CN105311005A - 牛樟芝化合物在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途 - Google Patents

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姚振文
严逸钊
曾卉菱
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郭盈妤
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Abstract

本发明公开了一种牛樟芝化合物在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途。该化合物是以式I表示：

Description

牛樟芝化合物在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途
技术领域
本发明涉及一种分离自牛樟芝的化合物的医疗用途，特别涉及一种牛樟芝化合物在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途。
背景技术
牛樟芝(Antrodiacamphorata)，又称樟芝、牛樟菇或红樟芝等，属于非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)的多年生蕈菌类，为台湾特有种真菌，仅生长于台湾保育类树种-牛樟树(CinnamoumkanehiraiHay)的中空腐朽心材内壁上。由于牛樟树分布数量极为稀少，加上人为的盗伐，使得寄生于其中方能生长的野生牛樟芝数量更稀少，且由于其子实体生长相当缓慢，生长期亦仅在六月至十月之间，因此价格非常昂贵。在台湾民俗医学上，牛樟芝具有解毒、减轻腹泻症状、消炎、治疗肝脏相关疾病及抗癌等功用。牛樟芝如同一般食药用的蕈菇类，具有许多复杂的成分，已知的生理活性成分中，包括：三萜类化合物(triterpenoids)、多醣体(polysaccharides，如β-D-葡聚醣)、腺苷(adenosine)、维生素(如维生素B、烟碱酸)、蛋白质(含免疫球蛋白)、超氧歧化酵素(superoxidedismutase,SOD)、微量元素(如：钙、磷、锗)、核酸、固醇类以及血压稳定物质(如antodiaacid)等，此些生理活性成分被认为具有抗肿瘤、增加免疫能力、抗过敏、抗病菌、抗高血压、降血糖及降胆固醇等多种功效。同时在近年来，已开始陆续发现其中的特定成分可能具有抗发炎的功效，特别是可用于治疗肾脏疾病等。
一般常见的肾脏疾病，常是透过攻击肾丝球而影响肾脏功能。肾丝球疾病包括多种基因及环境因素所导致的许多病症，但不外乎主要分成肾丝球硬化症及肾丝球肾炎两大类。肾丝球硬化症是指肾脏中的肾丝球硬化。一般是指肾脏的微血管、肾丝球、及用以从血液过滤尿液的肾脏功能单元损伤。尿蛋白(尿液中量最多的蛋白质)为肾丝球硬化症的讯号之一。肾脏损伤会影响肾脏过滤功能，且造成蛋白由血液渗漏至尿液中。然而，肾丝球硬化症仅为尿蛋白许多的成因之一。而肾脏切片可能为一判断病人是否罹患肾丝球硬化症或其他肾脏疾病的必要判断依据。肾丝球硬化症，可特别意指局部性肾丝球硬化症(FSGS)及结节性肾丝球硬化症。
局部性肾丝球硬化症(FSGS)是以局部肾丝球硬化及足细胞足突扁平化(footprocesseffacemen)的损伤特征来判断。近20年的研究显示，患有FSGS病患其末期肾脏疾病发生率介于13至78％之间。虽然FSGS病源及发病原因尚未清楚，但主要应该是起因于肾丝球上皮细胞本身损害，而导致肾丝球中复杂的反应产生，进而造成肾丝球硬化。
结节性肾丝球硬化症或毛细血管间肾小球肾炎，亦可称之为糖尿病肾脏病变(糖尿病肾病)或基-威二氏症(Kimmelstiel-Wilsonsyndrome)，是一种进行性肾并，其是起因于肾丝球的毛细血管病变。此病的特征为肾病变及弥漫性肾丝球硬化；并起因于长时间罹患糖尿病，且各国的主要治疗方式为洗肾。
截至目前为止，虽然类固醇及免疫制剂为主要用于治疗罹患原发性FSGS的方法，但此些疗法对于肾损伤发展的治疗上效果仍然有线，且因其会产生各种副作用，故治疗方法仅仅是基于经验法则，而较少根据病理证据。
肾丝球肾炎则意指肾脏膜组织的发炎反应，其中膜组织是具有过滤功能，而可从血液中分离废弃物及多于流体。
最常见的肾丝球肾炎为免疫球蛋白A型肾丝球肾炎(IgAN)，造成此肾炎加速发展的病因仍无法预测，且临床上仍无法预防及治疗，故被视为可能会造成肾病的慢性肾衰竭的主要因素之一。因此，在IgAN病患的肾脏中，即便其他免疫上、临床上及病理上的因素阶会造成肾衰竭，但系统性T细胞活化及淋巴球/巨噬细胞/嗜中性白血球浸润等不正常增加，被视为造成IgAN转换成慢性肾衰竭的主要过程之一。再者，氧化压力亦为主要造成病患中及动物模型中IgAN增加及发展的因素；曾有报导指出，在多数的人类及实验性肾病中(包括IgAN)，活性氧(ROS)会直接引发疾病。
虽然醣质皮质固醇(glucocorticoidsteroid)已广泛应用在治疗IgAN病患，但其对于IgAN的维持肾脏功能且减缓尿蛋白的效果仍不清楚，且因长时间使用所导致的潜在无法控制的抑制免疫反应的副作用，仍造成用药上的问题。
目前诸多的实验已得知牛樟芝萃取物具有诸多医疗功效，且其所含成分亦陆续被分析出，但牛樟芝萃取物中是否具有其他可有效治疗肾脏疾病的化合物，仍是亟待解决之一课题。
发明内容
据此，本发明是主要针对六种萃取自牛樟芝的化合物，检测其是否具有可治疗肾脏疾病以及抗肾脏发炎的效果。
本发明的目的是提供一种牛樟芝化合物在制备治疗肾脏疾病的药物的用途，该化合物是以式I表示：
其中该肾脏疾病为肾丝球硬化症或肾丝球肾炎。
较佳地，其中该肾丝球硬化症为局部性肾丝球硬化症(FSGS)或结节性肾丝球硬化症。
较佳地，其中该肾丝球肾炎为免疫球蛋白A型肾丝球肾炎(IgAN)。
经由本发明揭露内容显示，LT3对于抑制MCP-1产生量具有良好功效性，由此可知，未来可利用上述牛樟芝化合物于制备治疗肾脏疾病的药物，可预期地对于目前已知的肾脏疾病，包括肾丝球硬化症及肾丝球肾炎，特别是局部性肾丝球硬化症(FSGS)、结节性肾丝球硬化症、免疫球蛋白A型肾丝球肾炎(IgAN)等皆具有抗发炎的功效。
附图说明
图1表示利用肾脏膈细胞(Mesangialcell)对LT3牛樟芝化合物进行细胞存活率分析(MTTcellviabilityassay)的结果。
图2表示LT3牛樟芝化合物对于抗氧化的测定结果。
图3表示LT3牛樟芝化合物进行抗发炎反应(MCP-1)的分析结果。
具体实施方式
本发明主要针对一种萃取自牛樟芝的化合物，检测其是否具有可治疗肾脏疾病以及抗肾脏发炎的效果。AntrocamolLT3为发明人发现的新化合物，以下将提供LT3的相关萃取及结构鉴定数据。
牛樟芝成分的萃取
取牛樟芝(Antrodiacamphorata)菌丝体、子实体或二者的混合物(1.0kg)以10倍量的酒精抽取2次后，合并浓缩可得粗抽物约230g(LT-E)，粗抽物以二氯甲烷/水(1:1)进行分配萃取法3次，分为二氯甲烷层约102.6g(LT-E-D)及水层约127.4g(LT-E-W)，取二氯甲烷层6.0g以硅胶柱层析法经过正己烷/二氯甲烷(1:4)、二氯甲烷、甲醇/二氯甲烷(5:95)的溶媒分离，分为ANCA-E-D-1、ANCA-E-D-2、ANCA-E-D-3、ANCA-E-D-4等四层。
依据上述结果，将ANCA-E-D-2及ANCA-E-D-3进一步进行纯化，将LT-E-D-3层以逆相柱层析法(C-18制备型管柱)及甲醇/水(80:20)的溶媒冲提，在14.5分钟可得AntrocamolLT3约180mg。
AntrocamolLT3为无色的液体产物，经分析该化合物的分子式为C24H38O5；分子量为406；，完整中、英名称分别为(4R,5R,6R)-4-羟基5-[(2E,6E,9E)-11-羟基-3,7,11-三甲基-十二-2,6,9-三烯基]-2,3-二甲氧基-6-甲基-环己-2-烯酮、(4R,5R,6R)-4-hydroxy-5-[(2E,6E,9E)-11-hydroxy-3,7,11-trimethyldodeca-2,6,9-trienyl]-2,3-dimethoxy-6-methylcyclohex-2-enone。
AntrocamolLT3结构鉴定数据：1H-NMR(400MHz,CDCl3):　1.14(3H,d,J＝7.2Hz,),1.29(6H,s),1.56(3H,s),1.63(3H,s),1.70(1H,m),2.02(2H),m),2.08(2H,t,J＝6.4Hz),2.21(2H,t,J＝7.6Hz),2.51(1H,dq,J＝11.2,7.2Hz),2.64(1H,d,J＝5.2Hz),3.64(3H,s),4.05(3H,s),4.32(1H,d,J＝3.2Hz),5.08(1H,t,J＝6.8Hz),5.14(1H,t,J＝6.4Hz),5.57(2H,m)；13C-NMR(100MHz,CDCl3):12.32(q),16.14(q),16.14(q),26.35(t),26.95(t),29.85(q),39.63(t),40.24(d),42.20(t),43.40(d),59.29(q),60.59(q),67.88(d),70.76(d),121.14(d),124.78(d),125.22(d),134.04(s),135.84(s),137.77(s),139.17(d),160.59(s),197.21(s)。
细胞培养方法
在此利用老鼠肾脏膈细胞(MouseMClineCRL-1927)进行后续实验。该细胞株取自AmericanTypeCultureCollection(Rockville,MD,USA)，以3:1比例的Dulbecco'smodifiedEagle'smedium及Ham'sF-12medium培养液，并加入5％fetalbovineserum及14mMHEPES进行定期培养。
细胞存活率分析
将上述细胞株分别于适当的培养液中培养24小时。将增生后的细胞以PBS清洗一次，并以1倍的胰蛋白酶-EDTA处理细胞，随后于1,200rpm下离心5分钟，将细胞沈淀并丢弃上清液。之后加入10ml的新培养液，轻微摇晃使细胞再次悬浮，再将细胞分置于96孔微量盘内。测试时，分别于每一孔内加入0.01-200μg/ml的牛樟芝化合物，于37℃、5％CO2下培养48小时。其后，于避光的环境下于每一孔内加入5mg/ml的3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide(MTT)(Sigma　Aldrich,St.Louis,MO)反应2小时。再以酵素免疫分析仪在570nm吸光波长下测定其吸光值，藉以计算细胞的存活率，并推算出其生长半抑制率所需浓度(即IC50值)所有实验数据均以平均值±标准误差表示。实验资料以配对t考验(paired-ttest)进行统计分析。以p值小于0.05视为具有统计学上差异。
利用肾脏膈细胞(Mesangialcell)对LT3牛樟芝化合物进行细胞存活率分析(MTTcellviabilityassay)，结果如图1所示。结果显示，AntrocamolLT3于目前挑选的(≦0.048μg/ml)浓度均不影响肾脏膈细胞生长。
牛樟芝化合物抗氧化/抗发炎的效果
由于目前已知，肾丝球硬化症或肾丝球肾炎是由严重的发炎反应所引起，因免疫反应而聚集的白血球细胞会释出大量ROS并造成肾细胞内氧化逆境产生，进而对肾脏造成伤害，故降低甚至是消除肾细胞内的氧化压力为治疗肾盂肾炎的方法之一，因此降低胞内的ROS也是治疗上述肾脏疾病的重要指标之一。
细胞内reactiveoxygenspecies(ROS)的测定
细胞内ROS的测定是藉由检测2’,7’-dichlorofluoresceindiacetate的氧化物(2’,7’-dichlorofluorescein)的荧光强度而定。将肾脏膈细胞以待测化合物处理后，加入2’,7’-dichlorofluoresceindiacetate(2μM)反应30分钟，再于指定时间加入LPS。接着以激发波长485nm与放射波长530nm的吸收光谱读取仪(Bio-RadLaboratories,Inc)进行测读，当荧光愈强即表示ROS含量愈高。
由于活性氧(ROS)与肾炎疾病具有密不可分的关系，在此进行上述细胞内ROS的测定，结果如图2所示。
参阅图2所示，以0.012μg/ml、0.048μg/ml的AntrocamolLT3进行抑制氧化压力(ROS)分析，结果显示于5分钟时目前浓度无抑制效果。
结果整理如下表一所示：
表一
牛樟芝化合物对于肾炎细胞的抗发炎效果
目前已知，MCP-1在促使肾小管组织间隙发炎反应、肾小管萎缩以及肾脏纤维化等扮演了重要角色，故对此指标性蛋白质进行检测，据以判定牛樟芝化合物对于肾脏细胞的抗发炎效果。
利用ELISA检测套组(Biosciences,LosAngeles,CA,USA)，依据使用说明检测细胞上清液的MCP-1蛋白质，并利用ELISA读取仪(Bio-Tek)进行测读(吸收波长为450nm)。***表示p<0.005，NS表示。
参阅图3所示，以0.048μg/ml和0.012μg/ml进行抗发炎反应(MCP-1)分析，结果显示0.048μg/ml可以抑制发炎反应40.2％。
结果整理如下表二所示：
表二
依据上述实验结果，由细胞内ROS测定或抑制MCP-1产生量的实验结果可知，虽然LT3在降低胞内ROS方面的效果虽不明显，但对于抑制MCP-1产生量明显地具有良好的功效性，由此可知，未来可利用上述牛樟芝化合物于制备治疗肾脏疾病的药物，可预期地对于目前已知的肾脏疾病，包括肾丝球硬化症及肾丝球肾炎，特别是局部性肾丝球硬化症(FSGS)、结节性肾丝球硬化症、免疫球蛋白A型肾丝球肾炎(IgAN)等皆具有抗发炎的功效。
本发明所提供的牛樟芝化合物在制备治疗肾脏疾病的药物的用途确具产业上的利用价值，以上的叙述仅为本发明的较佳实施例说明，本领域技术人员当可依据上述的说明而作其它种种的改良，这些改变仍属于本发明之精神及以权利要求书所界定之专利范围中。

Claims (3)

1.一种牛樟芝化合物在制备治疗肾脏疾病的药物中的用途，该化合物是以式I表示：
其中，该肾脏疾病为肾丝球硬化症或肾丝球肾炎。
2.如权利要求1所述的用途，其中，该肾丝球硬化症为局部性肾丝球硬化症(FSGS)或结节性肾丝球硬化症。
3.如权利要求1所述的用途，其中，该肾丝球肾炎为免疫球蛋白A型肾丝球肾炎(IgAN)。
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