CN105287509A - 一种mek激酶抑制剂 - Google Patents
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Abstract
本发明一种MEK激酶抑制剂，其是一种具有功能类全的香豆素类化合物，并主要采用Pechmann等反应进行了合成；与阳性药U0126相比，部分化合物表现出良好的MEK结合活性、对非活化MEK的抑制活性，以及抗A375黑色素瘤细胞和HT-29结肠癌细胞增殖的活性，具有被开发为抗肿瘤药物；化合物对MEK激酶的抑制作用主要体现在对非活化MEK磷酸化过程的抑制，而对磷酸化MEK对下游底物ERK磷酸化过程的抑制作用较弱。
Description
技术领域
本发明是属于一类新结构类型香豆素类化合物，具体地是一种MEK激酶抑制剂。并主要采用Pechmann等反应进行了合成；与阳性药U0126相比，部分化合物表现出良好的MEK结合活性、对非活化MEK的抑制活性，以及抗A375黑色素瘤细胞和HT-29结肠癌细胞增殖的活性，具有被开发为抗肿瘤药物。
背景技术
Ras/Raf/MEK/ERK信号通路是丝裂原活化蛋白激酶通路（MAPK）中的一个重要家族，主要参与细胞发育、生长、分化等重要过程，其活性持续上调与肿瘤的发生密切相关。MEK激酶是ERK通路的核心，具有独特的结构和功能特点，在该通路中起关键的承上启下作用。
参考对比发明专利激酶抑制剂，专利号为201080049613.4，其公开了一组新蛋白激酶抑制剂(吡啶并[4，3-d]嘧啶-5-酮衍生物)及其药学上可接受的盐，可用于治疗细胞增殖性疾病或障碍性疾病，如癌症、自身免疫性疾病、感染、心血管疾病和神经退行性疾病和障碍性疾病。本发明提供了用于合成蛋白激酶抑制剂化合物的方法及该化合物的给药方法。本发明还提供了包含至少一种该蛋白激酶抑制剂化合物以及适用于该化合物的药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的药物制剂。本发明还提供了在吡啶并[4，3-d]嘧啶-5-酮衍生物的合成过程所产生的有用中间体。
就目前所知，只有MEK能激活ERK，ERK也是MEK的唯一底物，这一点是非常特别的，预示着MEK抑制剂阻断ERK通路的作用将是高度特异性的。大部分已报道的MEK抑制剂属于ATP非竞争性变构抑制剂，其结构大多具有二芳基胺骨架，本文设计并合成了一系列以香豆素为母核的新型ATP非竞争性MEK变构抑制剂，并对它们进行了活性评价，结果显示这类化合物具有良好的MEK结合活性、MEK抑制活性及抗肿瘤作用。
发明内容
本发明提供了一种MEK激酶抑制剂，一类新结构类型的香豆素类化合物，并主要采用Pechmann等反应进行了合成，同时对不同位点进行了结构衍生和修饰。化合物对MEK激酶的抑制作用主要体现在对非活化MEK磷酸化过程的抑制，而对磷酸化MEK对下游底物ERK磷酸化过程的抑制作用较弱。
本发明采用如下技术方案。
本发明采用香豆素化合物G8935与MEK结合，用对接软件将其与MEK进行对接，并将结合模式与二芳基胺类抑制剂PD318088，并将结合模式与二芳基胺类抑制剂PD318088进行了比较，发现两者打分值相似，G8935与PD318088的重叠度非常高，而且C3位苄基占据新疏水口袋，是香豆素类的新结合点。因此我们在此基础上设计了一系列3位、4位和7位为不同取代基的香豆素衍生物并进行了合成。
在一个方面，本发明采用以烷酰基乙酸乙酯为原料，与溴苄或对氟溴苄在碱性条件下应，制备3-苄基烷酰乙酸乙酯或3-取代苄基烷酰乙酸乙酯，然后与间苯二酚通过Pechmann应制备7-羟基香豆素中间体，最后与酰氯反应得到目标产物。
在一个方面，本发明采用HTRF的方法检测了化合物与磷酸化MEK1的结合能力。采用384孔板，加入ActiveGST-MEK1，Eu-Anti-GST，Kinasetracer236和不同浓度的待测化合物，采用酶标仪检测信号并对数据进行处理。所测99个化合物中，共发现25个化合物具有与磷酸化MEK1结合能力，IC50值最低达到54.57nM（M29）。
在另一方面，本发明同样采用HTRF方法检测化合物对磷酸化MEK1的抑制作用，加入化合物，inactiveERK2，activeMEK1，ATP，然后加入抗体MAbAnti-phosphop44/42-K和MAbAntiGST-XL665，采用酶标仪检测信号并对数据进行处理。实验重复3次。结果显示化合物对磷酸化MEK1的抑制作用的IC50在10μM左右，因此化合物虽然与磷酸化的MEK1有较强的结合能力，但是并不能在底物ERK存在的环境中，影响到磷酸化MEK对ERK的磷酸化作用。
在另一方面，本发明同样采用HTRF方法，检测化合物对非磷酸化MEK1的抑制作用。加入化合物，activeBRAF，inactiveMEK1，ATP，然后加入抗体MAbAnti-phosphoMEK1/2-K和MAbAntiGST-XL665，采用酶标仪检测信号并对数据进行处理。实验重复3次。结果显示M2、M4、M5、M29、M56对非磷酸化MEK1的抑制作用较高，活性接近或高于阳性对照药U0126。
具体实施方式
化合物与磷酸化MEK1的结合活性测试结果显示R1的活性顺序为：
N(CH3)2CO>MeCO,EtCO>PrCO>N(Et)2CO，其他取代基如t-BuCO，BuCO，PhCO，Ts，PhSO2，OH，OCH3取代时都无活性。活性最好的化合物是M29，M29与MEK1的对接结果。香豆素环的羰基与Val211、Ser212主链酰胺形成重要氢键，氨基甲酸酯的羰基与DFG序列中Asp208主链形成氢键，而且R2位苄基占据由Ile216,Phe209,Arg189和Asp190形成的疏水口袋。化合物与非磷酸化MEK1的抑制作用实验和化合物抗黑色素瘤细胞增殖作用实验，以及抗结肠癌细胞增殖作用实验结果均显示化合物M2、M4、M5、M29、M56的活性较好，而这些化合物R1均为N,N-二甲基甲酰氧基，说明R1非常重要，N,N-二甲基甲酰氧基在化合物与MEK作用的过程中产生了至关重要的影响。这可能与结构中存在氮原子有关。因为氮具有孤对电子，可以和溶液中的水分子形成氢键，从而增强了化合物在水中的溶解性。
作为新型的非二芳基胺类MEK变构抑制剂，这类化合物显示出良好的MEK抑制作用及抗肿瘤细胞增殖作用。化合物M2、M4、M5、M29、M56在体外实验中表现出良好的MEK结合活性、135对非磷酸化MEK的抑制活性，在体内细胞实验中表现出与阳性药U0126相当甚至更高的抗A375黑色素瘤细胞和HT-29结肠癌细胞增殖的活性，因此有可能成为非常有潜力的抗肿瘤药，用于肿瘤疾病的治疗，有广阔的应用价值。化合物对MEK的抑制作用主要体现在对非磷酸化MEK磷酸化过程的抑制，而对磷酸化MEK对下游底物ERK磷酸化过程的抑制作用较弱。进一步的结构优化及药动学、药效学研究、作用机制方面的研究工作正在进行。
Claims (5)
1.一种MEK激酶抑制剂，其特征在于，香豆素化合物G8935与MEK结合，用对接软件将其与MEK进行对接，并将结合模式与二芳基胺类抑制剂PD318088，并将结合模式与二芳基胺类抑制剂PD318088进行了比较，发现两者打分值相似，G8935与PD318088的重叠度非常高，而且C3位苄基占据新疏水口袋，是香豆素类的新结合点，在此基础上设计了一系列3位、4位和7位为不同取代基的香豆素衍生物并进行了合成。
2.根据权利要求1所述的一种MEK激酶抑制剂，其特征在于，本发明采用以烷酰基乙酸乙酯为原料，与溴苄或对氟溴苄在碱性条件下应，制备3-苄基烷酰乙酸乙酯或3-取代苄基烷酰乙酸乙酯，然后与间苯二酚通过Pechmann应制备7-羟基香豆素中间体，最后与酰氯反应得到目标产物。
3.根据权利要求2所述的一种MEK激酶抑制剂，其特征在于，本发明采用HTRF的方法检测了化合物与磷酸化MEK1的结合能力，采用384孔板，加入ActiveGST-MEK1，Eu-Anti-GST，Kinasetracer236和不同浓度的待测化合物，采用酶标仪检测信号并对数据进行处理；所测99个化合物中，共发现25个化合物具有与磷酸化MEK1结合能力，IC50值最低达到54.57nM（M29）。
4.根据权利要求2所述的一种MEK激酶抑制剂，其特征在于，本发明同样采用HTRF方法检测化合物对磷酸化MEK1的抑制作用，加入化合物inactiveERK2，activeMEK1，ATP，然后加入抗体MAbAnti-phosphop44/42-K和MAbAntiGST-XL665，采用酶标仪检测信号并对数据进行处理；实验重复3次结果显示化合物对磷酸化MEK1的抑制作用的IC50在10μM左右，因此化合物虽然与磷酸化的MEK1有较强的结合能力，但是并不能在底物ERK存在的环境中，影响到磷酸化MEK对ERK的磷酸化作用。
5.根据权利要求2所述的一种MEK激酶抑制剂，其特征在于，本发明同样采用HTRF方法，检测化合物对非磷酸化MEK1的抑制作用；加入化合物，activeBRAF，inactiveMEK1，ATP，然后加入抗体MAbAnti-phosphoMEK1/2-K和MAbAntiGST-XL665，采用酶标仪检测信号并对数据进行处理；实验重复3次结果显示M2、M4、M5、M29、M56对非磷酸化MEK1的抑制作用较高，活性接近或高于阳性对照U0126。
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2014
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