CN105284740A - 快速鉴别大型溞幼溞性别的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种快速鉴别大型溞幼溞性别的方法，将新生幼溞放置于诱导简易装置中的试管内，向试管内加入16.5cm高的GFID培养基，新生幼溞在GFID培养基中适应1h，将试管底部以上2.5cm部分称为B体系，试管液面以下14cm部分称为A体系；把诱导简易装置在光强为30μE/(m2.s)、温度为20℃条件下放置24h，置于黑暗环境中5min后，每隔1min分别对进入A体系或B体系中的雄溞与雌溞进行统计，计数20min，并累计该时段内进入A体系或B体系的雄溞或雌溞数量，结果为所有雌溞进入A体系，所有雄溞进入B体系。本发明可以快速鉴别新生幼溞的性别，解决新生幼溞性别鉴别工作量大、耗时过长的问题。

Description

快速鉴别大型溞幼溞性别的方法
技术领域
本发明涉及大型溞生态毒理测试，具体地指一种快速鉴别大型溞幼溞性别的方法。
背景技术
生态毒理测试技术已经广泛地应用于新老化学品的生态风险评价。随着欧盟REACH法规的实施，对进入欧盟的化学品生态安全的要求越来越严格，我国的化工产品出口面临着挑战，对化学品进行严谨的生态毒理及安全评价是我国的化工产品走向国际化的前提，因此生态毒理及安全评价技术显得尤为重要，对其技术水平的要求也越来越高。国家环保局化学品登记中心编写了《化学品测试方法》来规范化与标准化各生态毒理与安全评价测试机构的生态毒理测试方法。但是实际操作中发现部分生态毒理测试技术仍然存在一定的问题，比如测试数据及测试结果尚未得到国际互认、实验过程繁琐、测试周期长等，各生态毒理测试技术还有待进一步的完善与改进。
大型溞作为国际公认的标准试验生物，大型溞生态毒理测试已经开展多年，美国环保局在1978年就将大型溞毒理测试定为水体毒性试验的必测项目。20世纪80年代，大型溞毒理测试得到了很大的重视和发展，大型溞繁殖、生长等慢性毒理试验逐步开展起来。到了20世纪90年代大型溞毒理测试技术得到更广泛的应用，用于评价工业废水、农药、化学药品和水中沉积物对水环境的污染，为制定各种水质标准提供了科学依据。欧洲经济合作与发展组织(OECD)自从20世纪80年代建立了溞类毒性测试的化学品测试导则后，仍在不断对溞类毒性测试方法进行改进与完善。到目前为止OECD对溞类毒性测试的化学品测试导则已作了三次修订，修改的地方主要包括测试的溞类品种、化学品的暴露时间、测试的大型溞总数量及组数、测试培养基与喂养条件等方面。大型溞生态毒理测试技术具有广泛的技术前景，包括大型溞急性毒性试验与大型溞繁殖试验。OECD最新标准规定，大型溞繁殖试验中必须对新生幼溞的雌雄进行鉴定并确定新生幼溞的性别比(OECDTestGuidelinesProgramme.ReportsoftheworkshopontheDaphniamagnaPilotRingTest,ShelffieldUniversity,U.K.,20-21March1993.)。大型溞个体较小(体长1.7-4.8mm)，雌雄无法肉眼分辨，要对试验过程中的大量新生幼溞进行雌雄鉴别并计数是非常繁琐、耗时的工作，如何快速而准确地对大量新生幼溞进行雌雄鉴定成为大型溞生态毒理测试技术的技术难点。
本发明提供一种快速鉴别大型溞幼溞性别的方法，这种方法解决新生幼溞雌性与雄性鉴别工作量大、耗时过长的问题，达到减少人工工作量和降低测试成本的目的，可应用于快速统计雌性幼溞和雄性幼溞的数量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速鉴别大型溞幼溞性别的方法，这种方法解决新生幼溞雌性与雄性鉴别工作量大、耗时过长的问题，达到减少人工工作量和降低测试成本的目的，可应用于快速统计雌性幼溞和雄性幼溞的数量。
为实现上述目的，本发明提供的一种快速鉴别大型溞幼溞性别的方法，包括以下步骤：
1)将待鉴定的新生雌性和/或雄性幼溞放置于诱导简易装置中的试管内，向试管内加入16.5cm高的GFID培养基，新生雌性和/或雄性幼骚在GFID培养基中适应1h，将试管底部以上2.5cm部分称为B体系，试管液面以下14cm部分称为A体系，其中GFID培养基包括浓度分别为192mg/LNaHCO3、120mg/LCaSO4·2H2O、120mg/LMgSO4、8mg/LKCl，其pH值和硬度分别为7.6～8.0、160～180mgCaCO3/L；
2)将步骤1)中的试管放置于诱导简易装置的试管架上，把诱导简易装置在光照强度为30μE/(m2.s)、温度为20℃条件下放置24h；
3)利用诱导简易装置的黑色塑料膜将经过步骤2)处理的新生幼溞置于黑暗环境中5min后，每隔1min分别对进入A体系或B体系中的雄性幼溞与雌性幼溞进行统计，并累计20min内进入A体系或B体系中的雄性幼溞与雌性幼溞数量；
4)步骤3)的统计结果为所有雌性幼溞进入A体系，所有雄性幼溞进入B体系。
在上述方案中，所述步骤1)中，待鉴定的新生雄性幼溞是大型溞在温度为4℃、种群密度为10只/100mL培养液、喂食浓度为0.2mgC/(溞·d)、光照周期为12h、黑暗处理时间为12h的诱导条件下进行有性生殖得到的。大型溞在这样的诱导条件下，会改变它们的生殖方式进行有性生殖，产生大量的雄性幼溞，为幼溞性别的快速鉴别方法提供试验材料。
在上述方案中，所述培养液为M4培养液，所述M4培养液包括浓度分别为2.8595mg/LH3BO3、0.3605mg/LMnCl2·4H2O、0.306mg/LLiCl、0.071mg/LRbCl、0.152mg/LSrCl2·6H2O、0.016mg/LNaBr、0.063mg/LNa2MoO4·2H2O、0.01675mg/LCuCl2·2H2O、0.013mg/LCaCl2·2H2O、0.01mg/LZnCl2、0.00325mg/LCoCl2·6H2O、0.00219mg/LKI、0.000575mg/LNa2SeO3、2.5mg/LNH4VO3、0.9955mg/LNa2EDTA·2H2O、293.8mg/LFeSO4·7H2O、123.3mg/LMgSO4·7H2O、5.8mg/LKCl、64.8mg/LNaHCO3、10mg/LNa2SiO3·9H2O、0.274mg/LKH2PO4、0.143mg/LNaNO3、0.184mg/LK2HPO4、0.075mg/L盐酸硫胺、0.001mg/L氰钴胺、0.00075mg/L钙长石。
在上述方案中，所述诱导简易装置包括光照培养箱，所述光照培养箱内放置有试管架，在所述试管架周围包裹有黑色塑料膜，所述试管架上放置有6支的试管，所述光照培养箱在试管上方处设置有光照强度可以调整的光源。幼溞性别的快速鉴别方法采用上述装置，操作简便，也利于光照强度、温度等参数的控制。
在上述方案中，所述试管是口径为2.5cm、长为20cm的玻璃试管。
在上述方案中，所述光源设置在试管顶端上方15cm处。
本发明的原理在于：M4培养液富含多种营养物质，可能会影响大型溞对环境因子的行为反应，如光照强度和温度等，因此先将待鉴定雌雄的新生幼溞在GFID培养基先适应1h，消除M4培养液对鉴别结果的影响；新生雌性幼溞与新生雄性幼溞对光照强度、温度等环境因子变化的应急反应不相同，因此先将待鉴定雌雄的新生幼溞在光照强度为30μE/(m2.s)、温度为20℃条件下放置24h，接着黑暗环境中5min后，所有雌性幼溞进入A体系，所有雄性幼溞进入B体系。
本发明的有益效果在于：这种方法可以快速鉴别新生幼溞的性别，解决新生幼溞雌性与雄性鉴别工作量大、耗时过长的问题，达到减少人工工作量和降低测试成本的目的，可应用于快速统计雌性幼溞和雄性幼溞的数量。
附图说明
图1为诱导简易装置的结构示意图。
图中：光照培养箱1；试管架2；黑色塑料膜3；试管4；光源5。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但该实施例不应该理解为对本发明的限制。
本发明快速鉴别大型溞幼溞性别的方法所使用的新生雄性幼溞是大型溞通过有性繁殖得到的。我们先进行筛选大型溞有性繁殖的最佳诱导条件，以产生大量的雄性幼溞，为幼溞性别的快速鉴别方法提供试验材料。我们设计多组如表1所示的试验，结果显示大型溞在温度为4℃、种群密度为10只/100mL培养液、喂食浓度为0.2mgC/(溞·d)、光照周期为12h、黑暗处理时间为12h的诱导条件下进行有性生殖，产生数量最多的雄性幼溞，为幼溞性别的快速鉴别方法提供试验材料。
本发明快速鉴别大型溞幼溞性别的方法所使用的诱导简易装置是我们自行设计的，如图1所示，其包括光照培养箱1，光照培养箱1内放置有试管架2，在试管架2周围包裹有黑色塑料膜3，试管架2上放置有六支口径为2.5cm、长为20cm的玻璃试管4，光照培养箱1在试管4顶端上方15cm处设置有光照强度可以调整的光源5。
实施例1
一种快速鉴别大型溞幼溞性别的方法，包括以下步骤：
1)诱导简易装置左边三支试管4分别放置有10只24h内4℃诱导产生的新生雄性幼溞，右边三支试管4分别放置有10只24h内4℃诱导产生的新生雌性幼溞。向试管内加入16.5cm高的GFID培养基，新生幼溞在GFID培养基中适应1h，将试管4底部以上2.5cm部分称为B体系，试管4液面以下14cm部分称为A体系，其中GFID培养基包括浓度分别为192mg/L、120mg/L、120mg/L、8mg/L的NaHCO3、CaSO4·2H2O、MgSO4、KCl，其pH值和硬度分别为7.6～8.0、160～180mgCaCO3/L；
2)将步骤1)中的试管4放置于诱导简易装置的试管架2上，把诱导简易装置在光照强度为30μE/(m2.s)、温度为20℃条件下放置24h；
3)利用诱导简易装置的黑色塑料膜3将经过步骤2)处理的新生幼溞置于黑暗环境中5min后，每隔1min分别对进入A体系或B体系中的雄性幼溞与雌性幼溞进行统计，并累计20min内进入A体系或B体系中的雄性幼溞与雌性幼溞数量。结合体视显微镜，通过观察新生幼溞的第一触角特征区分雌雄。
4)步骤3)的统计结果如下：左边三支试管4中的30只雄性幼溞全部进入B体系；而右边三支试管4中的30只雌性幼溞全部进入A体系。
实施例2
一种快速鉴别大型溞幼溞性别的方法，包括以下步骤：
1)诱导简易装置左边三支试管4分别放置有5只24h内4℃诱导产生的新生雄性幼溞和5只24h内4℃诱导产生的新生雌性幼溞。向试管4内加入16.5cm高的GFID培养基，新生幼溞在GFID培养基中适应1h，将试管4底部以上2.5cm部分称为B体系，试管4液面以下14cm部分称为A体系，其中GFID培养基包括浓度分别为192mg/L、120mg/L、120mg/L、8mg/L的NaHCO3、CaSO4·2H2O、MgSO4、KCl，其pH值和硬度分别为7.6～8.0、160～180mgCaCO3/L；
2)将步骤1)中的试管4放置于诱导简易装置的试管架2上，把诱导简易装置在光照强度为30μE/(m2.s)、温度为20℃条件下放置24h；
3)利用诱导简易装置的黑色塑料膜3将经过步骤2)处理的新生幼溞置于黑暗环境中5min后，每隔1min分别对进入A体系或B体系中的雄性幼溞与雌性幼溞进行统计，并累计20min内进入A体系或B体系中的雄性幼溞与雌性幼溞数量。结合体视显微镜，通过观察新生幼溞的第一触角特征区分雌雄。
4)步骤3)的统计结果如下：无论哪只试管4，所有的雄性幼溞全部进入B体系，所有雌性幼溞全部进入A体系。
实施例3
一种快速鉴别大型溞幼溞性别的方法，包括以下步骤：
1)诱导简易装置左边三支试管4分别放置有10只24h内压裂返排液诱导产生的新生雄性幼溞，右边三支试管4分别放置有10只24h内压裂返排液诱导产生的新生雌性幼溞。向试管内加入16.5cm高的GFID培养基，新生幼骚在GFID培养基中适应1h，将试管4底部以上2.5cm部分称为B体系，试管4液面以下14cm部分称为A体系，其中GFID培养基包括浓度分别为192mg/L、120mg/L、120mg/L、8mg/L的NaHCO3、CaSO4·2H2O、MgSO4、KCl，其pH值和硬度分别为7.6～8.0、160～180mgCaCO3/L；
2)将步骤1)中的试管4放置于诱导简易装置的试管架2上，把诱导简易装置在光照强度为30μE/(m2.s)、温度为20℃条件下放置24h；
3)利用诱导简易装置的黑色塑料膜3将经过步骤2)处理的新生幼溞置于黑暗环境中5min后，每隔1min分别对进入A体系或B体系中的雄性幼溞与雌性幼溞进行统计，并累计20min内进入A体系或B体系中的雄性幼溞与雌性幼溞数量。结合体视显微镜，通过观察新生幼溞的第一触角特征区分雌雄。
4)步骤3)的统计结果如下：左边三支试管4中的30只雄性幼溞全部进B体系；而右边三支试管4中的30只雌性幼溞全部进入A体系。
实施例4
一种快速鉴别大型溞幼溞性别的方法，包括以下步骤：
1)诱导简易装置左边三支试管4分别放置有5只24h内压裂返排液诱导产生的新生雄性幼溞和5只24h内压裂返排液诱导产生的新生雌性幼溞。向试管4内加入16.5cm高的GFID培养基，新生幼溞在GFID培养基中适应1h，将试管4底部以上2.5cm部分称为B体系，试管4液面以下14cm部分称为A体系，其中GFID培养基包括浓度分别为192mg/L、120mg/L、120mg/L、8mg/L的NaHCO3、CaSO4·2H2O、MgSO4、KCl，其pH值和硬度分别为7.6～8.0、160～180mgCaCO3/L；
2)将步骤1)中的试管4放置于诱导简易装置的试管架2上，把诱导简易装置在光照强度为30μE/(m2.s)、温度为20℃条件下放置24h；
3)利用诱导简易装置的黑色塑料膜3将经过步骤2)处理的新生幼溞置于黑暗环境中5min后，每隔1min分别对进入A体系或B体系中的雄性幼溞与雌性幼溞进行统计，并累计20min内进入A体系或B体系中的雄性幼溞与雌性幼溞数量。结合体视显微镜，通过观察新生幼溞的第一触角特征区分雌雄。
4)步骤3)的统计结果如下：无论哪只试管4，所有的雄性幼溞全部进B体系，所有雌性幼溞全部进入A体系。
表1大型溞有性生殖的诱导参数
注：培养液为M4培养液，所述M4培养液包括浓度分别为2.8595mg/LH3BO3、0.3605mg/LMnCl2·4H2O、0.306mg/LLiCl、0.071mg/LRbCl、0.152mg/LSrCl2·6H2O、0.016mg/LNaBr、0.063mg/LNa2MoO4·2H2O、0.01675mg/LCuCl2·2H2O、0.013mg/LCaCl2·2H2O、0.01mg/LZnCl2、0.00325mg/LCoCl2·6H2O、0.00219mg/LKI、0.000575mg/LNa2SeO3、2.5mg/LNH4VO3、0.9955mg/LNa2EDTA·2H2O、293.8mg/LFeSO4·7H2O、123.3mg/LMgSO4·7H2O、5.8mg/LKCl、64.8mg/LNaHCO3、10mg/LNa2SiO3·9H2O、0.274mg/LKH2PO4、0.143mg/LNaNO3、0.184mg/LK2HPO4、0.075mg/L盐酸硫胺、0.001mg/L氰钴胺、0.00075mg/L钙长石。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (5)

1.一种快速鉴别大型溞幼溞性别的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)将待鉴定的新生雌性和/或雄性幼溞放置于诱导简易装置中的试管内，向试管内加入16.5cm高的GFID培养基，新生雌性和/或雄性幼骚在GFID培养基中适应1h，将试管底部以上2.5cm部分称为B体系，试管液面以下14cm部分称为A体系，其中GFID培养基包括浓度分别为192mg/L、120mg/L、120mg/L、8mg/L的NaHCO3、CaSO4·2H2O、MgSO4、KCl，其pH值和硬度分别为7.6～8.0、160～180mgCaCO3/L；
2)将步骤1)中的试管放置于诱导简易装置的试管架上，把诱导简易装置在光照强度为30μE/(m2.s)、温度为20℃条件下放置24h；
3)利用诱导简易装置的黑色塑料膜将经过步骤2)处理的新生幼溞置于黑暗环境中5min后，每隔1min分别对进入A体系或B体系中的雄性幼溞与雌性幼溞进行统计，并累计20min内进入A体系或B体系中的雄性幼溞与雌性幼溞数量；
4)步骤3)的统计结果为所有雌性幼溞进入A体系，所有雄性幼溞进入B体系。
2.根据权利要求1所述的快速鉴别大型溞幼溞性别的方法，其特征在于：所述步骤1)中，待鉴定的新生雄性幼溞是大型溞在温度为4℃、种群密度为10只/100mL培养液、喂食浓度为0.2mgC/(溞·d)、光照周期为12h、黑暗处理时间为12h的诱导条件下进行有性生殖得到的。
3.根据权利要求1所述的快速鉴别大型溞幼溞性别的方法，其特征在于：所述诱导简易装置包括光照培养箱(1)，所述光照培养箱(1)内放置有试管架(2)，在所述试管架(2)周围包裹有黑色塑料膜(3)，所述试管架(2)上放置有6支的试管(4)，所述光照培养箱(1)在试管(4)上方处设置有光照强度可以调整的光源(5)。
4.根据权利要求3所述的快速鉴别大型溞幼溞性别的方法，其特征在于：所述试管(4)是口径为2.5cm、长为20cm的玻璃试管。
5.根据权利要求3所述的快速鉴别大型溞幼溞性别的方法，其特征在于：所述光源(5)设置在试管(4)顶端上方15cm处。
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