适酶活温度

分别在0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50℃条件下测定右旋糖苷酶的酶活，以确定酶的最适反应温度。测定酶活的具体方法为：

将接种培养12h的种子培养基以1％接种量接种至发酵培养基,于15℃-40℃培养28h后分别测酶液的活力。

请参阅图3，表示温度对海洋右旋糖苷酶酶活的影响曲线图。从图中可以看出，该酶在25～30℃海水中具有很高的右旋糖苷降解效率，常温下就可以发挥作用。而且40℃以上极不稳定，中温就可以使酶失活，从而确保了其安全性。

(3)、最适pH

分别在pH6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0条件下测定右旋糖苷酶的酶活，以确定该酶的最适pH。缓冲体系(50mmol/L)：pH5.5-6.0，乙酸钠缓冲液。

具体方法是以1％接种量接种至不同初始pH的发酵培养基,于30℃培养28h后分别测酶液的活力。初始pH值调节范围为4-10。

请参阅图4，表示为pH值对海洋右旋糖苷酶酶活的影响曲线图。从图中可以看出，该酶在pH值为6～9.5海水中具有很高的右旋糖苷降解效率，而在9.5以上极不稳定，从而确保了其安全性。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所作出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种海洋芽孢杆菌，其特征在于，所述海洋芽孢杆菌的菌株为L-1，保藏号为CCTCCM2015437。

2.根据权利要求1所述的海洋芽孢杆菌，其特征在于，所述海洋芽孢杆菌筛选于中国渤海沉积物。

3.一种海洋右旋糖苷酶基因，其特征在于，由所述海洋芽孢杆菌的菌株L-1提取，所述海洋右旋糖苷酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

4.一种含有权利要求3所述SEQIDNo.1所示的核苷酸序列的表达载体。

5.一种含有权利要求4所述表达载体的重组细胞。

6.一种含有权利要求2所述海洋右旋糖苷酶基因表达翻译的右旋糖苷酶，其特征在于，所述右旋糖苷酶的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

7.一种根据权利要求6所述的海洋右旋糖苷酶在药物开发中的应用。

8.一种根据权利要求6所述的海洋右旋糖苷酶在日用化妆品开发中的应用。