CN105274186A - 一种无氮培养基及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种无氮培养基，属絮凝剂产生菌技术领域。所述无氮培养基由以下原料及重量份组成：蔗糖5~10重量份，磷酸氢二钠5~10重量份，硫酸镁0.5~1.0重量份，碳酸钙0.1~0.5重量份，三氯化铁0.5~1.0重量份，琼脂18~20重量份，玻璃粉1~2重量份，蒸馏水1000重量份。将富含微生物的原料进行梯度稀释、并采用平板涂布法在无氮培养基上进行均匀涂布，放入到15~40℃的恒温培养箱中培养，待长出菌落后使用牛肉膏蛋白胨培养基经过筛选划线法分离、纯化后的细菌均为具有高效絮凝能力的细菌。利用此方法可以选择性的从各种污水处理厂产生的活性污泥、土壤、底泥、矿山废水等富含微生物的环境中筛选出具有高效絮凝能力的微生物絮凝剂产生菌，该方法工艺简单，工作量小，筛选效率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种无氮培养基及应用，属絮凝剂产生菌技术领域。
背景技术
微生物絮凝剂是利用特定的生物技术，从微生物菌体或其分泌物中提取、纯化、精制而获得的一类具有絮凝活性的高分子化合物。按其来源归类，微生物絮凝剂仍属于天然生物高分子絮凝剂。微生物絮凝剂不但具有传统絮凝剂的特点，而且微生物絮凝剂的特定成分还决定了其具有许多独特的性质和优点：(1)无毒无害，安全性高。(2)能被生物降解，无二次污染。(3)适用范围广，净化效果好。(4)生产和使用成本低。这是其它无机和有机絮凝剂所无法比拟的。
优良的微生物菌种通常是从不同的环境中分离、纯化，进一步筛选后获得。传统的筛选微生物絮凝剂产生菌的方法主要通过稀释平板涂布、平板划线，获得纯培养的微生物，然后将每个纯培养的微生物进行摇瓶培养，测定其发酵液对高岭土是否具有絮凝活性，来确定所培养的纯微生物菌株是否是絮凝剂产生菌，存在着筛选目标不确定、工作量大、周期长、筛选效率低等缺点。
发明专利CN1693444A公开了一种微生物絮凝剂产生菌的筛选方法，在常规培养基中同时添加刚果红（英文名称：Congored，分子式：C32H22N6Na2O6S2）和考马斯亮蓝，采用稀释平板涂布法或稀释混合平板法或平板划线法进行微生物的分离和纯化，待长出单个菌落后，挑取红色的单菌落进行分离纯化。此方法的缺点是：该方法是认为培养基中出现的红色的细菌菌落是具有絮凝性能的微生物，但是这些微生物经过发酵培养后对高岭土的絮凝性能不一定好，有的甚至是没有絮凝能力的，因此依然存在筛选的盲目性，工作量大的问题；认为长出红色菌落的细菌是具有絮凝能力的，那么也会使一些具有高效絮凝能力的细菌因菌落不呈红色而漏选，因此存在筛选的不完整性。
发明专利CN102443541A公开了一种处理生活污水的微生物菌株的筛选方法，直接采用生活污水加入琼脂制备成筛选培养基，然后取生活污水的污泥在该培养基上进行稀释涂布，形成的细菌挑取单菌落到固体培养基上划线纯化，最后将纯化后的细菌处理灭菌后的生活污水，根据COD的去除效率再次进行筛选。此方法的缺点是：该方法的筛选工作量大，且筛选时仅针对生活污水中的COD的去除，应用有一定的局限性。
公开号为CN102154105A、名称为“一种非灭菌筛选微生物絮凝剂产生菌的方法”所述采用一种不经过任何灭菌处理且使用无机氮作为唯一氮源的选择性液体培养基，通过继代培养，淘汰杂菌，从而保留具有明显絮凝效果的菌群。该方法不需要经过任何灭菌过程，则筛选出的微生物絮凝剂产生菌的来源不明确，且需要经过多次培养淘汰杂菌，该方法筛选成本较高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无氮培养基，所述无氮培养基由以下原料及重量份组成：蔗糖5~10重量份，磷酸氢二钠5~10重量份，硫酸镁0.5~1.0重量份，碳酸钙0.1~0.5重量份，三氯化铁0.5~1.0重量份，琼脂18~20重量份，玻璃粉1~2重量份，蒸馏水1000重量份，pH=6.0-9.0。
本发明的另一目的在于提供所述无氮培养基用于筛选微生物絮凝剂产生菌的方法，具体包括以下步骤：将富含微生物的原料进行梯度稀释、并采用平板涂布法在无氮培养基上进行均匀涂布，放入到15~40℃的恒温培养箱中培养，待长出菌落后使用牛肉膏蛋白胨培养基经过平板划线法分离、纯化后的细菌均为具有高效絮凝能力的细菌。
优选的，本发明所述恒温培养箱中培养的时间为3-10d。
本发明所述的牛肉膏蛋白胨培养基是现有的常规培养基。
本发明所述梯度稀释、平板涂布法、平板划线法分离均属于常规方法。
本发明所述富含微生物的原料是指含有多种细菌的活性污泥、土壤、底泥或矿山废水等。
本发明的有益效果：
（1）本发明所述无氮培养基中没有氮元素，可以高效、快速的筛选出具有高效絮凝能力的微生物絮凝剂产生菌，工艺简单，工作量小，筛选效率较高；
（2）本发明所述方法克服传统微生物絮凝产生菌筛选方法的不足，可高效、快速筛选到具有高效絮凝能力的微生物絮凝剂产生菌，工艺简单，工作量小，周期短，筛选效率较高。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
实施例1
本实施例所述无氮培养基由以下原料及重量份组成：蔗糖5g，磷酸氢二钠8g，硫酸镁0.5g，碳酸钙0.1g，三氯化铁0.5g，琼脂18g，玻璃粉1g，蒸馏水1000g，pH=7.0。
将上述原料置于玻璃容器内，摇匀，121℃灭菌30min，制成平板；将从污水处理厂的活性污泥稀释成10-4、10-5、10-6的浓度后在该无氮培养基上进行涂布，放入到35℃培养箱中倒置培养3-5天待平板上长出明显的菌落。
在牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g,蒸馏水1000ml，pH=7.0-7.2）上对这些菌落进行划线分离得到单个菌落，挑选单个菌落，“Z”字型接入斜面，35℃培养24小时后，放入冰箱中4℃保藏。
选取多个单个菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上分别进行扩大培养，以3%的接种量放入到100ml/250ml的通用发酵培养基（葡萄糖10g，磷酸氢二钾5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，尿素0.5g，酵母膏0.5g,蒸馏水1.0L，pH=7.0）中，放在30℃、150r/min的恒温振荡器中培养24h后，测定发酵液对高岭土悬浊液的絮凝活性。
对高岭土悬浊液的絮凝活性的测定方法为：在25ml比色管中加入10ml5g/L高岭土悬液，再加入1ml1%CaCl2溶液，然后加入1ml发酵液，摇匀，静置5min，测A550。对照为未接种的液体培养基；絮凝率E(%)=(A0-A)/A0*100%，式中：A0为对照在550nm处的吸光度值；A为样品在550nm处的吸光度值；实验结果表明此细菌的的絮凝率达到87.93%，经过对其培养条件进行优化，则絮凝性能更好。
经过16SrDNA对此菌株进行鉴定，鉴定结果表明其为克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）。用此克雷伯氏菌对含Pb重金属废水进行处理，其对Pb的去除率达到73%以上。
实施例2
本实施例所述无氮培养基由以下原料及重量份组成：蔗糖10g，磷酸氢二钠8g，硫酸镁0.7g，碳酸钙0.3g，三氯化铁0.8g，琼脂19g，玻璃粉1.5g，蒸馏水1000g，pH=7.3。
将上述原料置于玻璃容器内，摇匀，121℃灭菌30min，制成平板，将污水处理厂的活性污泥稀释成10-4、10-5、10-6的浓度后在该无氮培养基上进行涂布，放入到35℃培养箱中倒置培养3-5天至平板上待长出明显的菌落。
采用平板划线法，在牛肉膏蛋白胨培养基上对这些菌落进行划线分离得到单个菌落，挑选单个菌落，“Z”字型接入斜面，35℃培养24小时后，放入冰箱中4℃保藏。
将多个单个菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上分别进行扩大培养，以2%的接种量放入到100ml/250ml的通用发酵培养基（葡萄糖20g，磷酸氢二钾0.2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.05g，氯化钠0.05g，酵母膏1.0g，蒸馏水1.0L，pH=7.0）中，放在30℃，150r/min的恒温振荡器中培养24h后，测定发酵液对高岭土悬浊液的絮凝活性。
絮凝活性的测定方法为：在比色管中加入10ml0.5%的高岭土悬液，加入0.5ml1.0%的CaCl2溶液，然后加入1ml的发酵液，调节pH为7.0，摇匀后静置10min，用紫外可见分光光度计测其吸光度。对照为未接种的液体培养基。絮凝率E(%)=(A0-A)/A0*100%，式中：A0为对照在550nm处的吸光度值；A为样品在550nm处的吸光度值。实验结果表明絮凝活性较高的细菌的絮凝率达到78.76%，经过对其培养条件进行优化，则絮凝率可达到90.78%。
经过16SrDNA对此菌株进行鉴定，鉴定结果为巨大芽孢杆菌（Bacillusmegaterium）。用此巨大芽孢杆菌对含铅重金属废水和含铜重金属废水进行处理，其对铅和铜的去除率均可达到90%以上。
实施例3
本实施例所述无氮培养基由以下原料及重量份组成：蔗糖8g，磷酸氢二钠10g，硫1.0g，碳酸钙0.5g，三氯化铁1.0g，琼脂20g，玻璃粉2g，蒸馏水1000g，pH=7.5。
将上述原料置于玻璃容器内，摇匀，121℃灭菌30min，制成平板；取矿山周围土壤表层以下5-10cm的土样，取1g加入到含有99ml无菌蒸馏水的玻璃瓶中稀释成10-2的土壤悬液，用无菌移液管取10-2的土壤悬液1ml至含有9ml无菌水中稀释成10-3土壤悬液，依次稀释成10-4、10-5、10-6的土壤悬液后在该无氮培养基上进行涂布，放入到30℃培养箱中倒置培养3-5天待平板上长出明显的菌落。
在牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g,蒸馏水1000ml，pH=7.0-7.2）上对这些菌落进行划线分离得到单个菌落，挑选单个菌落，“Z”字型接入斜面，35℃培养24小时后，放入冰箱中4℃保藏。
选取多个单个菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上分别进行扩大培养，以3%的接种量放入到100ml/250ml的通用发酵培养基（葡萄糖10g，磷酸氢二钾5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，尿素0.5g，酵母膏0.5g，蒸馏水1.0L，pH=7.0）中，放在30℃、150r/min的恒温振荡器中培养24h后，测定发酵液对高岭土悬浊液的絮凝活性。
对高岭土悬浊液的絮凝活性的测定方法为：在25ml比色管中加入10ml5g/L高岭土悬液，再加入1ml1%CaCl2溶液，然后加入1ml发酵液，摇匀，静置5min，测A550。对照为未接种的液体培养基；絮凝率E(%)=(A0-A)/A0*100%，式中：A0为对照在550nm处的吸光度值；A为样品在550nm处的吸光度值；实验结果表明此细菌的的絮凝率达到81.6%，经过对其培养条件进行优化，则絮凝性能更好。
经过16SrDNA对此菌株进行鉴定，鉴定结果表明其为阴沟肠杆菌（Enterobactercloacae）。用此阴沟肠杆菌对含Cd重金属废水进行处理，其对Cd的去除率达到80%以上。
实施例4
本实施例所述无氮培养基由以下原料及重量份组成：蔗糖6g，磷酸氢二钠7g，硫酸镁0.6g，碳酸钙0.2g，三氯化铁0.7g，琼脂18g，玻璃粉1g，蒸馏水1000g，pH=6.0。
将上述原料置于玻璃容器内，摇匀，121℃灭菌30min，制成平板；将取回的某矿山废水稀释成10-4、10-5、10-6的浓度后在该无氮培养基上进行涂布，放入到15℃培养箱中倒置培养5-10天待平板上长出明显的菌落。
在牛肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g,蒸馏水1000ml，pH=7.0-7.2）上对这些菌落进行划线分离得到单个菌落，挑选单个菌落，“Z”字型接入斜面，35℃培养24小时后，放入冰箱中4℃保藏。
选取多个单个菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上分别进行扩大培养，以3%的接种量放入到100ml/250ml的通用发酵培养基（葡萄糖10g，磷酸氢二钾5g，磷酸二氢钾2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，尿素0.5g，酵母膏0.5g,蒸馏水1.0L，pH=7.0）中，放在30℃、150r/min的恒温振荡器中培养24h后，测定发酵液对高岭土悬浊液的絮凝活性。
对高岭土悬浊液的絮凝活性的测定方法为：在25ml比色管中加入10ml5g/L高岭土悬液，再加入1ml1%CaCl2溶液，然后加入1ml发酵液，摇匀，静置5min，测A550。对照为未接种的液体培养基；絮凝率E(%)=(A0-A)/A0*100%，式中：A0为对照在550nm处的吸光度值；A为样品在550nm处的吸光度值；实验结果表明此细菌的的絮凝率达到80.26%，经过对其培养条件进行优化，则絮凝性能更好。
经过16SrDNA对此菌株进行鉴定，鉴定结果表明其为克雷伯氏菌（Klebsiellasp.）。用此克雷伯氏菌对含Pb重金属废水进行处理，其对Pb的去除率达到75%以上。
实施例5
本实施例所述无氮培养基由以下原料及重量份组成：蔗糖9g，磷酸氢二钠7g，硫酸镁0.9g，碳酸钙0.4g，三氯化铁0.7g，琼脂19g，玻璃粉1.5g，蒸馏水1000g，pH=9.0。
将上述原料置于玻璃容器内，摇匀，121℃灭菌30min，制成平板，取某河流底泥1g加入到含有99ml无菌蒸馏水的玻璃瓶中稀释成10-2的悬液，用无菌移液管取10-2的悬液1ml至含有9ml无菌水中稀释成10-3的悬液，依次稀释成10-4、10-5、10-6的悬液后在该无氮培养基上进行涂布，放入到40℃培养箱中倒置培养3-5天至平板上待长出明显的菌落。
采用平板划线法，在牛肉膏蛋白胨培养基上对这些菌落进行划线分离得到单个菌落，挑选单个菌落，“Z”字型接入斜面，35℃培养24小时后，放入冰箱中4℃保藏。
将多个单个菌落在牛肉膏蛋白胨培养基上分别进行扩大培养，以2%的接种量放入到100ml/250ml的通用发酵培养基（葡萄糖20g，磷酸氢二钾0.2g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.05g，氯化钠0.05g，酵母膏1.0g，蒸馏水1.0L，pH=7.0）中，放在30℃，150r/min的恒温振荡器中培养24h后，测定发酵液对高岭土悬浊液的絮凝活性。
絮凝活性的测定方法为：在比色管中加入10ml0.5%的高岭土悬液，加入0.5ml1.0%的CaCl2溶液，然后加入1ml的发酵液，调节pH为7.0，摇匀后静置10min，用紫外可见分光光度计测其吸光度。对照为未接种的液体培养基。絮凝率E(%)=(A0-A)/A0*100%，式中：A0为对照在550nm处的吸光度值；A为样品在550nm处的吸光度值。实验结果表明絮凝活性较高的细菌的絮凝率达到73.85%，经过对其培养条件进行优化，则絮凝率可达到80%以上。
经过16SrDNA对此菌株进行鉴定，鉴定结果为阴沟肠杆菌（Enterobactercloacae）。用此阴沟肠杆菌对含铅重金属废水进行处理，其对铅的去除率均可达到75%以上。
Claims (3)
1.一种无氮培养基，其特征在于：所述无氮培养基由以下原料及重量份组成：蔗糖5~10重量份，磷酸氢二钠5~10重量份，硫酸镁0.5~1.0重量份，碳酸钙0.1~0.5重量份，三氯化铁0.5~1.0重量份，琼脂18~20重量份，玻璃粉1~2重量份，蒸馏水1000重量份，pH=6.0-9.0。
2.权利要求1所述无氮培养基用于筛选微生物絮凝剂产生菌的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：将富含微生物的原料进行梯度稀释、并采用平板涂布法在无氮培养基上进行均匀涂布，放入到15~40℃的恒温培养箱中培养，待长出菌落后使用牛肉膏蛋白胨培养基经过平板划线法分离、纯化后的细菌均为具有高效絮凝能力的细菌。
3.权利要求2所述无氮培养基用于筛选微生物絮凝剂产生菌的方法，其特征在于：在恒温培养箱中培养的时间为3-10d。
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|---|---|---|---|---|
| CN115611435A (zh) * | 2022-09-28 | 2023-01-17 | 淮阴工学院 | 一种具备高效吸附和高效转化氮污染物功能的仿生底泥的制备方法 |
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| CN1400195A (zh) * | 2002-09-16 | 2003-03-05 | 贾月田 | 糠醛废渣制生物有机增效肥的制作方法 |
| CN101913614A (zh) * | 2010-07-12 | 2010-12-15 | 河南省岩石矿物测试中心 | 一种利用微生物脱除铝土矿中硅的方法 |
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2015
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