CN105274136A - 一种提高糯米糍荔枝坐果率的菌液及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及农业技术领域，具体公开了一种提高糯米糍荔枝坐果率的菌液及其方法，所述菌液为含有沉默表达载体的<i>Lc</i><i>CIF</i>基因片段转化获得的农杆菌工程菌，利用所述菌液浸染植株，可促进液态胚乳早期发育，从而提高糯米糍荔枝的坐果率的技术。该方法适合工厂化生产调控剂，成本低，属于短期基因表达干扰技术，无残留，不影响中后期果实生长发育，有较大的生产应用前景。

Description

一种提高糯米糍荔枝坐果率的菌液及其方法

技术领域

本发明涉及农业技术领域，更具体地，涉及一种提高糯米糍荔枝坐果率的菌液及其方法。

背景技术

糯米糍是主产于广东广州、东莞和深圳等地的优良荔枝品种，果实鲜红色，较大，单果重26.5±3.3g，果肉半透明，软滑多汁，味浓甜微带香气，种子多退化，可食率达78..9±2.9%，可溶性固形物18～21%，深受国内外消费者喜爱。然而，相对其他荔枝品种来说，坐果低而且不稳是糯米糍生产上的一个突出问题，严重影响了该品种的产量和经济效率。一般荔枝的坐果率达不到雌花数量的5%，而糯米糍的更低。最主要的原因是糯米糍果实在发育的早期胚乳败育使得坐果不良。荔枝种子属于无胚乳种子，在种子发育前期种腔充满液态胚乳随着胚的发育胚乳逐渐被胚吸收消耗，胚乳富含各种激素使种子成为代谢中心，吸引养份供本身和果实的其他部分生长发育之用，所以胚乳的发育直接影响到胚的发育进程。

与其它胚乳早期发育良好的半败育品种如桂味、妃子笑和绿荷包等相比，糯米糍的早期坐果率明显低，提高糯米糍的早期坐果率是提高糯米糍产量的重要措施。在生产上一般采用提高树体营养如增施有机肥、喷施保果药剂2，4-D以及减少营养竞争如断根和环割等措施来提高坐果率，农艺保果往往是提高坐果率的有效手段，然而，针对不同树势使用时期较难把握，而2,4-D常有药害和提高裂果率的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一种提高糯米糍荔枝坐果率的菌液及其方法。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

一种提高糯米糍荔枝坐果率的菌液，其特征在于，所述菌液为含有沉默表达载体的LcCIF基因片段转化获得的农杆菌工程菌。

本发明通过病毒介导的基因沉默表达技术，将LcCIF基因和病毒载体结合令LcCIF基因沉默表达，从而促进荔枝液态胚乳早期发育，提高荔枝得坐果率。

优选地，所述LcCIF基因片段的序列如SEQIDNO：1所示。

优选地，所述沉默表达载体为pTRV1和pTRV2。

本发明还提供一种提高糯米糍荔枝坐果率的方法，是利用所述菌液浸染荔枝植株。

优选地，所述荔枝植株为盛花期的植株或花后3周前结有幼果的植株。

优选地，所述菌液的OD₆₀₀为0.5～1.5。

优选地，所示浸染方法为喷洒、浸没。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种提高糯米糍荔枝坐果率的菌液，所述菌液为含有沉默表达载体的LcCIF基因片段转化获得的农杆菌工程菌，利用所述菌液浸染植株，可促进促进液态胚乳早期发育，从而提高糯米糍荔枝的坐果率的技术。该方法适合工厂化生产调控剂，成本低，属于短期基因表达干扰技术，无残留，不影响中后期果实生长发育，有较大的生产应用前景。

附图说明

图1为TRV1(a)和TRV2(b)结构示意图；其中，RdRP为RNA依赖的RNA聚合酶；16K为富含半胱氨酸的16kDa蛋白；Mp为运动蛋白；Cp为衣壳蛋白；MCS为多克隆位点。

图2为实施例2处理组和对照组种子的形态结构。

图3为对比例1菌液处理后结果。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1浸染液制备

一、LcCIF基因片段的克隆

以荔枝LcCIF的500bp左右片段（序列如SEQIDNO：1）设计引物，并在引物前加上与pTRV2的BamHI和SmaI酶切位点同源的15bp的载体序列接头，引物序列见下表1，PCR扩增条件为94℃，2min；98℃，10s，55℃，30s，72℃，30s，30个循环；72℃，10min。取2μl进行琼脂糖凝胶电泳检测，并纯化回收。

二、病毒沉默载体pTRV2（pYL156）的酶切

病毒沉默载体pTRV1(pYL192)，pTRV2（pYL156）结构示意图如图1，选取pTRV2（pYL156）上的BamHI和SmaI两个酶切位点对载体进行双酶切，限制性内切酶选用NEB（NewEnglandBiolabs）公司的BamHIHF和SmaI内切酶。反应体系为：pTRV2质粒1μg，内切酶各1μl，10×CutsmartBuffer5μl，用水补足至50μl。于37℃酶切15分钟，65℃酶失活20分钟。酶切产物经酚氯仿抽提后，经2倍的无水乙醇和1/10体积的NaAc沉淀，用75%的乙醇认真的洗两次后，将乙醇吹干。把酶切后的线性化质粒溶于20μl的双蒸水中备用。

三、重组质粒的提取、连接、转化以及鉴定

利用GibsonAssembly^?MasterMix（NewEnglandBiolabs）对步骤一纯化后的PCR扩增产物和步骤二得到的线性化载体进行连接，具体反应体系为：1μl纯化回收的PCR扩增产物，1μl线性化载体，4μl2×GibsonAssemblyMasterMix，用水补足8μl。50℃反应半小时后取2μl转入50μl大肠杆菌DH5α感受态，测序鉴定结果正确的即为pTRV2-LcCIF重组质粒，扩摇提取质粒。

四、利用冻融法将重组质粒转化农杆菌

取出100μlGV3101农杆菌感受态细胞于冰上解冻，立即加入5μl重组质粒DNA。轻弹，冰上放置30min，液氮中冷冻5min，37℃水浴中温浴5min，冰上2min，加入无抗生素的500μl的YEP（AgrobacteriumGrowthMedium）液体培养基，28℃摇3～4h。3000r，离心3min，去培养基500μl，剩下的100μl全部均匀涂布于YEP固体培养基上（100μl100mgl^-1Kan,50μl50mgl^-1Rif）。28℃静止2～3d。摇菌于含抗生素的（100μl100mgl^-1Kan,50μl50mgl^-1Rif）YEP培养基中，28℃，250rpm振荡过夜，菌液PCR验证。

五、质粒的大规模提取

挑取阳性克隆于500μl含有100μgml^-1Amp的LB（Lysogenybroth，LB）液体培养基中，过夜培养。转接100μl菌液至10mlLB液体培养基37℃过夜培养，15,000g离心1min收集菌体，按照每毫升菌体加：

SolutionI100μl（冰浴5min剧烈振荡）

SolutionII200μl（冰浴5min轻轻混匀）

SolutionIII150μl（冰浴5min轻轻混匀）

Solution(I~III)参见分子克隆实验指南（莎姆布鲁克，美，2005）。

15,000g离心5min，上清加入RNAse（10mgml^-1）37℃1h后加入等体积酚：氯仿（1：1），剧烈振荡后15,000g5min离心，取上清，加入等体积氯仿异戊醇，15,000g，5min上清加1/10体积2.5MNaAc和2体积无水乙醇，-20℃沉淀10min后，用75%乙醇洗涤，晾干后加入适量适量双蒸水溶解。

六、农杆菌的扩大培养以及侵染

每100mlYEP培养基中加入100μl100mgl^-1Kan,50μl50mgl^-1Rif。挑取单菌落至2ml离心管含有500μlYEP培养基，后转入50ml离心管摇菌15ml，28°C，200r.m，摇菌过夜。包括pTRV1和pTRV2-LcCIF两种菌。

将第一天摇好的菌液，按1：50或1：25稀释到新鲜的YEP培养基中，每100mlYEP培养基加入1ml1MMES（终浓度10mM）,10μl乙酰丁香酮母液（终浓度20mM），100μl100mgl^-1Kan,50μl50mgl^-1Rif。500ml三角瓶摇菌100-200ml，28℃，200rpm摇菌过夜。

3000g离心15min，倒掉培养基，用枪吹吸菌体使之均匀悬浮在侵染液中，吸打混匀直至无块状。用分光光度计测重悬菌液浓度，使OD₆₀₀在1.0～3.0，将pTRV1和pTRV2-LcCIF菌液按体积1：1混合，暗处静置4～6小时。

实施例2荔枝的农杆菌侵染处理

选取三株雌花盛开期的“糯米糍”作为实验材料，于3月19日（雌花盛花期）利用实施例1制备得到的OD₆₀₀=1.0浸染液进行喷花处理（处理组），对照组为同样OD₆₀₀的pTRV1和pTRV2混合菌液进行喷花处理。处理后50天（第一和第二次生理落果后）对平均穗坐果率和种胚发育情况进行调查。

结果表明：与对照相比，处理组“糯米糍”荔枝的单果穗的挂果数明显增加，对照平均单穗坐果为1.68±0.48个，而处理组则为2.57±0.45个，平均坐果数比对照提高53%。花后50天，对照果实和种子平均重分别为1.67±0.07g和0.293±0.017g，处理组分别为1.66±0.07g和0.291±0.016g，两者无明显差异，然而，从种子的形态看，处理组种子的内腔明显大于对照种子（见图2），荔枝果实发育种子种皮的大小决定于液态胚乳量，液态胚乳量越多，种皮越大，这结果说明处理组果实液态胚乳的发育明显多于对照果实。

对比例1

试验方法同实施例2，唯一不同的是所用的浸染液的OD₆₀₀=2.5，喷花处理50天后，结果表明：随着侵染液浓度的增加，处理组的挂果数并没有显著的增加，并且随着侵染液浓度的增加，有提高落果率的风险（见图3）。

SEQUENCELISTING

<110>华南农业大学

<120>一种提高糯米糍荔枝坐果率的菌液及其方法

<130>

<160>3

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>477

<212>DNA

<213>LcCIF基因片段

<400>1

atgatgttcatggtcttgtttattgaaagtcaagtttctgctgacttgattgatgatacg60

tgcaataaaacgcccttctataatctttgtgtcaccaccctgagatcagaccctcaaagc120

tccaaggctgatgtgcaaggcctggctcgtatagccgccataaagcttcaggataaagca180

actagtaccaagaatcaaatcaatgacttacttaaagggaaaacagatccaaagctgaaa240

ggggccttgaacatttgtgctgacgcgtacaacattatagtgaagtatgacatttcagtt300

atcattggagccatcacaaaaggtaacccgaaatttgcagaagaatatgctattgattta360

actaaagaggctgataaatgtggtaagggcatctcaggatcaccattggctagtaacaac420

aagtttgtgcatgacctctctgatgtagttctatttattgtcagattgttactttga477

<210>2

<211>38

<212>DNA

<213>LcCIF-TRV2-F

<400>2

gcctccatggggatccatgttcatggtcttgtttattg38

<210>3

<211>43

<212>DNA

<213>LcCIF-TRV2-R

<400>3

cttcgggacatgcccgggtcaaagtaacaatctgacaataaat43

Claims (7)

1.一种提高糯米糍荔枝坐果率的菌液，其特征在于，所述菌液为含有沉默表达载体的LcCIF基因片段转化获得的农杆菌工程菌。

2.根据权利要求1所述的菌液，其特征在于，所述LcCIF基因片段的序列如SEQIDNO：1所示。

3.根据权利要求1所述的菌液，其特征在于，所述沉默表达载体为pTRV1和pTRV2。

4.一种提高糯米糍荔枝坐果率的方法，其特征在于，是利用权利要求1所述菌液浸染荔枝植株。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述荔枝植株为盛花期的植株或花后3周前结有幼果的植株。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌液的OD₆₀₀为0.5～1.5。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所示浸染方法为喷洒、浸没。