CN105296554A - 复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法，将曲酸和棕榈酸置于无水有机溶剂中，加入作为酯化反应催化剂的复合脂肪酶酶制剂，所述曲酸和所述棕榈酸酯化生成曲酸双棕榈酸酯。本发明采用多种复合脂肪酶作为催化剂来制备曲酸双棕榈酸酯，降低对反应设备的要求，同时大幅度降低反应后的产物处理方面成本，具有温和高效、环保、成本低，原料转化率高等优点，减少了反应步骤，降低生产成本，具有很高的工业应用和经济价值。

Description

复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法。
背景技术
曲酸是一种无色、无味、安全无毒的酪氨酸酶抑制剂，在食品中可作为防腐剂、保鲜剂、护色剂等。曲酸对人体皮肤黑色素的生成有很强的抑制作用，曲酸使酪氨酸酶失去活性使与其必不可少的铜离子螯合,并抑制从多巴铬互变至DHICA(5,6-二羟基吲哚-2-羧酸)。左旋-抗坏血酸及其衍生物,包括MAP是对黑色素中间体起还原作用,阻止了从酪氨酸/DOPA至黑色素中各点上的氧化链式反应，因此，曲酸可制得用于治疗雀斑、老年斑、色素沉着的美白化妆品，深受消费者的喜爱。然而由于曲酸不稳定，对光、热敏感，在空气中易氧化，与许多金属离子螯合尤其是与三价铁离子螯合，使得配制的皮肤美白产品在放置使用过程中会逐渐变成黄棕色，影响产品质量和外观。
曲酸双棕榈酸酯比曲酸具有更强的抑制黑色素生成的作用，具有优良的稳定性、油溶性和美白性能。由于其分子结构中活泼的2，5位羟基基团形成酯而得到保护，因而不会与化妆品体系中添加的防腐剂、防晒剂或其他美白活性成分形成氢键而影响这些添加剂的功效，具有优异的复配性能，在高效、低刺激美白剂的商业化生产中已获得成功应用。
目前曲酸双棕榈酸酯的主要制备方法为化学法，总体合成思路为：先将棕榈酸经过酰氯化反应生成棕榈酰氯，然后在吡啶的催化下曲酸和棕榈酰氯反应得到曲酸双棕榈酸酯。各种已报道合成方法差异主要体现在酰氯化试剂的不同，已用的酰氯化试剂有氯化亚砜，三氯化磷，碳酸二(三氯甲)酯等等。
化学法的主要缺陷体现在：(1)酰氯化试剂对设备腐蚀严重，酰氯化反应过程释放大量热，对反应设备要求较高；(2)反应过程中使用吡啶等大量有机溶剂，增加了分离纯化和污水处理的成本；(3)化学反应转化效率有限，增加了产品的成本。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效、环保及低成本的复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法，其采用多种复合脂肪酶作为催化剂，降低对反应设备的要求，同时大幅度降低反应后的产物处理方面成本，具有温和高效、环保、成本低，原料转化率高等优点，减少反应步骤，降低了生产成本。
本发明的技术路线如下：
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法，将曲酸和棕榈酸置于无水有机溶剂中，加入作为酯化反应催化剂的复合脂肪酶酶制剂，所述曲酸和所述棕榈酸酯化生成曲酸双棕榈酸酯。
优选地，所述复合脂肪酶酶制剂选自碱杆菌属脂肪酶、枯草杆菌脂肪酶、来自胰和肝脏的脂肪酶、假丝酵母属脂肪酶、根霉菌属脂肪酶、毛霉属脂肪酶和假单胞细菌属脂肪酶中的两种或多种。
本发明所用的脂肪酶可以是商品酶，例如来源于Candidaantarctic，Rhizomucormiehei，Rhizopusoryzae，Hogliver等具有高活力的脂肪酶，或通过培养产脂肪酶微生物Pseudomonassp.、Bacillussubtilis等生产制备的脂肪酶粗酶或者处理后的含酶细胞(细胞器)。所用脂肪酶形态是经过冷冻干燥除水后的固定化酶颗粒或酶粉末，或经过脱水处理的含酶细胞或细胞器。
进一步的，所述复合脂肪酶酶制剂为LipozymeRMIM和Novozyme435。此双酶组合在温度为40℃，反应28小时，脂肪酶与反应物曲酸的质量比为0.5:1的反应条件下转化率最高，达到94％。
优选地，所述曲酸与所述棕榈酸的质量比为1:3.6～1:10.8。
优选地，所述脂肪酶与反应物曲酸的质量比为0.001:1～0.5:1。
优选地，所述有机溶剂选自石油醚、正己烷、环己烷、异戊烷、丙酮、氯仿、二氯甲烷、无水乙醚、四氢呋喃、1,4-二氧六环、甲苯、异辛烷、异丙醚和甲基叔丁基醚中的一种或者几种。
优选地，所述复合脂肪酶酶制剂催化反应时间为18～60小时，温度为25℃～60℃。
进一步的，所述复合脂肪酶酶制剂催化反应时间为25～45小时，温度为35℃～45℃。
进一步的，所述酶催化反应中添加用于除去水分的分子筛或硅胶。
优选地，所述曲酸双棕榈酸酯的提纯方法是：将所述曲酸双棕榈酸酯用二氯甲烷萃取2～5次，合并有机相，旋转蒸发干燥得粗产品，再经乙酸乙酯重结晶得提纯后的曲酸棕榈酸酯。反应结束后可通过简单过滤或者离心除去复合脂肪酶酶制剂，复合脂肪酶酶制剂可以重复使用，酯化反应用气相色谱监测反应的进度。
本发明的有益效果是：
(1)避免了化学制备方法中酰氯化试剂对设备腐蚀严重，酰氯化反应过程释放大量热，对反应设备要求较高的优点；
(2)反应过程采用复合脂肪酶一步完成催化反应，使得制备过程从两步反应变成一步反应，而且反应过程中使用的生物酶催化剂可以回收再利用，降低了生产成本；
(3)避免反应过程中使用吡啶等有害机溶剂，降低了反应之后分离纯化和污水处理的成本；
(4)原料转化率高，以原料曲酸计算，原料转化率可达94％；
(5)本发明给出一种生物酶法制备曲酸双棕榈酸酯的方法，采用多种复合脂肪酶作为催化剂，降低对反应设备的要求，同时大幅度降低反应后的产物处理方面成本，具有温和高效、环保、成本低，原料转化率高等优点，减少了反应步骤，降低生产成本，具有很高的工业应用和经济价值。
具体实施方式
下面结合具体实例，进一步阐明本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
除特别说明，本发明使用的设备和试剂为本技术领域常规市购产品。底物转化率，以原料曲酸计算。
实施例1
向50ml三角瓶中倒入20ml丙酮液体，将0.2克曲酸、0.72克棕榈酸溶于20ml丙酮中，然后分别向三角瓶中加入0.05克脂肪酶LipozymeRMIM(来源于米黑根毛霉菌)，0.05克Novozyme435(来自于南极假丝酵母的固定化脂肪酶)，1克变色硅胶。密封后置于40℃、170rpm的振荡器中反应28h。反应完毕后，12000rpm离心10min，去除酶和固体颗粒，色谱检测分析，底物转化率94％。在反应过程中使用变色硅胶的作用是除去反应体系中的水分。
实施例2
向30ml三角瓶中倒入石油醚-四氢呋喃混合溶剂(体积比为石油醚：四氢呋喃＝1:2)15ml，将0.1克曲酸，0.5克棕榈酸溶于此混合溶剂中，最后向此溶液中加入含枯草杆菌脂肪酶固定化细胞0.01克，脂肪酶A(来自于南极假丝酵母)0.02克，变色硅胶0.5克。密封后置于35℃、170rpm的振荡器中反应45h。反应完毕后，12000rpm离心10min，去除酶和固体颗粒，色谱检测分析，底物转化率87％。在反应过程中使用变色硅胶的作用是除去反应体系中的水分。
实施例3
向100ml三角瓶中倒入二氯甲烷-1，4-二氧六环-乙醚混合溶剂(体积比为二氯甲烷：1，4-二氧六环：乙醚＝1：4：2)60ml，将2克曲酸，12克棕榈酸溶于此混合溶剂中，最后向此溶液中加入含米根霉脂肪酶0.001克，猪胰脂肪酶0.001克，分子筛3.0克。密封后置于60℃、170rpm的振荡器中反应60h。反应完毕后，12000rpm离心10min，去除酶和固体颗粒，色谱检测分析，底物转化率62％。在反应过程中使用变色硅胶的作用是除去反应体系中的水分。
实施例4
向30ml三角瓶中倒入甲基叔丁基醚-异辛烷混合溶剂(体积比为甲基叔丁基醚：异辛烷＝3：1)15ml，将0.2克曲酸，1.0克棕榈酸溶于其中，最后向此溶液中加入德式根霉脂肪酶0.01克，Novozyme435(来自于南极假丝酵母的固定化脂肪酶)0.03克，Lip2(来自于耶氏酵母)0.02克，分子筛2.0克。密封后置于45℃、170rpm的振荡器中反应25h。反应完毕后，12000rpm离心10min，去除酶和固体颗粒，色谱检测分析，底物转化率93.45％。在反应过程中使用变色硅胶的作用是除去反应体系中的水分。
实施例5
向30ml三角瓶中倒入环己烷-乙酸乙酯-氯仿混合溶液18ml(体积比环己烷：乙酸乙酯：氯仿＝1：3：5)，将0.1克曲酸，1.08克棕榈酸溶于此混合溶剂中，向此溶液中加入变形杆菌脂肪酶0.03克，假单胞菌脂肪酶0.01克，0.01克扩展青霉碱性脂肪酶，分子筛1.5克。密封后置于37℃、170rpm的振荡器中反应18h。反应完毕后，12000rpm离心10min，去除酶和固体颗粒，色谱检测分析，底物转化率91％。在反应过程中使用变色硅胶的作用是除去反应体系中的水分。
实施例1～5比较，实施例1中复合脂肪酶酶制剂为LipozymeRMIM和Novozyme435，在温度为40℃，反应28小时，脂肪酶与反应物曲酸的质量比为0.5:1的反应条件下转化率最高，达到94％，其为最佳实施例。
将实施例1所获得的曲酸双棕榈酸酯进行提纯，提纯方法是：用二氯甲烷萃取2～5次，合并有机相，旋转蒸发干燥得粗产品，再经乙酸乙酯重结晶得提纯后的曲酸双棕榈酸酯，纯度达到99.8％，熔点92-93℃，对提纯后的曲酸双棕榈酸酯做核磁共振氢谱检测，其核磁数据：1HNMR(CDCl3，400MHz)，δ:0.85(t，6H，J＝0.8Hz，2×CH3)；1.23(s，48H，24×CH2)；1.61～1.78(m，4H，2×CH2)；2.43(t，2H，J＝7.2Hz，CH2)；2.62(t，2H，J＝7.4Hz，CH2)；4.89(s，2H，CH2)；6.51(s，1H，CH)；7.87(d，1H，CH)，与文献(沈新安.曲酸双棕榈酸酯的合成[J].化学试剂，2015，37(5):478-480.)报道一致。
对比例1
向50ml三角瓶中倒入20ml丙酮液体，将0.2克曲酸、0.8克棕榈酸溶于20ml丙酮中，然后向三角瓶中加入0.1克Novozyme435，1克变色硅胶。密封后置于45℃、170rpm的振荡器中反应20h。反应完毕后，色谱检测分析结果显示没有产物曲酸双棕榈酸酯的生成，产生部分曲酸单棕榈酸酯。
对比例2
向30ml三角瓶中倒入环己烷-乙酸乙酯-氯仿混合溶液18ml(体积比环己烷：乙酸乙酯：氯仿＝1：3：5)，将0.1克曲酸，1.08克棕榈酸溶于此混合溶剂中，向此溶液中加入0.1克扩展青霉碱性脂肪酶，分子筛1.5克。密封后置于37℃、170rpm的振荡器中反应32h。反应完毕后，12000rpm离心10min，去除酶和固体颗粒，色谱检测分析，结果显示少量曲酸双棕榈酸酯的生成，大部分曲酸转化为单棕榈酸酯。
对比例3
向50ml三角瓶中倒入丙酮20ml，将0.05克曲酸，0.25克棕榈酸溶于此混合溶剂中，最后向此溶液中加入含枯草杆菌脂肪酶固定化细胞0.5克，变色硅胶0.8克。密封后置于35℃、170rpm的振荡器中反应30h。反应完毕后，12000rpm离心10min，去除酶和固体颗粒，色谱检测分析，分析结果显示无产物曲酸双棕榈酸酯生成，仅仅有曲酸单棕榈酸酯生成。
对比例4
向100ml三角瓶中倒入二氧六环-丙酮混合溶剂(体积比为1，4-二氧六环：丙酮＝1：4)50ml，将1.5克曲酸，12克棕榈酸溶于此混合溶剂中，最后向此溶液中加入米根霉脂肪酶0.2克，分子筛4.0克。密封后置于35℃、170rpm的振荡器中反应45h。反应完毕后，12000rpm离心10min，去除酶和固体颗粒，色谱检测分析，分析结果显示少量产物曲酸双棕榈酸酯生成，主要产物为曲酸单棕榈酸酯。
由对比例1～4可看出，单脂肪酶作为催化剂制备出的产物为曲酸单棕榈酸酯，并不能得到本发明的曲酸双棕榈酸酯。本发明给出一种生物酶法制备曲酸双棕榈酸酯的方法，采用多种复合脂肪酶作为催化剂，降低对反应设备的要求，同时大幅度降低反应后的产物处理方面成本，具有温和高效、环保、成本低，原料转化率高等优点，减少了反应步骤，降低生产成本，具有很高的工业应用和经济价值。
上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利保护范围中。

Claims (10)

1.复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法，其特征在于，将曲酸和棕榈酸置于无水有机溶剂中，加入作为酯化反应催化剂的复合脂肪酶酶制剂，所述曲酸和所述棕榈酸酯化生成曲酸双棕榈酸酯。
2.根据权利要求1所述的复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法，其特征在于，所述复合脂肪酶酶制剂选自碱杆菌属脂肪酶、枯草杆菌脂肪酶、来自胰和肝脏的脂肪酶、假丝酵母属脂肪酶、根霉菌属脂肪酶、毛霉属脂肪酶和假单胞细菌属脂肪酶中的两种或多种。
3.根据权利要求2所述的复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法，其特征在于，所述复合脂肪酶酶制剂为LipozymeRMIM和Novozyme435。
4.根据权利要求1所述的复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法，其特征在于，所述曲酸与所述棕榈酸的质量比为1:3.6～1:10.8。
5.根据权利要求1所述的复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法，其特征在于，所述脂肪酶与反应物曲酸的质量比为0.001:1～0.5:1。
6.根据权利要求1所述的复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自石油醚、正己烷、环己烷、异戊烷、丙酮、氯仿、二氯甲烷、无水乙醚、四氢呋喃、1,4-二氧六环、甲苯、异辛烷、异丙醚和甲基叔丁基醚中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法，其特征在于，所述复合脂肪酶酶制剂催化反应时间为18～60小时，温度为25℃～60℃。
8.根据权利要求7所述的复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法，其特征在于，所述复合脂肪酶酶制剂催化反应时间为25～45小时，温度为35℃～45℃。
9.根据权利要求7所述的复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法，其特征在于，所述催化反应中添加用于除去水分的分子筛或硅胶。
10.根据权利要求1所述的复合酶法制备曲酸双棕榈酸酯的制备方法，其特征在于，所述曲酸双棕榈酸酯的提纯方法是：将所述曲酸双棕榈酸酯用二氯甲烷萃取2～5次，合并有机相，旋转蒸发干燥得粗产品，再经乙酸乙酯重结晶得提纯后的曲酸双棕榈酸酯。
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