CN105268032B - 促进p15植骨材料成骨的可吸收性生物膜 - Google Patents

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本发明属于生物工程领域，具体涉及一种可促进P15植骨材料周围成骨的可吸收性生物膜以及制备方法。其由高分子膜材料和具有促进成骨功能的药物组成，所述高分子膜材料为I型胶原蛋白和硫酸软骨素；所述药物为维生素D和杯苋甾酮。

Description

促进P15植骨材料成骨的可吸收性生物膜
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种可促进P15植骨材料周围成骨的可吸收性生物膜。
背景技术
人工种植技术是牙列缺损、牙列缺失和颌面部缺损的有效修复手段，目前已作为一种成熟可靠的修复方法广泛应用于临床。在种植术中，由于拔牙窝直径较大，导致种植体上段与牙槽骨间存在间隙。如不处理将可能导致种植体与骨之间不能形成骨结合。引导骨组织再生术是在骨缺损区防止屏障膜，利用不同牙周组织生长及修复速度不同，引导骨细胞优先长入缺损区，同时组织结缔组织细胞向缺损区生长，为成骨细胞的表达及骨再生创建良好的环境，促进骨整合。
可引导组织再生的生物膜主要用于修复组织缺损时的组织再生术，用其作为物理屏障，可以阻止周边组织长入缺损区域，同时作为一种保护膜将缺损区域保护起来，为缺损区的组织生长预留空间。
P15植骨材料是德国登士柏公司(Dentsply，GE)生产的一种植骨材料，其在植骨材料的无机载体表面复合有生物活性肽P15(氨基酸序列为GTPGPQGIAGQRGVV)，P15通过增强活性细胞的粘附和通过调节细胞的凋亡来调节细胞数目和组织结构。目前P15植骨材料广泛应用于我国口腔医疗中，具有明显的促进骨性祖细胞结合、迁移、增殖、分化以及最终成骨作用。
随着种植体、植骨材料以及生物膜的联合应用，使三者达到最佳的成骨效果，提高手术成功率成为广大口腔医疗科研工作者的主要研究目标。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种促进P15植骨材料周围成骨的可吸收性生物膜，其由高分子膜材料和具有促进成骨功能的药物组成，所述高分子膜材料为I型胶原蛋白和硫酸软骨素；所述药物优选为维生素D和杯苋甾酮。
在本发明的一个实施方案中，所述高分子膜材料和药物的重量比为1～100：1，优选为10：1。
在本发明另一个实施方案中，所述高分子膜材料中，I型胶原蛋白和硫酸软骨素重量比为1：1。
在本发明又一个实施方案中，所述药物中，维生素D和杯苋甾酮的重量比为1～100：1，优选为5：1。
本发明的另一个目的是提供所述可吸收性生物膜的制备方法，具体步骤如下：
1)将I型胶原蛋白加入到0.2％-0.6％的乙酸溶液中，以每分钟16000r-20000r高速搅拌，配置成胶原乙酸溶胀液；
2)在配置好的胶原乙酸溶胀液中加入硫酸软骨素，搅拌配置成胶原-硫酸软骨素浆液；
3)向胶原-硫酸软骨素浆液中加入维生素D和杯苋甾酮，以每分钟16000r-20000r高速搅拌均匀，然后倒入不锈钢冻干盘中，置于真空冷冻干燥机中进行第一次真空冷冻干燥；
4)将第一次真空冷冻干燥后的胶原-硫酸软骨素浆液利用压膜机压制成胶原复合薄膜；
5)在两层胶原复合薄膜中喷涂一层胶原-硫酸软骨素浆液，放入到真空冷冻干燥机内进行第二次真空冷冻干燥；
6)将第二次真空冷冻干燥后的胶原复合薄膜进行高温真空交联；
7)将交联后的胶原复合薄膜进行环氧乙烷灭菌，得到可吸收性生物膜。
在本发明进一步地实施方案中，在将搅拌均匀的胶原-硫酸软骨素浆液倒入不锈钢冻干盘中时，倒入后的厚度为5mm±0.5mm。所述经压膜机压制成的胶原复合薄膜的厚度为1-3mm。
在本发明另一个实施方案中，所述高温真空交联为在60℃-80℃的高温真空干燥箱中进行高温真空交联，交联时间为24-36h。
具体实施方式
下面将进一步的详细说明本发明。需要指出的是，以下说明仅仅是对本发明要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本发明的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。
实施例1添加药物与P15肽对体外细胞成骨作用考察
MG-63细胞置于培养瓶中用MEM/EBSS培养基培养(其中含10％的胎牛血清(FBS)和非必需氨基酸(NEAA))。当细胞在培养瓶中贴壁融合达80～90％左右时传代。将MG-63细胞按2000个/孔接种于96孔板细胞培养24小时，添加P15和药物培养基溶液，各组中，对照组添加等量培养基，各给药组的剂量一致，但药物组合物中的化合物配比存在不同。
各给药组的剂量分别如下：
μg/L P15 维生素D 杯苋甾酮
组1 10 40 0
组2 10 0 40
组3 10 27 13
组4 10 35 5
组5 10 33 7
细胞在上述培养基中培养3天后，进行MTT试验。具体结果如下：
n＝5 MTT吸光度值(490nm)
对照组 0.82±0.03
组1 1.04±0.04
组2 0.91±0.05
组3 1.18±0.04
组4 1.22±0.03
组5 1.41±0.05
经过one-way ANOVA检验，组1-5较对照组具有显著的促进细胞增值作用(p<0.01),组5较其他给药组具有显著的促进细胞增值作用(p<0.01)。
另外，将MG-63细胞按2×105个/孔接种于24孔板细胞培养24小时，血清饥饿12小时后，余下处理与上述增殖试验相同。在细胞培养7天后，检测碱性磷酸酶(ALP)活性，在细胞培养21天后，用茜素红染色吸光度值评估矿化结节的形成状况，具体结果如下：
n＝5 ALP活性(U/L)
对照组 17.2±1.2
组1 22.4±1.4
组2 20.1±0.9
组3 24.8±1.3
组4 25.7±1.6
组5 30.2±1.1
经过one-way ANOVA检验，组1-5较模型组具有显著的提高ALP活性作用(p<0.01),组5较其他给药组具有显著的提高ALP活性作用(p<0.01)。
实施例2可吸收性生物膜制备
1)将I型胶原蛋白加入到0.3％的乙酸溶液中，以每分钟16000r-20000r高速搅拌，配置成胶原乙酸溶胀液，胶原蛋白含量为0.3％；
2)在配置好的胶原乙酸溶胀液中(30ml)加入90mg硫酸软骨素，以每分钟16000r-20000r高速搅拌配置成胶原-硫酸软骨素浆液；
3)向胶原-硫酸软骨素浆液中加入15mg维生素D和5mg杯苋甾酮，以每分钟16000r-20000r高速搅拌均匀，将搅拌后浆液加入抽滤瓶中，开启真空泵不时轻摇抽滤瓶，抽至浆液内无气泡。然后倒入不锈钢冻干盘中，倒入后的厚度为5mm±0.5mm，然后置于真空冷冻干燥机中进行第一次真空冷冻干燥；
4)将第一次真空冷冻干燥后的胶原-硫酸软骨素海绵利用压膜机压制成厚度1mm胶原复合薄膜；
5)在两层胶原复合薄膜中喷涂一层胶原-硫酸软骨素浆液，放入到真空冷冻干燥机内进行第二次真空冷冻干燥；
6)将第二次真空冷冻干燥后的胶原复合薄膜进行高温真空交联；真空环境下70℃交联36h。
7)将交联后的胶原复合薄膜进行环氧乙烷灭菌，得到可吸收性生物膜。
实施例3可吸收性生物膜的体内实验
取成年比格犬，犬龄12-14个月，雌雄不限，适应性饲养1周后，肌注氯胺酮进行全身麻醉，仔细拔除比格犬的双侧下颌第二、三和四前磨牙，术中尽量减少对牙槽窝的损伤，立即植入Xive种植体(11mm-3.4mm，德国登士柏公司)，每个拔牙窝植入1枚，同时用生理盐水局部降温。植入种植体时紧贴近中骨壁，就位后用裂钻制备种植体对应牙槽骨颊舌侧及远中半环形骨缺损，宽3mm，深4mm。将每只实验犬口内的6处种植体骨缺损随机分为6组：
具体如下：
组1：骨缺损区不植入任何材料
组2：骨缺损区植入P15植骨材料(德国登士柏公司)，不覆盖生物膜
组3：骨缺损区植入P15植骨材料(德国登士柏公司)，覆盖实施例2制备的生物膜
组4：骨缺损区植入P15植骨材料(德国登士柏公司)，覆盖对比例1制备的生物膜
组5：骨缺损区植入P15植骨材料(德国登士柏公司)，覆盖对比例2制备的生物膜
组6：骨缺损区植入P15植骨材料(德国登士柏公司)，覆盖对比例3制备的生物膜
对比例1生物膜的制备：方法同实施例2，区别仅在于，不添加维生素D和杯苋甾酮
对比例2生物膜的制备：方法同实施例2，区别仅在于，仅添加18mg维生素D
对比例3生物膜的制备：方法同实施例2，区别仅在于，仅添加18mg杯苋甾酮
操作完毕后严密缝合，保证软组织无张力。术后3天给予抗生素，术后予以流食1周，半流食2周，术后3个月处死所有实验犬，取出下颌骨，固定，制作单个种植体骨块。包埋标本，切片，苦味酸品红溶液染色，着色后种植体内部中空组织为白色，骨组织为红色，软组织为蓝色。计算种植体-骨结合率(BIC)＝种植体与骨界面直接接触长度/种植体骨界面的总长度×100％，每个8个标本。将余下标本固定在万能试验机底座上，用夹具夹紧，然后拉出种植体，记录种植体被完全拉出时的最大力值，每组5个标本。
具体结果如下：
1、生物力学测试
n＝5 最大力值(N)
组1 86.3±13.7
组2 737.6±21.2
组3 1379.3±32.4
组4 877.5±26.5
组5 1010.4±22.1
组6 903.2±31.3
2、骨结合率计算结果
n＝8 骨结合率(％)
组1 51.4±4.7
组2 63.2±3.8
组3 91.6±5.2
组4 70.7±4.6
组5 79.5±3.7
组6 76.3±4.1
本发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。

Claims (5)

1.一种促进P15植骨材料周围成骨的可吸收性生物膜，其由高分子膜材料和具有促进成骨功能的药物组成，所述高分子膜材料为I型胶原蛋白和硫酸软骨素；所述高分子膜材料和药物的重量比为10：1，所述药物为维生素D和杯苋甾酮，所述药物中，维生素D和杯苋甾酮的重量比为5：1。
2.根据权利要求1所述的可吸收性生物膜，其特征在于，所述高分子膜材料中，I型胶原蛋白和硫酸软骨素重量比为1：1。
3.一种权利要求1或2任一项所述可吸收性生物膜的制备方法，具体步骤如下：
1）将I型胶原蛋白加入到0.2％-0.6％的乙酸溶液中，以每分钟16000r-20000r高速搅拌，配置成胶原乙酸溶胀液；
2）在配置好的胶原乙酸溶胀液中加入硫酸软骨素，搅拌配置成胶原-硫酸软骨素浆液；
3）向胶原-硫酸软骨素浆液中加入维生素D和杯苋甾酮，以每分钟16000r-20000r高速搅拌均匀，然后倒入不锈钢冻干盘中，置于真空冷冻干燥机中进行第一次真空冷冻干燥；
4）将第一次真空冷冻干燥后的胶原-硫酸软骨素浆液利用压膜机压制成胶原复合薄膜；
5）在两层胶原复合薄膜中喷涂一层胶原-硫酸软骨素浆液，放入到真空冷冻干燥机内进行第二次真空冷冻干燥；
6）将第二次真空冷冻干燥后的胶原复合薄膜进行高温真空交联；
7）将交联后的胶原复合薄膜进行环氧乙烷灭菌，得到可吸收性生物膜。
4.根据权利要求3所述可吸收性生物膜的制备方法，其特征在于，在将搅拌均匀的胶原-硫酸软骨素浆液倒入不锈钢冻干盘中时，倒入后的厚度为5mm±0.5mm，所述经压膜机压制成的胶原复合薄膜的厚度为1-3mm。
5.根据权利要求3所述可吸收性生物膜的制备方法，其特征在于，所述高温真空交联为在60℃-80℃的高温真空干燥箱中进行高温真空交联，交联时间为24-36h。
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