CN105263517A - E1e2hcv疫苗及使用方法 - Google Patents

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Abstract

本公开提供包含来自两个或更多个不同的HCV基因型的HCV？E1、E2或E1/E2多肽的免疫原性组合物。本公开提供包含来自两个或更多个不同的HCV基因型的HCV？E2或E1/E2多肽的免疫原性组合物。所述免疫原性组合物用于进行诱导针对HCV的免疫应答的方法。本公开还提供在个体中刺激针对HCV的免疫应答的方法。

Description

E1E2HCV疫苗及使用方法
交叉引用
本申请要求2013年5月15日提交的美国临时专利申请第61/823,712号和2013年10月4日提交的第61/887,229号的权益，所述申请通过引用整体并入本文。
通过引用并入作为文本文件提供的序列表
将序列表作为2014年5月9日创建的并且具有339KB大小的文本文件“UALB-017WOSeqList_ST25.txt”一起提供。文本文件的内容通过引用整体并入本文。
引言
丙型肝炎病毒(HCV)是据估计感染世界范围内1.5亿至2亿人的血液传播病原体。HCV感染可以是无症状的，并且可被患者清除，有时无需医疗干预。然而，大多数的患者发展慢性HCV感染，这可能导致肝脏炎症、瘢痕，甚至肝衰竭或肝癌。单在美国就有超过300万的人有慢性感染。
HCV病毒体含有约9.5kb的正义单链RNA基因组。基因组编码3,010至3,030个氨基酸的单个多蛋白。结构蛋白包含形成病毒核衣壳的核心蛋白和两个包膜糖蛋白E1和E2。
在本领域中需要这样的免疫原性组合物，所述组合物在个体中诱导针对HCV的免疫应答，以提供有效对抗在全世界发现的多种HCV基因型(例如基因型1和3)的免疫应答的诱导。
概述
本公开提供包含来自两个或更多个不同HCV基因型的HCVE1、E2或E1/E2多肽的免疫原性组合物。本公开提供包含来自两个或更多个不同HCV基因型的HCVE2或E1/E2多肽的免疫原性组合物。免疫原性组合物用于进行诱导针对HCV的免疫应答的方法。本公开还提供在个体中刺激针对HCV的免疫应答的方法。
在一些实施方案中，本公开提供免疫原性组合物，其包含：a)来自第一HCV基因型的丙型肝炎病毒(HCV)E1多肽、E2多肽或E1E2多肽；b)来自第二HCV基因型的HCVE1多肽、E2多肽或E1E2多肽；和c)药学上可接受的赋形剂，条件是该组合物包含至少一种E1多肽和至少一种E2多肽。在这些实施方案中的一些实施方案中，第一HCV基因型为基因型1；并且第二HCV基因型为基因型2。在其它情况下，第一HCV基因型为基因型1；并且第二HCV基因型为基因型3。以下实施方案i)至xiv)是非限制性实例，其中主题免疫原性组合物包含：
i)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E1/E2多肽；
ii)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E2多肽；
iii)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
iv)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；
v)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型2的E2多肽；
vi)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；
vii)HCV基因型1的E1多肽；和HCV基因型3的E2多肽；
viii)HCV基因型1的E1多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
ix)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型3的E1多肽；
x)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
xi)HCV基因型1的E1多肽；和HCV基因型2的E2多肽；
xii)HCV基因型1的E1多肽；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；
xiii)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型2的E1多肽；或
xiv)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物。
在任何上述实施方案中，组合物还可包括第三HCV基因型的HCVE1、E2或E1/E2多肽。
在任何上述实施方案中，来自第一HCV基因型的HCVE2多肽可以是野生型，并且来自第二HCV基因型的HCVE2多肽可以是野生型。在任何上述实施方案中，来自第一HCV基因型的HCVE2多肽可以是野生型，并且来自第二HCV基因型的HCVE2多肽可包含E2N1位点和/或E2N6位点中的天冬酰胺的氨基酸取代。在任何上述实施方案中，来自第一HCV基因型的HCVE2多肽可包含E2N1位点和/或E2N6位点中的天冬酰胺的氨基酸取代，并且来自第二HCV基因型的HCVE2多肽可以是野生型。
在主题免疫原性组合物中，药学上可接受的赋形剂可包含佐剂；在一些情况下，佐剂为MF59、明矾、聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)或CpG寡核苷酸。
在其它实施方案中，本公开提供免疫原性组合物，其包含：a)来自第一HCV基因型的丙型肝炎病毒(HCV)E1多肽、E2多肽或E1/E2多肽；b)来自第二HCV基因型的HCVE1多肽、E2多肽或E1/E2多肽；c)来自第三HCV基因型的HCVE1多肽、E2多肽或E1/E2多肽；和d)药学上可接受的赋形剂，条件是该组合物包含至少一种E1多肽和至少一种E2多肽。在一些情况下，第一HCV基因型为基因型1，第二HCV基因型为基因型2，并且第三HCV基因型为基因型3。以下实施方案i)至xvii)是非限制性实例，其中主题免疫原性组合物包含：
i)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
ii)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E2多肽；
iii)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
iv)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
v)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E2多肽；
vi)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E2多肽；
vii)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
viii)HCV基因型1的E1多肽；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
ix)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E1多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
x)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E1多肽；
xi)HCV基因型1的E1多肽；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
xii)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E1多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
xiii)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E1多肽；
xiv)HCV基因型1的E1多肽；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E2多肽；
xv)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E1多肽；和HCV基因型3的E2多肽；
xvi)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E1多肽；或
xvii)HCV基因型1的E1多肽；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E2多肽。
在任何上文提及的实施方案中，来自第一HCV基因型的HCVE2多肽可以是野生型，来自第二HCV基因型的HCVE2多肽可以是野生型，并且来自第三HCV基因型的HCVE2多肽可以是野生型。在其它情况下，来自第一HCV基因型的HCVE2多肽为野生型，来自第二HCV基因型的HCVE2多肽为野生型，并且来自第三HCV基因型的HCVE2多肽包含E2N1位点和/或E2N6位点中的天冬酰胺的氨基酸取代。在其它情况下，来自第一HCV基因型的HCVE2多肽为野生型，来自第二HCV基因型的HCVE2多肽包含E2N1位点和/或E2N6位点中的天冬酰胺的氨基酸取代，并且来自第三HCV基因型的HCVE2多肽为野生型。在其它情况下，来自第一HCV基因型的HCVE2多肽包含E2N1位点和/或E2N6位点中的天冬酰胺的氨基酸取代，来自第二HCV基因型的HCVE2多肽为野生型，并且来自第三HCV基因型的HCVE2多肽为野生型。
在任何上述实施方案中，药学上可接受的赋形剂可包括佐剂。在任何上文提及的实施方案中，佐剂可以是MF59、明矾、聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)或CpG寡核苷酸。
本公开提供在个体中诱导免疫应答的方法，该方法包括向个体施用有效量的根据本文所述实施方案的任何实施方案的免疫原性组合物。
附图简述
图1A-C提供HCV基因型1病毒，特别地代表性HCV1A、1B和1C基因型的核心-E1-E2编码区的实例的蛋白质比对。使用Geneious软件v5.6.4比对编码区核心-E1-E2的Genbank数据库序列。突出显示糖基化位点N417(E2N1)和N532(E2N6)(箭头)。氨基酸的编号是根据菌株NP_671941(H77)。为了维持氨基酸编号，菌株AF139594和BAA03581在氨基酸478与479(分别为赖氨酸(K)和丙氨酸(A))之间具有未显示的氨基酸插入(虚线)。从上到下是SEQIDNO:1-27。
图2A和2B提供代表性HCV3A、3B和3K基因型的核心-E1-E2编码区的蛋白质比对。使用Geneious软件v5.6.4比对编码区核心-E1-E2的Genbank数据库序列。突出显示糖基化位点N417(E2N1)和N532(E2N6)(箭头)。从上到下是SEQIDNO:28-37。
图3提供AlbertaHCV基因型1A分离株(LKS1)的共有E1E2蛋白序列。E1E2编码区的共有序列获自具有HCV基因型1A(LKS1)的患者(LiKaShingInstituteofVirology,UniversityofAlberta,Edmonton,AB,Canada)。显示LKS1E1E2与H77基因型1A(核心-E1-E2)的比较。LKS1在E1E2编码区与H77具有515/555(92.8％)的氨基酸同一性。突出显示糖基化位点N417(E2N1)和N532(E2N6)(箭头)。从上到下是SEQIDNO:38、SEQIDNO:1和SEQIDNO:39。
图4描绘利用HCV1(基因型1a)衍生的E1E2，或利用J6(基因型2)衍生的E2免疫的山羊的血清产生的基因型特异性中和。
图5描绘来自经免疫的山羊的血清针对基因型1a嵌合H77c/JFH1HCV的中和活性。
图6描绘来自经免疫的山羊的血清针对基因型2a嵌合J6/JFH1HCV的中和活性。
图7A和7B描绘利用HCV抗原免疫的山羊的血清对HCV的基因型特异性中和及交叉中和。A)利用从基因型1aHCV1序列衍生的重组E1E2免疫山羊757和714。B)利用从基因型2aJ6序列衍生的E2免疫山羊766和773。测量针对基因型1a-6a的嵌合HCVcc的中和活性。使用免疫前的血清的中和活性作为对照来使结果标准化。
图8A和8B提供HCV基因型7a的核心-E1-E2编码区的氨基酸序列。基因型7a(分离株QC69；Genbank：ABN05226.1)的编码区核心-E1-E2的氨基酸序列是根据参照菌株NP_671941(H77)的编号方案来显示。突出显示糖基化位点N417(E2N1)和N533(E2N6)(箭头)(SEQIDNO:40)。
图9A-C提供代表性HCV2A和HCV2B亚型的核心-E1-E2编码区的氨基酸序列的比对。使用Geneious软件v5.6.4比对编码区核心-E1-E2的Genbank数据库序列。描绘的氨基酸编号是根据常见HCV菌株：对于HCV2A和HCV2B分别为ABO47639(JFH1)和HPCJ8G-J8(J8)。从上到下是SEQIDNO:41-53。
定义
如本文中所用，术语“丙型肝炎病毒”(“HCV”)是指丙型肝炎病毒的许多不同基因型和分离株的任一种。因此，“HCV”包括HCV的许多基因型、亚型或准种(包括例如基因型1、2、3、4、6、7等，以及亚型(例如，1a、1b、2a、2b、3a、4a、4c等)和准种)的任一种。代表性HCV基因型和分离株包括：“Chiron”分离株HCV-1、H77、J6、Con1、分离株1、BK、EC1、EC10、HC-J2、HC-J5；HC-J6、HC-J7、HC-J8、HC-JT、HCT18、HCT27、HCV-476、HCV-KF、“人”、“日本人”、“台湾人”、TH、1型、1a型、H771b型、1c型、1d型、1e型、1f型、10型、2型、2a型、2b型、2c型、2d型、2f型、3型、3a型、3b型、3g型、4型、4a型、4c型、4d型、4f型、4h型、4k型、5型、5a型、6型和6a型。
术语“个体”、“宿主”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指哺乳动物，包括，但不限于，非人灵长类动物(例如，猿猴)和人。
如本文中所用，术语“分离的”，用于指多肽时，是指存在于与该多肽天然存在的环境不同的环境中的多肽。可纯化分离的多肽。“纯化的”意指已将目标化合物(例如，多肽)与天然伴随其的组分分离。“纯化的”还可用于指可从在多肽产生过程中(例如，在体外合成过程中，等)伴随其的组分分离的多肽。在一些实施方案中，当多肽(或多肽的混合物)按重量计至少60％或至少75％不含与其天然缔合的或在产生过程中与其缔合的有机分子时，所述多肽(或多肽的混合物)是基本上纯的。在一些实施方案中，多肽的纯度为30％至60％。在一些实施方案中，多肽(或多肽的混合物)的纯度按重量计为至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。例如，在一些实施方案中，当E1或E2多肽(或E1和E2多肽的混合物)按重量计至少60％或至少75％不含与所述多肽天然缔合的或在产生过程中与其缔合的有机分子时，所述E1或E2多肽(或E1和E2多肽的混合物)是基本上纯的。在一些实施方案中，E1或E2多肽(或E1和E2多肽的混合物)的纯度按重量计为至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，当组合物包含E2多肽时，所述E2多肽的纯度按重量计为至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，当组合物包含E1/E2异二聚体复合物多肽时，所述E1/E2异二聚体复合物多肽的纯度按重量计为至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。在一些实施方案中，当组合物包含E2多肽和E1/E2异二聚体复合物多肽时，所述E2多肽和E1/E2异二聚体复合物多肽的纯度按重量计为至少60％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。
在进一步描述本发明之前，应理解，本发明不限于所述的特定实施方案，这样当然可变化。还应理解，本文中使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并非旨在进行限制，因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限制。
当提供值的范围时，要理解的是，该范围的上限和下限之间的每个居间数值(至下限单位的十分之一，除非上下本另外清楚地规定)以及所述范围内的任意其它所述或居间的数值都包括在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该较小的范围内，并且也包括在本发明中，服从于所述范围内的任何特别排除的限值。当所述范围包括上下限值之一或两者时，排除那些所包括的界限之一或两者的范围也包括在本发明中。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的通常理解相同的含义。尽管在实践或测试本发明中能使用与本文描述的那些方法和材料相似或等效的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。本文提及的所有出版物通过引用并入本文以公开和描述结合其引用所述出版物的方法和/或材料。
必须注意，如本文中和所附权利要求中所用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个(a)”、“一种(an)”、“该(the)”包括复数指示物。因此，例如，提及“一种HCVE1多肽”包括多种此类多肽以及提及“该HCV基因型”包括提及对于本领域技术人员来说是已知的一个或多个基因型及其等效物等。还要注意的是，可撰写权利要求来排除任何可选元素。这样，该陈述意图用作与权利要求要素的描述联合使用此类排他性术语如“单独地”、“仅仅”等或使用“否定”限制的在先基础。
应当理解，为清楚起见而在分开的实施方案的语境中描述的本发明的某些特征也可以在单个实施方案中以组合形式提供。反之，为简明起见而在单个实施方案的语境中描述的本发明的各种特征也可以分开或以任何合适的子组合提供。关于本发明的实施方案的所有组合明确地包括在本发明中并且公开于本文中，就如同各个和每一个组合被个别地且明确地公开一样。另外，各种实施方案及其组件的所有子组合明确地包括在本发明中并且公开于本文中，就如同各个和每一个此类子组合被个别地且明确地公开一样。
本文所论述的出版物仅针对它们在本申请提交日之前的公开内容而提供。此处的任何信息都不应解释为承认本发明不能因为是在先发明而先于此类出版物。另外，所提供的公开日可能不同于实际的公开日，这可能需要独立地进行确认。
详述
本公开提供包含来自两个或更多个不同HCV基因型的HCVE1、E2或E1/E2多肽的免疫原性组合物。本公开提供包含来自两个或更多个不同的HCV基因型的HCVE2或E1/E2多肽的免疫原性组合物。免疫原性组合物用于进行诱导对HCV的免疫应答的方法。本公开还提供在个体中刺激对HCV的免疫应答的方法。
免疫原性组合物
本公开提供包含HCV结构多肽例如E1、E2和/或E1/E2的免疫原性组合物，其中所述组合物包含来自至少两个不同的HCV基因型的HCV结构多肽。本公开提供包含来自两个或更多个不同的HCV基因型的HCVE2或E1/E2多肽的免疫原性组合物。
主题免疫原性组合物包括HCV多肽E1、E2和/或E1/E2。存在于主题免疫原性组合物中的E1和E2多肽可作为共价或非共价连接的异二聚体存在于组合物中。E1和E2多肽可作为单个多肽链存在于组合物中，或可作为两个单独的多肽链(其可以通过或可以不通过二硫键共价连接)存在。
可分离以及可纯化E1和E2多肽。在一些情况下，主题免疫原性组合物包含E1和E2多肽，其中所述多肽(或E1和E2多肽的混合物)为30％至60％纯，或60％至约80％纯。在一些情况下，主题免疫原性组合物包含E1和E2多肽，其中所述多肽(或E1和E2多肽的混合物)为至少约80％纯、至少约85％纯、至少约90％纯、至少约95％纯、至少约98％纯、至少约99％纯或大于99％纯。在一些实施方案中，主题免疫原性组合物不包括除HCVE1和HCVE2多肽外的任何其它多肽(例如无其它HCV多肽)。
术语“E1多肽”和“E2多肽”包括包含对天然序列的另外修饰，诸如缺失(例如，C端截短，例如缺乏如本文所述的天然存在的C端的C端截短的E2)、添加和取代(例如，保守氨基酸取代)的蛋白质。这些修饰可以是有意的(如通过定点诱变)，或可作为在E1或E2的天然存在或重组表达过程中(例如，在HCV感染的过程中在体内，在细胞培养中在HCV病毒产生过程中，在体外细胞培养中在E1或E2的重组表达过程中)的突变事件的结果发生。
E1
适合用于本公开的免疫原性组合物的HCVE1多肽可具有约150个氨基酸(aa)至约175个aa、约175个aa至约195个aa、约131个aa至约175个aa、或约175个aa至约193个aa的长度。
在图1A-C中，E1的氨基酸序列为氨基酸192至氨基酸383。在图2A-2B中，E1的氨基酸序列为氨基酸192至氨基酸384。在图3中，E1的氨基酸序列为氨基酸192至氨基酸385。在约170至约191上的氨基酸用作E1的信号序列。如本文中所用，“E1多肽”包括前体E1蛋白，包括信号序列；包括缺乏该序列的成熟E1多肽；以及包括具有异源信号序列的E1多肽。E1多肽可包括在约氨基酸位置360-383上存在的C端膜锚定序列(参见，例如，WO96/04301)。在一些情况下，合适的E1多肽缺乏包括跨膜区的C端部分。例如，在一些情况下，合适的E1多肽缺乏氨基酸330至氨基酸384，或氨基酸360至氨基酸384的C端部分。E1多肽可以是任何基因型的E1多肽、HCV的亚型或分离株。基因型1的E1多肽和基因型3的E1多肽是特别受关注的。
E1多肽可包含与图1A-C、图2A-2B或图3中描绘的E1多肽的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
E1多肽可包含与图3中描绘的共有E1多肽氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
E1多肽可包含与图8A和8B中描绘的E1多肽的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。例如，基因型7A的E1多肽可包含与8A和8B中描绘的氨基酸序列的氨基酸192-383具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
E1多肽可包含与图9A-C中描绘的E1多肽的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。例如，基因型2A的E1多肽可包含与如2A鉴定的和图9A-C中描绘的氨基酸序列的氨基酸192-383具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。例如，基因型2B的E1多肽可包含如2B中鉴定的和图9A-C中描绘的氨基酸序列的氨基酸384-751具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
E2
适合用于主题免疫原性组合物的E2多肽可具有约200个氨基酸(aa)至约250个aa、约250个aa至约275个aa、约275个aa至约300个aa、约300个aa至约325个aa、约325个aa至约350个aa、或约350个aa至约365个aa的长度。
在图1A-C中，E2的氨基酸序列为氨基酸384至氨基酸746。在图2A-2B中，E2的氨基酸序列为氨基酸385至氨基酸754。在图3中，E2的氨基酸序列为氨基酸386至氨基酸746。如本文中所用，“E2多肽”包括前体E2蛋白，包括信号序列；包括缺乏该序列的成熟E2多肽；以及包括具有异源信号序列的E2多肽。E2多肽可包括存在于约氨基酸位置715-730上并且可延伸远至约氨基酸氨基酸746的C端膜锚定序列(参见，Lin等，J.Virol.(1994)68:5063-5073)。
在一些情况下，适合用于本公开的免疫原性组合物的E2多肽缺乏其C端区的一部分，例如约氨基酸715至C端；约氨基酸625至C端；约氨基酸661至C端；约氨基酸655至C端；约氨基酸500至C端，其中氨基酸编号参照图1A-C中的编号。参见，例如，美国专利第6,521,423号。
适合用于本公开的免疫原性组合物的E2多肽可包含与图1A-C、图2A-2B或图3中描绘的E2多肽的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％,至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
适合用于本公开的免疫原性组合物的E2多肽可包含与图8A和8B中描绘的E2多肽的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。例如，基因型7A的E2多肽可包含与图8A和8B中描绘的氨基酸序列的氨基酸384-750具有至少约70％、至少约75％、至少约80％至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
适合用于本公开的免疫原性组合物的E2多肽可包含与图9A-C中描绘的E2多肽的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％,至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。例如，基因型2A的E2多肽可包含与如2A鉴定的和图9A-C中描绘的氨基酸序列的氨基酸384-751具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。例如，基因型2B的E2多肽可包含与如2B鉴定的和图9A-C中描绘的氨基酸序列的氨基酸384-751具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
经修饰的E2多肽
在一些情况下，修饰存在于主题免疫原性组合物中的E2多肽，以便E2多肽相较于野生型E2多肽具有减少的糖基化。野生型HCVE2在E2N1和/或E2N6处被糖基化，所述位点在参照菌株H77中分别包括残基Asn-417和/或Asn-532。“E2N1”和“E2N6”是指天然存在的HCVE2多肽在其处可被N-连接糖基化的氨基酸序列基序，所述基序位于E2多肽中，如图1A-1C、2A-2E和5的比对中所示。例如，如图1A-C中所示，在参照基因型1菌株H77中，E2N1位点包括Asn-417并且E2N6位点包括Asn-532。作为另一个实例，如图2A和2B中所示，E2N1位点包括Asn-418，并且E2N6位点包括Asn-534。作为另一个实例，如图8A和8B中所示，E2N1位点包括Asn-417，并且E2N6位点包括Asn-533。
适合包含在主题免疫原性组合物中的经修饰的E2多肽在E2N1和/或E2N6(例如，通过Asn-417和/或Asn-532的修饰(例如，取代))处具有天冬酰胺的取代，以便N连接的糖基化不在这些位点处发生。用于产生经修饰的E2多肽的E2多肽可以是HCV的任何基因型、亚型或分离株的E2多肽。基因型1的E2多肽和基因型3的E2多肽是特别受关注的。
经修饰的E2多肽可包含修饰，例如在位点E2N1和/或E2N6处的天冬酰胺的取代(例如，Asn-417和/或Asn-532)，以便N连接的糖基化在这些位点处不发生。E2N1和/或E2N6的天冬酰胺(例如，Asn-417和/或Asn-532)可被不经历糖基化(包括N-糖基化和O-糖基化)的任何氨基酸取代。取代的实例包括，但不限于，N417T(苏氨酸对Asn-417的取代)、N417S(丝氨酸对Asn-417的取代)、N417Q(谷氨酰胺对Asn-417的取代)、N417Y(酪氨酸对Asn-417的取代)、N417C(半胱氨酸对Asn-417的取代)、N532T、N532S、N532Q、N532Y、N532C等。取代的天冬酰胺的位置基于图1A-C(HCV基因型1)中描绘的编号。基因型3中的取代的天冬酰胺的位置在图2A-2B和图3中通过箭头显示。取代的天冬酰胺的位置也描绘于图5中。
经修饰的E2多肽可具有约200个氨基酸(aa)至约250个aa、约250个aa至约275个aa、约275个aa至约300个aa、约300个aa至约325个aa、约325个aa至约350个aa、或约350个aa至约365个aa的长度。
在图1A-C中，E2的氨基酸序列为氨基酸384至氨基酸746。在图2A-2B中，E2的氨基酸序列为氨基酸385至氨基酸754。在图3中，E2的氨基酸序列为氨基酸386至氨基酸746。如本文中所用，“E2多肽”包括前体E2蛋白，包括信号序列；包括缺乏该序列的成熟E2多肽；并且包括具有异源信号序列的E2多肽。E2多肽可包括在约氨基酸位置715-730处存在的并且可延伸远至约氨基酸残基746的C端膜锚定序列(参见，Lin等，J.Virol.(1994)68:5063-5073)。
在一些情况下，经修饰的E2多肽缺乏其C端区的一部分，例如约氨基酸715至C端；约氨基酸625至C端；约氨基酸650至C端；约氨基酸661至C端；约氨基酸655至C端；约氨基酸500至C端，其中氨基酸编号参照图1A-C中的编号。参见，例如，美国专利第6,521,423号。
经修饰的E2多肽可包含与图1A-C、图2A-2B或图3中描绘的E2多肽的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述经修饰的E2多肽在E2N1和/或E2N6处具有天冬酰胺的氨基酸取代(例如，Asn-417和/或Asn-532)。
经修饰的E2多肽可包含与图1A-C、图2A-F或图3中描绘的E2多肽的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述经修饰的E2多肽在E2N2处具有天冬酰胺的氨基酸取代(例如，Asn-417)，其中所述氨基酸序列包含在E2N6处的天冬酰胺(例如，Asn-532)。
经修饰的E2多肽可包含与图1A-C、图2A-F或图3中描绘的E2多肽的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述经修饰的E2多肽在E2N6处具有天冬酰胺的氨基酸取代(例如，Asn-532)，其中所述氨基酸序列包含在E2N1处的天冬酰胺(例如，Asn-417)。
经修饰的E2多肽可包含与图1A-C、图2A-F或图3中描绘的E2多肽的氨基酸序列具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，其中所述经修饰的E2多肽具有在E2N1处的天冬酰胺的氨基酸取代(例如，Asn-417)以及在E2N6处的天冬酰胺的氨基酸取代(例如，Asn-532)。
在一些情况下，除了上述修饰以外，经修饰的E2多肽还在如下的一个或多个位点处具有天冬酰胺的氨基酸取代：1)E2N2位点(例如，残基423)；2)E2N4位点(例如，残基448)；3)E2N11位点(例如，残基645)。
包含HCV基因型1的HCVE1的组合物
本公开提供包含HCV基因型1的E1/E2的免疫原性组合物。在一些情况下，免疫原性组合物包含单独的HCV基因型1E1/E2，例如免疫原性组合物不包括任何其它HCV基因型的E1多肽、E2多肽或E1/E2异二聚体。
包含两个不同的HCV基因型的E1、E2和/或E1/E2的组合物
本公开的组合物包含：a)来自第一HCV基因型的HCVE1多肽、E2多肽或E1/E2异二聚体多肽复合物；b)来自第二HCV基因型的HCVE1多肽、E2多肽或E1/E2异二聚体多肽复合物；和c)药学上可接受的赋形剂，条件是所述组合物包含至少一种E1多肽和至少一种E2多肽。E2多肽可以以与E1多肽的异二聚体复合物存在于组合物中，或可在不与E1多肽复合的情况下存在于组合物中。
在下述组合物中，“E2”是指未与E1多肽复合的E2多肽，而“E1/E2”是指一起存在于异二聚体多肽复合物中的E1和E2。类似地，E1多肽可以以与E2多肽的异二聚体复合物存在于组合物中，或可在不与E2多肽复合的情况下存在于组合物中。在下述组合物中，“E1”是指未与E2多肽复合的E1多肽，而“E1/E2”是指一起存在于异二聚体多肽复合物中的E1和E2。
本公开的组合物可包含：
a)第一HCV基因型的E1/E2异二聚体多肽复合物；和第二HCV基因型的E1/E2异二聚体多肽复合物；
b)第一HCV基因型的E1/E2异二聚体多肽复合物；和第二HCV基因型的E2多肽；
c)第一HCV基因型的E2多肽；和第二HCV基因型的E1/E2异二聚体多肽复合物；
d)第一HCV基因型的E1多肽；和第二HCV基因型的E2多肽；
e)第一HCV基因型的E1多肽；和第二HCV基因型的E1/E2异二聚体多肽复合物；
f)第一HCV基因型的E2多肽；和第二HCV基因型的E1多肽；或
g)第一HCV基因型的E2多肽；和第二HCV基因型的E1/E2异二聚体多肽复合物。
示例性本公开的组合物包括：
1)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物，例如，其中所有多肽都是野生型；
2)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E2多肽，例如，其中所有多肽都是野生型；
3)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物，例如，其中所有多肽都是野生型；
4)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物，例如，其中多肽为野生型；
5)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型2的E2多肽，例如，其中所有多肽都是野生型；
6)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物，例如，其中所有多肽都是野生型；
7)HCV基因型1的E1多肽；和HCV基因型3的E2多肽，例如，其中所有多肽都是野生型；
8)HCV基因型1的E1多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物，例如，其中所有多肽都是野生型；
9)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型3的E1多肽，例如，其中所有多肽都是野生型；
10)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物，例如，其中所有多肽都是野生型；
11)HCV基因型1的E1多肽；和HCV基因型2的E2多肽，例如，其中所有多肽都是野生型；
12)HCV基因型1的E1多肽；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物，例如，其中所有多肽都是野生型；
13)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型2的E1多肽，例如，其中所有多肽都是野生型；
14)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物，例如，其中所有多肽都是野生型。
在一些实施方案中，主题组合物不包括除上述基因型1与2的组合或基因型1与3的组合外的任何HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
如上文中所指出的，E2多肽可具有野生型HCVE2氨基酸序列，例如，其中所述E2多肽不具有在E2N1位点和/或E2N6位点处的天冬酰胺的氨基酸取代。“野生型”HCVE2多肽包含自然界中发现的HCVE2多肽的氨基酸序列。
如上文中所指出的，在一些实施方案中，E2多肽可包含在E2N1位点和/或E2N6位点处的天冬酰胺的氨基酸取代。以下是示例性组合物：
15)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽为野生型；
16)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽为野生型；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述；
17)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述；和HCV基因型3的E2多肽，其中E2多肽为野生型；
18)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽为野生型；和HCV基因型3的E2多肽，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述；
19)HCV基因型1的E2多肽，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽为野生型；
20)HCV基因型1的E2多肽，其中E2多肽为野生型；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述；
21)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽为野生型；
22)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽为野生型；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述；
23)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述；和HCV基因型2的E2多肽，其中E2多肽为野生型；
24)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽为野生型；和HCV基因型2的E2多肽，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述；
25)HCV基因型1的E2多肽，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽为野生型；
26)HCV基因型1的E2多肽，其中E2多肽为野生型；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。
包含两个不同的HCV基因型的E2或E1/E2的组合物
本公开的组合物包含：a)来自第一HCV基因型的HCVE2多肽或E1/E2异二聚体多肽复合物；b)来自第二HCV基因型的HCVE2多肽或E1/E2异二聚体多肽复合物；和c)药学上可接受的赋形剂。E2多肽可以以与E1多肽的异二聚体复合物存在于组合物中，或可在不与E1多肽复合的情况下存在于组合物中。E2多肽可以为可溶性的。
本公开的组合物可包含a)至k)的一项，如下所述，其中组合物包含药学上可接受的赋形剂：
a)HCV基因型1a的E2多肽；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中所有多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
b)HCV基因型1a的全长E2多肽；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中所有多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
c)HCV基因型1a的可溶性E2多肽；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中所有多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
d)HCV基因型1a的E2多肽，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E1/E2异二聚体的E2多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
e)HCV基因型1a的E2多肽，其中E2多肽为野生型；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
f)HCV基因型3a的E2多肽；和HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中所有多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
g)HCV基因型3a的全长E2多肽；和HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中所有多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
h)HCV基因型3a的可溶性E2多肽；和HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中所有多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
i)HCV基因型3a的E2多肽，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述；和HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E1/E2异二聚体的E2多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
j)HCV基因型3a的E2多肽，其中E2多肽为野生型；和HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
k)HCV基因型1a的E2多肽或E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型2a的E2多肽或E1/E2异二聚体多肽复合物。在一些情况下，所有多肽为野生型。在一些情况下，基因型1a和基因型2a多肽为E1/E2异二聚体多肽。在一些情况下，基因型1a多肽为E2多肽；并且基因型2a多肽为E1/E2异二聚体多肽复合物。在一些情况下，基因型1a多肽为E1/E2异二聚体多肽复合物；并且基因型2a多肽为E2多肽。在一些情况下，基因型1a和基因型2a多肽都为E2多肽。在一些情况下，基因型1a和基因型2a多肽都为可溶性E2多肽。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型诸如基因型1a、1b、2a、4、5和6a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和2a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和2a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和2a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和2a的中和的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a、1b、2a、4、5和6a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和2a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在任何上述实施方案中，HCV基因型1a的E2(作为未复合的E2或作为E1/E2异二聚体复合物)可被HCV基因型1、4、5或6的E2(作为未复合的E2或作为E1/E2异二聚体复合物)取代。
包含3个不同的HCV基因型的E1、E2和/或E1/E2的组合物
本公开的组合物包含：a)来自第一HCV基因型的HCVE1多肽、E2多肽或E1/E2异二聚体多肽复合物；b)来自第二HCV基因型的HCVE1多肽、E2多肽或E1/E2异二聚体多肽复合物；c)来自第三HCV基因型的HCVE1多肽、E2多肽或E1/E2异二聚体多肽复合物；和d)药学上可接受的赋形剂，条件是所述组合物包含至少一种E1多肽和至少一种E2多肽。E2多肽可以以与E1多肽的异二聚体复合物存在于组合物中，或可在不与E1多肽复合的情况下存在于组合物中。在下述组合物中，“E2”是指未与E1多肽复合的E2多肽，而“E1/E2”是指一起存在于异二聚体多肽复合物中的E1和E2。类似地，E1多肽可以以与E2多肽的异二聚体复合物存在于组合物中，或可在不与E2多肽复合的情况下存在于组合物中。在下述组合物中，“E1”是指未与E2多肽复合的E1多肽，而“E1/E2”是指一起存在于异二聚体多肽复合物中的E1和E2。
本公开的组合物可包含：
i)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物，例如，其中所有多肽都是野生型；
ii)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E2多肽，例如，其中所有多肽都是野生型；
iii)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物，例如，其中所有多肽都是野生型；
iv)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物，例如，其中所有多肽都是野生型；
v)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E2多肽，例如，其中所有多肽都是野生型；
vi)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E2多肽，例如，其中所有多肽都是野生型；
vii)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物，例如，其中所有多肽都是野生型。
viii)HCV基因型1的E1多肽；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
ix)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E1多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
x)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E1多肽；
xi)HCV基因型1的E1多肽；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
xii)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E1多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
xiii)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E1多肽；
xiv)HCV基因型1的E1多肽；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E2多肽；
xv)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E1多肽；和HCV基因型3的E2多肽；
xvi)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E1多肽；
xvii)HCV基因型1的E1多肽；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E2多肽。
在一些实施方案中，主题组合物不包括除上述基因型1、2和3外的任何HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括HCV基因型7的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在任何上述组合物中，E2多肽可具有野生型HCVE2氨基酸序列，例如，其中E2多肽不具有在E2N1位点和/或E2N6位点处的天冬酰胺的氨基酸取代。“野生型”HCVE2多肽包含自然界中发现的HCVE2多肽的氨基酸序列。在一些实施方案中，E2多肽可包含在E2N1位点和/或E2N6位点处的天冬酰胺的氨基酸取代。
包含3个不同的HCV基因型的E2和/或E1/E2的组合物
本公开的组合物包含：a)来自第一HCV基因型的HCVE2多肽或E1/E2异二聚体多肽复合物；b)来自第二HCV基因型的HCVE2多肽或E1/E2异二聚体多肽复合物；c)来自第三HCV基因型的HCVE2多肽或E1/E2异二聚体多肽复合物；和d)药学上可接受的赋形剂。E2多肽可以以与E1多肽的异二聚体复合物存在于组合物中，或可在不与E1多肽复合的情况下存在于组合物中。E2多肽可以为可溶性的。
本公开的组合物可包含a)至f)的一项，如下所述，其中所述组合物包含药学上可接受的赋形剂：
a)HCV基因型1a的E2多肽；HCV基因型2a的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3a的E2多肽。在一些情况下，所有多肽为野生型。在其它情况下，E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在其它情况下，不存在于与E1的异二聚体复合物中的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，E2多肽的至少一个为全长。在一些情况下，E2多肽的至少一个为可溶性E2多肽。在一些情况下，以有效地中和全球普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，组合物不包括除上述基因型1a、2a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型2b的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型7a的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
b)HCV基因型1a的E2多肽；HCV基因型2a的E2多肽；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物。在一些情况下，所有多肽为野生型。在其它情况下，E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在其它情况下，不存在于与E1的异二聚体复合物中的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，E2多肽的至少一个为全长。在一些情况下，E2多肽的至少一个为可溶性E2多肽。在一些情况下，以有效地中和全球普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，组合物不包括除上述基因型1a、2a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型2b的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型7a的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
c)HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2a的E2多肽；和HCV基因型3a的E2多肽。在一些情况下，所有多肽为野生型。在其它情况下，E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在其它情况下，不存在于与E1的异二聚体复合物中的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，E2多肽的至少一个为全长。在一些情况下，E2多肽的至少一个为可溶性E2多肽。在一些情况下，以有效地中和全球普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，组合物不包括除上述基因型1a、2a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型2b的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型7a的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
d)HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2a的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3a的E2多肽。在一些情况下，所有多肽为野生型。在其它情况下，E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在其它情况下，不存在于与E1的异二聚体复合物中的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，E2多肽的至少一个为全长。在一些情况下，E2多肽的至少一个为可溶性E2多肽。在一些情况下，以有效地中和全球普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，组合物不包括除上述基因型1a、2a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型2b的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型7a的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
e)HCV基因型1a的E2多肽；HCV基因型2a的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物。在一些情况下，所有多肽为野生型。在其它情况下，E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在其它情况下，不存在于与E1的异二聚体复合物中的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，E2多肽的至少一个为全长。在一些情况下，E2多肽的至少一个为可溶性E2多肽。在一些情况下，以有效地中和全球普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，组合物不包括除上述基因型1a、2a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型2b的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型7a的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
f)HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2a的E2多肽；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物。在一些情况下，所有多肽为野生型。在其它情况下，E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在其它情况下，不存在于与E1的异二聚体复合物中的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，E2多肽的至少一个为全长。在一些情况下，E2多肽的至少一个为可溶性E2多肽。在一些情况下，以有效地中和全球普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，组合物不包括除上述基因型1a、2a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型2b的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型7a的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
制备E1和E2多肽的方法
E1和E2多肽可使用任何适当的方法，包括重组和非重组方法(例如，化学合成)来产生。
当化学合成多肽时，合成可通过液相或固相来进行。固相肽合成(SPPS)允许包含非天然氨基酸和/或肽/蛋白质主链修饰。SPPS的各种修饰，诸如Fmoc和Boc可用于合成多肽。化学合成的细节在本领域中是已知的(例如，GanesanA.2006MiniRev.MedChem.6:3-10和CamareroJA等2005ProteinPeptLett.12:723-8)。
当使用重组技术产生多肽时，可使用任何合适的构建体和任何合适的宿主细胞将所述多肽产生为细胞内蛋白或产生为分泌型蛋白，所述宿主细胞可以是原核或真核细胞，诸如分别地细菌(例如，大肠杆菌(Escherichiacoli))细胞或酵母宿主细胞。可用作宿主细胞的真核细胞的其它实例包括昆虫细胞、哺乳动物细胞、丝状真菌和植物细胞。合适的酵母细胞包括，例如，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris))。
合适的哺乳动物细胞系包括人细胞系、非人灵长类动物细胞系、啮齿类动物(例如，小鼠、大鼠)细胞系等。合适的哺乳动物细胞系包括，但不限于，HeLa细胞(例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)No.CCL-2)、CHO细胞(例如，ATCCNo.CRL9618、CCL61、CRL9096)、293细胞(例如，ATCCNo.CRL-1573)、Vero细胞、NIH3T3细胞(例如，ATCCNo.CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCCNo.CCL10)、PC12细胞(ATCCNo.CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCCNo.CRL1651)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCCNo.CCLI.3)、人胚胎肾(HEK)细胞(ATCCNo.CRL1573)、HLHepG2细胞、MRC5细胞(ATCCNo.CCL-171)等。当使用哺乳动物宿主细胞时，此类宿主细胞可包括人细胞(例如，HeLa、293、H9和Jurkat细胞)；小鼠细胞(例如，NIH3T3、L细胞和C127细胞)；灵长类动物细胞(例如，Cos1、Cos7和CV1)和仓鼠细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)。
可根据本领域中已知的标准方法使用适合用于多肽的表达的多种宿主载体系统。参见，例如，Sambrook等，1989CurrentProtocolsinMolecularBiologyColdSpringHarborPress,NewYork；Ausubel等1995CurrentProtocolsinMolecularBiology，编辑Wiley和Sons；“ProteinExpression:APracticalApproach”(1999)S.J.Higgins和B.D.James，编辑，OxfordUniversityPress；“ProteinExpressioninMammalianCells:MethodsandProtocols(MethodsinMolecularBiology)”(2012)JamesL.Hartley，编辑HumanaPress；和“ProductionofRecombinantProteins”(2005)GerdGellisen，编辑，Wiley-VCH。用于将核酸引入宿主细胞的方法包括，例如，转化、电穿孔、缀合、转染、磷酸钙法等。可选择用于转化的方法，以提供引入的编码多肽的核酸的稳定表达。编码多肽的核酸可作为可遗传的附加型元件(例如，质粒)提供或可被基因组整合。用于产生目标多肽的多种适当的载体是商购可得的。
合适的表达载体包括，但不限于，杆状病毒载体、噬菌体载体、质粒、噬菌粒、粘粒、fosmid、细菌人工染色体、病毒载体(例如基于痘苗病毒的病毒载体、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、基于HIV的慢病毒载体、基于鼠白血病病毒(MVL)的γ逆转录病毒载体等)、基于P1的人工染色体、酵母质粒、酵母人工染色体以及特异于特定目标宿主的任何其它载体(诸如大肠杆菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或酵母细胞)。
E1和E2多肽可通过将包含编码E1和/或E2多肽的核苷酸序列的重组表达载体引入适当的宿主细胞来产生，其中所述宿主细胞产生编码的E1和/或E1多肽。在表达载体中，视情况而定，将包含编码E1和/或E2的核苷酸序列的多核苷酸连接于调控序列以获得所需表达性质。这些调控序列可包括启动子、增强子、终止子、操纵子、阻遏物和诱导物。启动子可被调控或可以是组成型的。表达载体通常具有靠近启动子序列，以提供编码目的蛋白的核酸序列的插入的方便的限制性位点。在表达宿主细胞中可存在有效的选择标记。
在一些情况下，在适合用于在真核宿主细胞(例如，昆虫细胞；酵母细胞；哺乳动物宿主细胞，诸如CHO细胞、HeLa细胞、293细胞、MRC5细胞等)中表达的重组表达载体中编码E1和E2多肽。在一些情况下，重组表达载体包含将E1和E2编码为单条多肽链的核苷酸序列；将所述重组表达载体引入真核宿主细胞以产生经遗传修饰的宿主细胞。E1和E2多肽最初被产生为单条多肽链，其在经遗传修饰的宿主细胞的内质网(ER)中被切割以产生单独的E1和E2多肽。单独的E1和E2多肽可在ER中形成异二聚体(例如，非共价连接的异二聚体)。可通过例如使用非离子型去垢剂从经遗传修饰的宿主细胞分离E1/E2异二聚体。参见，例如，Frey等(2010)Vaccine28:6367。
或者，可于单独的重组表达载体上编码E1和E2多肽；并将其作为单独的多肽在细胞(例如，相同宿主细胞或单独的宿主细胞)中产生。
如果在真核宿主细胞中表达全长E1和E2多肽，则E1和E2多肽作为去唾液酸糖蛋白保留在内质网(ER)的腔中。如果E1和E2多肽具有C端截短，以便除去C端跨膜区，则截短的多肽作为复杂糖蛋白(其中糖基化包括唾液酸)被分泌。具有C端截短，以便除去C端跨膜，和以便E1多肽从产生E1多肽的真核细胞分泌的E1多肽，被称为“可溶性E1多肽”。类似地，具有C端截短，以便除去C端跨膜，和以便E2多肽从产生E2多肽的真核细胞分泌的E2多肽被称为“可溶性E2多肽”。E2的约氨基酸662-746或D2的氨基酸715-746的去除，以及E1的约氨基酸330-384的去除导致E2和E1从真核宿主细胞的分泌。如果E1和E2在相同真核宿主细胞中共表达为全长多肽，则它们作为异二聚体保留在ER的腔中。
在宿主细胞中产生后，可从宿主细胞纯化E1和E2多肽(例如，单独地或作为异二聚体)。从宿主细胞重组产生的多肽的纯化方法在本领域中是已知的，并且包括例如去垢剂裂解(例如，利用非离子型去垢剂)，随后进行尺寸排阻柱色谱、高效液相色谱、亲和色谱等的一种或多种。
制剂
可用药学上可接受的赋形剂配制HCVE1、E2和E1/E2多肽以产生主题免疫原性组合物。多种药学上可接受的赋形剂在本领域中是已知的并且无需在本文中进行详细地描述。药学上可接受的赋形剂已在多个出版物中进行了充分描述，包括，例如，A.Gennaro(2000)"Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy"，第20版，Lippincott,Williams,&Wilkins；PharmaceuticalDosageFormsandDrugDeliverySystems(1999)H.C.Ansel等，第7版，编辑，Lippincott,Williams,&Wilkins；HandbookofPharmaceuticalExcipients(2000)A.H.Kibbe等，编辑，第3版Amer.PharmaceuticalAssoc。
在一些实施方案中，将E1和E2多肽配制在水性缓冲液中。合适的水性缓冲液包括，但不限于，在强度上从约5mM至约100mM变化的乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液。在一些实施方案中，水性缓冲液包括提供等渗溶液的试剂。此类试剂包括，但不限于，氯化钠；和糖，例如甘露糖醇、葡萄糖、蔗糖等。在一些实施方案中，水性缓冲液还包括非离子型表面活性剂诸如聚山梨醇酯20(20)或聚山梨醇酯80(80)。例如，E1和E2多肽在水性缓冲液中的制剂可包括，例如，约0.01％至约0.05％的聚山梨醇酯20(20)非离子型去垢剂。任选地，所述制剂还可包括防腐剂。合适的防腐剂包括，但不限于，苯甲醇、苯酚、氯丁醇、苯扎氯铵等。在许多情况下，将制剂在约4℃贮存。还可对制剂进行冻干，在该情况下，它们通常包括冷冻保护剂诸如蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇等。可长期贮存冻干制剂，即使在环境温度下亦如此。
可通过如下方式将E1和E2多肽配制成用于注射的制剂：将它们溶解、悬浮或乳化于水性或非水性溶剂，诸如植物油或其它类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸或丙二醇的酯中；以及必要时，具有常规添加剂，诸如增溶剂、等渗剂、助悬剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
本公开的免疫原性组合物可包括，例如，药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、镁、碳酸盐等。所述组合物可根据需要含有药学上可接受的辅助物质来接近生理条件诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如，乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。
制剂中的HCVE1、E2和E1/E2多肽的浓度可以广泛变化(例如，按重量计从小于约0.1％至至少约2％，至多达20％至50％或更多)，并且可主要基于流体体积、粘度和根据所选定的特定施用模式和患者的需要的基于患者的因素来选择。
本公开的含HCV多肽的制剂可以以溶液、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、凝胶、乳膏剂、洗剂、软膏剂、气溶胶等的形式提供。应认识到，口服施用可能需要保护组合物免受消化。这通常通过将组合物与使得其抗酸性和酶促水解的试剂缔合或通过将组合物包装在具有适当抗性的载体中来实现。防止消化的方法在本领域中是公知的。
还可提供本公开的含HCV多肽的制剂，以在施用后延长异二聚体的血清半衰期。例如，当将分离的HCVE1、E2或E1/E2多肽配制用于注射时，可将所述HCV多肽于脂质体制剂中提供，制备为胶体，或用于延长血清半衰期的其它常规技术。多种方法可用于制备脂质体，如描述于例如，Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467(1980)、美国专利第4,235,871、4,501,728和4,837,028号中。所述制剂也可以以控释或缓释的形式提供。
佐剂
本公开的免疫原性组合物可包括佐剂。可在人中使用的已知合适佐剂的实例包括，但不限于，明矾、磷酸铝、氢氧化铝、MF59(4.3％w/v的角鲨烯、0.5％w/v的Tween80TM、0.5％w/vSpan85)、含CpG的核酸(其中胞嘧啶是未甲基化的)、QS21、MPL、3DMPL、来自Aquilla、ISCOMS、LT/CT突变体的提取物、聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、QuilA、白细胞介素等。对于实验动物，可使用弗氏佐剂(Freund's)，N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，称为去甲MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(CGP19835A，称为MTP-PE)和RIBI，所述佐剂含有2％角鲨烯/Tween80乳液中的从细菌提取的3种组分单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯(trehalosedimycolate)和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐剂的功效可通过测量针对免疫原性抗原或其抗原性表位的抗体的量、测量针对抗原的细胞毒性T淋巴细胞应答和测量辅助T细胞对抗原的应答的一种或多种来测定。
增强组合物的功效的其它示例性佐剂包括但不限于：(1)水包油乳液制剂(有或无其它特异性免疫刺激剂诸如胞壁酰肽(见下文)或细菌细胞壁组分)，诸如例如(a)MF59TM(参见，例如，WO90/14837)，含有5％角鲨烯、0.5％Tween80和0.5％Span85(任选含有MTP-PE)，使用微流化均质机(microfluidizer)将其配制成亚微米颗粒，(b)SAF，含有10％角鲨烷、0.4％Tween80、5％普郎尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP，将其微流化成亚微米乳液或涡旋以产生更大粒度的乳液，和(c)RIBITM佐剂系统(RAS)，(RibiImmunochem,Hamilton,Mont.)，含有2％角鲨烯、0.2％Tween80、和一种或多种细菌细胞壁组分诸如单磷酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，例如，MPL+CWS(DetoxTM)；(2)可使用皂苷佐剂，诸如QS21或StimulonTM(CambridgeBioscience,Worcester,Mass.)或从其产生的颗粒诸如ISCOM(免疫刺激复合物)，所述ISCOMS可不含另外的去垢剂例如WO00/07621；(3)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(4)细胞因子，诸如白细胞介素(例如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO99/44636)等)、干扰素(例如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰脂质A(MPL)或3-O-脱酰基MPL(3dMPL)例如GB-2220221、EP-A-0689454，当与肺炎球菌(pneumococcal)糖类一起使用时任选地基本上不存在明矾，例如WO00/56358；(6)3dMPL与例如QS21和/或水包油乳液的组合(参见，例如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231)；(7)包含含有至少一个CG二核苷酸的CpG基序的寡核苷酸，其中胞嘧啶未被甲基化(参见，例如，WO96/02555、WO98/16247、WO98/18810、WO98/40100、WO98/55495、WO98/37919和WO98/52581)；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯(参见，例如WO99/52549)；(9)与辛苯聚醇组合的聚氧乙烯脱水山梨醇酯表面活性剂(WO01/21207)或与至少一种另外的非离子型表面活性剂诸如辛苯聚醇组合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂(WO01/21152)；(10)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(WO00/62800)；(11)免疫刺激剂和金属盐的颗粒(参见，例如WO00/23105)；(12)皂苷和水包油乳液(参见例如WO99/11241)；(13)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IM2(任选地包括甾醇)(参见，例如WO98/57659)；(14)用作免疫刺激剂以增强组合物的功效的其它物质。胞壁肽包括N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(去甲MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1'-2'-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺MTP-PE)等。还适用的是Matrix-MTM；Matrix-MTM是包含含有皂树(Quillaja)皂苷、胆固醇和磷脂的40nm纳米颗粒的佐剂。适合向人施用的佐剂是特别受关注的。在一些情况下，佐剂是增强对免疫原的CD4+T辅助应答的佐剂。
在一些情况下，佐剂为具有或不具有含CpG的寡核苷酸的MF59。在其它情况下，佐剂为具有或不具有含CpG的寡核苷酸的明矾。在其它实施方案中，佐剂为具有或不具有含CpG的寡核苷酸的聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)。在其它情况下，佐剂为具有或不具有含CpG的寡核苷酸的MPL。在其它情况下，佐剂为具有或不具有含CpG的寡核苷酸的Matrix-MTM。
诱导针对HCV的免疫应答的方法
本公开提供在哺乳动物受试者中诱导针对至少一种HCV基因型的免疫应答的方法。该方法通常包括向有此需要的个体施用有效量的主题免疫原性组合物。
通常向具有HCV感染或处于获得HCV感染的风险的人受试者施用本公开的HCV免疫原性组合物，以防止或至少部分停止疾病及其并发症的发展。足以实现该目的的量被定义为“治疗有效剂量”或“治疗有效量”。主题免疫原性组合物的“预防性”使用通常是指向还未感染HCV的个体的施用。主题免疫原性组合物的“治疗性”使用可指“预防性”使用(向还未感染HCV的个体的施用)和/或指向具有HCV感染的个体的施用。本公开的免疫原性组合物的“治疗有效量”可以是当以一个或多个剂量向未被HCV感染的个体施用时，有效地在个体中诱导针对HCV的免疫应答的量。本公开的免疫原性组合物的“治疗有效量”可以是当以一个或多个剂量向已感染HCV的个体施用时，有效地在个体中增强针对HCV的免疫应答的量。
对于治疗用途有效的量将取决于例如免疫原性组合物、施用方式、患者的体重和一般健康状态、和处方医生的判断。取决于患者所需要的和耐受的剂量和频率以及施用途径，可施用单个或多个剂量的主题免疫原性组合物。
在一些情况下，本公开的HCV免疫原性组合物的有效量(例如，治疗有效量)是当以一个或多个剂量向个体施用时，有效地在个体中诱导针对HCV的抗体应答的量。例如，可诱导针对HCV(例如，细胞外HCV)的抗体和/或针对HCV感染的细胞的抗体。
本公开的免疫原性组合物的有效量可以是当以一个或多个剂量向个体施用时，有效地诱导针对多个基因型(例如，基因型1；基因型3；基因型2；基因型7；基因型5；基因型6等)的HCV的中和抗体应答的量。中和抗体应答减少HCV对CD81和/或其它细胞受体的结合，并且抑制HCV进入细胞。在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地减少对基因型1和基因型3的HCV的中和抗体应答的量。在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地诱导针对基因型1、基因型2和基因型3的HCV的中和抗体应答的量。在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地诱导针对基因型1、基因型2、基因型3和基因型7的HCV的中和抗体应答的量。在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地诱导针对基因型1、基因型2、基因型3、基因型4、基因型5、基因型6和基因型7的HCV的中和抗体应答的量。例如，在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地诱导针对基因型1a/b和基因型3a的HCV的中和抗体应答的量。作为另一个实例，在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地诱导针对基因型1a/b、基因型2a和基因型3a的HCV的中和抗体应答的量。作为另一个实例，在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地诱导针对基因型1a/b、基因型2b和基因型3a的HCV的中和抗体应答。作为另一个实例，在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地诱导针对基因型1a/b、基因型2a、基因型3a、基因型4a、基因型5a、基因型6a和基因型7a的HCV的中和抗体的量。
在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量(例如，治疗有效量)是当以一个或多个剂量向个体施用时有效地诱导针对HCV的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的量。例如，可诱导针对HCV感染的细胞的CTL应答。
在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地诱导针对基因型1和基因型3的HCV的CTL应答的量。在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地诱导针对基因型1、基因型2和基因型3的HCV的CTL应答的量。在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地诱导针对基因型1、基因型2、基因型3和基因型7的HCV的CTL应答的量。在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地诱导针对基因型1、基因型2、基因型3、基因型4、基因型5、基因型6和基因型7的HCV的CTL应答的量。例如，在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地诱导针对基因型1a/b和基因型3a的HCV的CTL应答的量。作为另一个实例，在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地诱导针对基因型1a/b、基因型2a和基因型3a的HCV的CTL应答的量。作为另一个实例，在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地诱导针对基因型1a/b、基因型2b和基因型3a的HCV的CTL应答的量。作为另一个实例，在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量是有效地诱导基因型1a/b、基因型2a、基因型3a、基因型4a、基因型5a、基因型6a和基因型7a的HCV的CTL应答的量。
在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量(例如，治疗有效量)是当以一个或多个剂量向个体施用时，有效地在个体中诱导针对HCV的辅助T淋巴细胞(例如，CD4+T细胞)的量。
在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量(例如，治疗有效量)是当以一个或多个剂量向个体施用时，有效地诱导针对HCV基因型1的抗体应答(例如，中和抗体应答)和/或CTL应答和/或辅助T细胞应答的量。在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量(例如，治疗有效量)是当以一个或多个剂量向个体施用时，有效地诱导针对HCV基因型3的抗体应答(例如，中和抗体应答)和/或CTL应答和/或辅助T细胞应答的量。在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量(例如，治疗有效量)是当以一个或多个剂量向个体施用时，有效地诱导针对HCV基因型1和HCV基因型3的抗体应答(例如，中和抗体应答)和/或CTL应答和/或辅助T细胞应答的量。在一些情况下，本公开的免疫原性组合物的有效量(例如，治疗有效量)是当以一个或多个剂量向个体施用时，有效地诱导针对任何基因型的HCV的抗体应答(例如，中和抗体应答)和/或CTL应答和/或辅助T细胞应答的量。
通常以在哺乳动物受试者中有效地引发免疫应答，例如，体液免疫应答(例如，抗体应答)和/或CTL应答的量施用本公开的免疫原性组合物。用于免疫的有效量可变化，并且通常可在约1μg至100μg/70kg患者，例如约5μg/70kg至约50μg/70kg的范围内。在口服、经鼻或局部施用途径中，显著更高的剂量(例如10mg至100mg或更高)可以是合适的。在初次施用后，可进行相同HCV免疫原性组合物或不同HCV免疫原性组合物的加强免疫。在一些情况下，诱导免疫应答的主题方法包括本公开的HCV免疫原性组合物的初次施用，随后至少一次加强，并且在一些情况下包括两次或更多次(例如，3、4或5次)加强。初次施用与加强之间，或给予加强与随后加强之间的间隔可以为约1周至约12周，例如约1周至约2周，约2周至约4周，约4周至约6周，约6周至约8周，约8周至约10周，或约10周至约12周。
一般地，可通过用任何合适的途径施用本公开的HCV免疫原性组合物来实现免疫，所述施用途径包括口服、经鼻、经鼻咽、胃肠外、经肠、胃内、局部、经皮、皮下、肌内、以片剂、固体、粉末、液体、气溶胶的形式、局部或全身性、添加有或不添加赋形剂的组合物施用。用于制备可胃肠外施用的组合物的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的或显而易见的，并且在诸如Remington'sPharmaceuticalScience，第15版，MackPublishingCompany,Easton,Pa.(1980)的出版物中进行了更详细地描述。在一些情况下，通过本公开的HCV免疫原性组合物的肌内注射来实现免疫。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的本公开的组合物，所述组合物包含来自两个不同HCV基因型的E2多肽和/或E1/E2异二聚体复合物，如上文和下文所述，其中所述组合物包含药学上可接受的赋形剂。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型1a的E2多肽；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中所有多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型1a的全长E2多肽；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中所有多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型1a的可溶性E2多肽；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中所有多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型1a的E2多肽，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E1/E2异二聚体的E2多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型1a的E2多肽，其中E2多肽为野生型；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型3a的E2多肽；和HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中所有多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型3a的全长E2多肽；和HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中所有多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型3a的可溶性E2多肽；和HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中所有多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型3a的E2多肽，其中E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述；和HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E1/E2异二聚体的E2多肽为野生型。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型3a的E2多肽，其中E2多肽为野生型；和HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物，其中E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，以有效地中和在北美和在i.v.药物使用者当中最普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和3a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和3a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和3a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型1a的E2多肽或E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型2a的E2多肽或E1/E2异二聚体多肽复合物。在一些情况下，所有多肽为野生型。在一些情况下，基因型1a和基因型2a多肽都为E1/E2异二聚体多肽。在一些情况下，基因型1a多肽为E2多肽；并且基因型2a多肽为E1/E2异二聚体多肽复合物。在一些情况下，基因型1a多肽为E1/E2异二聚体多肽复合物；并且基因型2a多肽为E2多肽。在一些情况下，基因型1a和基因型2a多肽都为E2多肽。在一些情况下，基因型1a和基因型2a多肽都为可溶性E2多肽。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型诸如基因型1a、1b、2a、4、5和6a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a和2a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和2a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a和2a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a和2a的中和的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型诸如基因型1a、1b、2a、4、5和6a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，所述组合物不包括除上述基因型1a和2a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，主题组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的本公开的组合物，其包含来自3个不同HCV基因型的E2多肽和/或E1/E2异二聚体复合物，如上文和下文所述，其中所述组合物包含药学上可接受的赋形剂。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型1a的E2多肽；HCV基因型2a的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3a的E2多肽。在一些情况下，所有多肽为野生型。在其它情况下，E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在其它情况下，不存在于与E1的异二聚体复合物中的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，E2多肽的至少一个为全长。在一些情况下，E2多肽的至少一个为可溶性E2多肽。在一些情况下，以有效地中和全球普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，组合物不包括除上述基因型1a、2a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型2b的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型7a的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型1a的E2多肽；HCV基因型2a的E2多肽；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物。在一些情况下，所有多肽为野生型。在其它情况下，E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在其它情况下，不存在于与E1的异二聚体复合物中的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，E2多肽的至少一个为全长。在一些情况下，E2多肽的至少一个为可溶性E2多肽。在一些情况下，以有效地中和全球普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，组合物不包括除上述基因型1a、2a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型2b的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型7a的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2a的E2多肽；和HCV基因型3a的E2多肽。在一些情况下，所有多肽为野生型。在其它情况下，E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在其它情况下，不存在于与E1的异二聚体复合物中的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，E2多肽的至少一个为全长。在一些情况下，E2多肽的至少一个为可溶性E2多肽。在一些情况下，以有效地中和全球普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，组合物不包括除上述基因型1a、2a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型2b的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型7a的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2a的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3a的E2多肽。在一些情况下，所有多肽为野生型。在其它情况下，E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在其它情况下，不存在于与E1的异二聚体复合物中的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，E2多肽的至少一个为全长。在一些情况下，E2多肽的至少一个为可溶性E2多肽。在一些情况下，以有效地中和全球普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，组合物不包括除上述基因型1a、2a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型2b的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型7a的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型1a的E2多肽；HCV基因型2a的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物。在一些情况下，所有多肽为野生型。在其它情况下，E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在其它情况下，不存在于与E1的异二聚体复合物中的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，E2多肽的至少一个为全长。在一些情况下，E2多肽的至少一个为可溶性E2多肽。在一些情况下，以有效地中和全球普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，组合物不包括除上述基因型1a、2a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型2b的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型7a的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
在一些情况下，主题方法包括向有此需要的个体施用有效量的组合物，其包含：HCV基因型1a的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2a的E2多肽；和HCV基因型3a的E1/E2异二聚体多肽复合物。在一些情况下，所有多肽为野生型。在其它情况下，E1/E2异二聚体的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在其它情况下，不存在于与E1的异二聚体复合物中的E2多肽包含在E2N1和/或E2N6位点处的天冬酰胺的修饰(例如，取代)，诸如上文所述。在一些情况下，E2多肽的至少一个为全长。在一些情况下，E2多肽的至少一个为可溶性E2多肽。在一些情况下，以有效地中和全球普遍的HCV基因型的量施用组合物。在一些情况下，以有效地中和HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和抗体的量施用组合物。在一些情况下，以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的CTL应答的量施用组合物。在一些情况下，以有效地实现50％或大于50％的HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和的量施用组合物。在一些实施方案中，组合物不包括除上述基因型1a、2a和3a外的任何HCV基因型的E1多肽、E2多肽和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括至少一种另外的HCV基因型的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型2b的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。在一些实施方案中，组合物还包括HCV基因型7a的E1多肽、和E2多肽、和/或E1/E2多肽。
适于施用的个体
适于利用本公开的HCV组合物的施用的个体包括原初免疫个体(immunologicallyindividuals)(例如，还未被HCV感染的和/或仍未施用过HCV疫苗的个体)。
适于利用本公开的HCV组合物的施用的个体包括处于比一般人群更大的被HCV感染的风险中的个体，其中此类个体包括，例如，静脉内注射吸毒者；作为来自另一个(供体)个体的血液或血液制品的接受者或预期接受者的个体；作为来自另一个(供体)个体的非自体细胞、组织或器官的接受者或预期接受者的个体；医护人员；紧急医疗和非医疗人员(例如，第一反应者；消防战士；急救医护人员等)等。
适于利用本公开的HCV组合物的施用的个体包括最近暴露于HCV或最近被HCV感染的个体。例如，可向在对HCV的可能或怀疑的暴露之后或在HCV感染后约24小时至约48小时、约48小时至约1周、或约1周至约4周内的个体施用主题免疫原性组合物。
适于利用本公开的HCV组合物的施用的个体包括已被诊断为具有HCV感染的个体，并且包括慢性感染的个体。在一些情况下，用抗病毒剂和主题HCV免疫原性组合物治疗已被诊断为具有HCV感染的个体。用于治疗HCV感染的合适的抗病毒剂包括，例如，利巴韦林(1-β-D-呋核亚硝脲-1H-1,2,4-三唑-3-羧酰胺)；干扰素-α(IFN-α)(其中“IFN-α”包括IFN-α2a；IFN-α2b；缀合有聚(乙二醇)的IFN-α(“PEG化的IFN-α)，其中PEG化的IFN-α可以是PEG化的IFN-α2a或PEG化的IFN-α2b)；HCVNS3蛋白酶抑制剂(例如，博昔普韦；替拉瑞韦)；和HCVNS5蛋白酶抑制剂。在一些情况下，已被诊断为具有HCV感染的个体利用例如：1)IFN-α+利巴韦林；和主题HCV免疫原性组合物；或2)IFN-α+利巴韦林+HCV蛋白酶抑制剂(例如，博昔普韦或替拉瑞韦)；和主题HCV免疫原性组合物来治疗。作为一个非限制性实例，每月一次向已被诊断患有HCV感染的个体施用主题HCV免疫原性组合物，持续6个月。
实施例
提出以下实施例是为了向本领域一般技术人员提供如何制备和使用本发明的完整公开和描述，而非意图限制本发明人视为其发明的范围，也非意图表示以下实验是进行的全部或仅有的实验。已经做出努力以确保关于使用的数字(例如量、温度等)的正确性，但是应该考虑一些实验错误和偏差。除非另外指出，否则份是重量份，分子量为重均分子量，温度以℃计，并且压力等于或接近大气压。可使用标准缩写，例如，bp，碱基对；kb，千碱基；pl，皮升；s或sec，秒；min，分钟；h或hr，小时；aa，氨基酸；kb，千碱基；bp，碱基对；nt，核苷酸；i.m，肌内(地)；i.p.，腹膜内(地)；s.c，皮下(地)等。
实施例1:基因型特异性中和
材料和方法
山羊免疫
分别地，利用HCV1(基因型1a)衍生的E1E2和利用J6(基因型2a)衍生的E2来免疫山羊(G714和G757)和山羊(G766和G773)。分别地从HCV基因型1a菌株和HCV基因型2a菌株的序列衍生重组的E1E2和可溶性E2蛋白。从组成型地表达糖蛋白的中国仓鼠卵巢细胞系纯化重组E1E2蛋白；并且从表达E2糖蛋白的293T细胞的培养基纯化E2蛋白。向山羊施用由10μg纯化的蛋白质抗原(E2E1或E2)与基于角鲨稀的Addavax或弗氏佐剂一起组成的0.5ml实验性疫苗。在免疫后129天，在4次接种后收集用于该数据的接种后血清。将接种前收集的血清用作阴性对照。
体外中和测定
体外测试接种后山羊血清的针对细胞培养中产生的嵌合基因型1aH77c/JFH1或基因型2aJ6/JFH1HCV(HCVcc)的中和活性。
在感染前一天将1×104个Huh-7.5细胞/孔接种在多孔板中。为了进行感染，将300TCID50(中位组织培养感染剂量)HCVcc与以1:50(按体积)稀释的热灭活的山羊血清预混合，在37℃进行1小时。随后将预混合的HCVcc/山羊血清添加至细胞。感染后12小时，用新鲜培养基替换抗体-病毒接种物。随后在感染后48小时用2％多聚甲醛固定细胞。通过流式细胞术来定量感染的量，计数使用小鼠单克隆NS5A抗体(9E10)检测的NS5A阳性细胞的数目。通过与接种前血清比较来报告中和的百分比。
结果
使用体外中和测定来测试接种后山羊血清针对组织培养衍生的嵌合基因型1a(H77c/JFH1)或2a(J6/JFH1)的中和活性。用从基因型1a(G1a)的序列衍生的重组E1E2来免疫山羊(G714和G757)，然而用从基因型2a(G2a)的序列衍生的E2来免疫山羊(G766和G773)。G1a抗原诱导针对G1a嵌合病毒H77/JFH的强中和活性，但显示减小的针对G2a病毒J6/JFH的效率(图4)。在另一方面，来源于G2a的E2抗原诱导比针对G1a病毒更有效的针对G2a病毒的中和抗体。综上所述，所述数据表明需要抗原混合物来赋予全球疫苗的交叉基因型保护作用。
实施例2:基因型特异性中和
材料和方法
山羊免疫
分别地，利用HCV1(基因型1a)衍生的E1E2来免疫山羊(G757、G714)；利用HCV1(基因型1a)衍生的E1的胞外域来免疫山羊(G004、G752)；利用HCV1(基因型1a)衍生的E2的胞外域来免疫山羊(G786、G799)；利用J6(基因型2a)衍生的E2的胞外域来免疫山羊(G766、G733)。分别地从HCV基因型1a(H77)菌株和HCV基因型2a(J6)菌株的序列衍生E1E2蛋白、E1和E2的胞外域。从组成型地表达糖蛋白的中国仓鼠卵巢细胞系中纯化重组抗原。向山羊施用由10μg纯化的蛋白质抗原(E1E2)或等摩尔的E1或E2连同基于角鲨稀的AddaVax或不完全弗氏佐剂(IFA)一起组成的0.5ml实验性疫苗。在免疫后129天，在4次接种后收集用于该数据的接种后血清。将接种前收集的血清用作阴性对照。E1的胞外域和E2的胞外域是去除C端跨膜区的可溶性E1和E2多肽。
体外中和测定
在体外测试接种后的山羊血清的针对在细胞培养中产生的嵌合基因型1aH77c/JFH1或基因型2aJ6/JFH1HCV(HCVcc)的中和活性。
在感染前一天将1×104个Huh-7.5细胞/孔接种在多孔板中。为了进行感染，将300TCID50(中位组织培养感染剂量)HCVcc与以1:50(按体积)稀释的热灭活的山羊血清预混合，在37℃进行1小时。随后将预混合的HCVcc/山羊血清添加至细胞。感染后12小时，用新鲜培养基替换抗体-病毒接种物。随后在感染后48小时用2％多聚甲醛固定细胞。通过流式细胞术来定量感染的量，计数使用小鼠单克隆NS5A抗体(9E10)检测的NS5A阳性细胞的数目。通过与接种前血清比较来报告中和的百分比。
结果
测试疫苗诱导的抗体的交叉中和。用H77/JFH1(G1a)或J6/JFH(G2a)的组织培养物衍生的HCV预孵育1:50稀释的血清，随后将其用于感染Huh-7.5细胞。使用流式细胞术，通过NS5a染色来监测感染的水平。用一组接种前对照将中和活性的水平标准化为0％。将第二组接种前血清用于显示测定的变化。
结果示于图5和6中。在图5中，显示了山羊血清中和HCV基因型1a(作为“攻击病毒”的H77/JFH1的HCV)的能力。在图6中，显示了山羊血清中和HCV基因型2a(作为“攻击病毒”的J6/JFH1的HCV)的能力。
图5.山羊757、714、786和799(利用HCV1(G1a)衍生的抗原免疫的)的血清显示阻断G1a感染的中和抗体的诱导；然而，山羊766和773(利用J6(G2a衍生的抗原免疫的)的血清在阻断G1a(基因型1a)病毒的感染中具有有限的效率。
图6.山羊766和733(利用从基因型2a衍生的抗原免疫的)的血清显示比对G1a病毒的感染更大的对G2a(基因型2a)的感染的阻断。来自用从基因型1a衍生的抗原免疫的山羊(757、714、004、752、786、799)的血清具有有限的抗G2a病毒的中和活性。
实施例3：交叉中和
用来自HCV菌株HCV1(基因型1a)的E1/E2异二聚体复合物或用来自HCV菌株J6(基因型2a)的可溶性E2(sE2)免疫山羊。测试接种后的山羊血清的针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a和6a的中和活性。数据示于图7A和7B中。图7a中所示的数据显示利用来自HCV基因型1a的E1/E2的免疫引发针对所有测试的基因型(除2a、2b和3a外)的HCV的中和抗体；并且图7b显示利用来自HCV基因型2a的sE2的免疫引发针对基因型1b、2a、4a和6a的HCV的中和抗体。
虽然已参考其特定实施方案描述了本发明，但本领域技术人员应理解，在不背离本发明的真实精神和范围的情况下可进行各种改变和可替代等效物。另外，可进行许多修改来使特定的情况、材料、物质组成、方法、方法步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有此类修改旨在附于其的权利要求范围内。

Claims (47)

1.一种免疫原性组合物，其包含：
a)来自第一HCV基因型的丙型肝炎病毒(HCV)E1多肽、E2多肽或E1E2多肽；
b)来自第二HCV基因型的HCVE1多肽、E2多肽或E1E2多肽；和
c)药学上可接受的赋形剂，
条件是所述组合物包含至少一种E1多肽和至少一种E2多肽。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一HCV基因型为基因型1；并且所述第二HCV基因型为基因型2。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一HCV基因型为基因型1；并且所述第二HCV基因型为基因型3。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中组合物包含：
i)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E1/E2多肽；
ii)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E2多肽；
iii)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
iv)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；
v)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型2的E2多肽；
vi)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；
vii)HCV基因型1的E1多肽；和HCV基因型3的E2多肽；
viii)HCV基因型1的E1多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
ix)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型3的E1多肽；
x)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
xi)HCV基因型1的E1多肽；和HCV基因型2的E2多肽；
xii)HCV基因型1的E1多肽；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；
xiii)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型2的E1多肽；或
xiv)HCV基因型1的E2多肽；和HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其还包含第三HCV基因型的HCVE1、E2或E1/E2多肽。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中来自所述第一HCV基因型的HCVE2多肽为野生型，并且其中来自所述第二HCV基因型的HCVE2多肽为野生型。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中来自所述第一HCV基因型的HCVE2多肽为野生型，并且其中来自所述第二HCV基因型的HCVE2多肽包含E2N1位点和/或E2N6位点中的天冬酰胺的氨基酸取代。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中来自所述第一HCV基因型的HCVE2多肽包含E2N1位点和/或E2N6位点中的天冬酰胺的氨基酸取代，并且其中来自所述第二HCV基因型的HCVE2多肽为野生型。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂包含佐剂。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述佐剂为MF59、明矾、聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)或CpG寡核苷酸。
11.一种免疫原性组合物，其包含：
a)来自第一HCV基因型的丙型肝炎病毒(HCV)E1多肽、E2多肽或E1/E2多肽；
b)来自第二HCV基因型的HCVE1多肽、E2多肽或E1/E2多肽；
c)来自第三HCV基因型的HCVE1多肽、E2多肽或E1/E2多肽；和
d)药学上可接受的赋形剂，
条件是所述组合物包含至少一种E1多肽和至少一种E2多肽。
12.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述第一HCV基因型为基因型1，其中所述第二HCV基因型为基因型2，并且其中所述第三HCV基因型为基因型3。
13.根据权利要求11所述的免疫原性组合物，其中所述组合物包含：
i)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
ii)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E2多肽；
iii)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
iv)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
v)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E2多肽；
vi)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E2多肽；
vii)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
viii)HCV基因型1的E1多肽；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
ix)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E1多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
x)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E1多肽；
xi)HCV基因型1的E1多肽；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
xii)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E1多肽；和HCV基因型3的E1/E2异二聚体多肽复合物；
xiii)HCV基因型1的E1/E2异二聚体多肽复合物；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E1多肽；
xiv)HCV基因型1的E1多肽；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E2多肽；
xv)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E1多肽；和HCV基因型3的E2多肽；
xvi)HCV基因型1的E2多肽；HCV基因型2的E2多肽；和HCV基因型3的E1多肽；或
xvii)HCV基因型1的E1多肽；HCV基因型2的E1/E2异二聚体多肽复合物；和HCV基因型3的E2多肽。
14.根据权利要求11所述的组合物，其中来自所述第一HCV基因型的HCVE2多肽为野生型，其中来自所述第二HCV基因型的HCVE2多肽为野生型，并且其中来自所述第三HCV基因型的HCVE2多肽为野生型。
15.根据权利要求11所述的组合物，其中来自所述第一HCV基因型的HCVE2多肽为野生型，其中来自所述第二HCV基因型的HCVE2多肽为野生型，并且其中来自所述第三HCV基因型的HCVE2多肽包含E2N1位点和/或E2N6位点中的天冬酰胺的氨基酸取代。
16.根据权利要求11所述的组合物，其中来自所述第一HCV基因型的HCVE2多肽为野生型，其中来自所述第二HCV基因型的HCVE2多肽包含E2N1位点和/或E2N6位点中的天冬酰胺的氨基酸取代，并且其中来自所述第三HCV基因型的HCVE2多肽为野生型。
17.根据权利要求11所述的组合物，其中来自所述第一HCV基因型的HCVE2多肽包含E2N1位点和/或E2N6位点中的天冬酰胺的氨基酸取代，其中来自所述第二HCV基因型的HCVE2多肽为野生型，并且其中来自所述第三HCV基因型的HCVE2多肽为野生型。
18.根据权利要求11所述的组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂包含佐剂。
19.根据权利要求11所述的组合物，其中所述佐剂为MF59、明矾、聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)或CpG寡核苷酸。
20.一种在个体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求1至19中任一项所述的组合物。
21.一种组合物，其包含：
a)HCV基因型1a的丙型肝炎病毒(HCV)E2多肽；
b)HCV基因型3a的HCVE1/E2异二聚体多肽；和
c)药学上可接受的赋形剂。
22.根据权利要求21所述的组合物，其中所有所述多肽为野生型。
23.根据权利要求21所述的组合物，其中所述E2多肽为全长。
24.根据权利要求21所述的组合物，其中所述E2多肽为可溶性E2多肽。
25.一种组合物，其包含：
a)HCV基因型3a的丙型肝炎病毒(HCV)E2多肽或HCVE1/E2异二聚体多肽；
b)HCV基因型1a的HCVE2多肽或HCVE1/E2异二聚体多肽；和
c)药学上可接受的赋形剂。
26.根据权利要求25所述的组合物，其中所有所述多肽为野生型。
27.根据权利要求25所述的组合物，其中所述E2多肽为全长。
28.根据权利要求25所述的组合物，其中所述E2多肽为可溶性E2多肽。
29.一种在个体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求21-28中任一项所述的组合物，其中以有效地诱导针对至少HCV基因型1a和3a的中和抗体的量施用所述组合物。
30.一种在个体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求21-28中任一项所述的组合物，其中以有效地诱导针对至少HCV基因型1a和3a的细胞毒性T淋巴细胞应答的量施用所述组合物。
31.一种在个体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求21-28中任一项所述的组合物，其中以有效地实现50％或更大的HCV基因型1a和3a的中和的量施用所述组合物。
32.一种组合物，其包含：
a)HCV基因型2a的丙型肝炎病毒(HCV)E2多肽或HCVE1/E2异二聚体多肽；
b)HCV基因型1a的HCVE2多肽或HCVE1/E2异二聚体多肽；和
c)药学上可接受的赋形剂。
33.根据权利要求32所述的组合物，其中所有所述多肽为野生型。
34.根据权利要求32所述的组合物，其中所述E2多肽为全长。
35.根据权利要求32所述的组合物，其中所述E2多肽为可溶性E2多肽。
36.一种在个体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求32-35中任一项所述的组合物，其中以有效地诱导针对至少HCV基因型1a和2a的中和抗体的量施用所述组合物。
37.一种在个体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求32-35中任一项所述的组合物，其中以有效地诱导针对至少HCV基因型1a和2a的细胞毒性T淋巴细胞应答的量施用所述组合物。
38.一种在个体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求32-35中任一项所述的组合物，其中以有效地实现50％或更大的HCV基因型1a和2a的中和的量施用所述组合物。
39.一种组合物，其包含：
a)HCV基因型1a的丙型肝炎病毒(HCV)E2或HCVE1/E2异二聚体多肽；
b)HCV基因型2a的HCVE2多肽或HCVE1/E2异二聚体多肽；
c)HCV基因型3a的E2多肽或HCVE1/E2异二聚体多肽；和
d)药学上可接受的赋形剂。
40.根据权利要求39所述的组合物，其中所有所述多肽为野生型。
41.根据权利要求39所述的组合物，其中所述E2多肽的至少一种为全长。
42.根据权利要求39所述的组合物，其中所述E2多肽的至少一种为可溶性E2多肽。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的组合物，其包含HCV基因型7a的E1/E2多肽。
44.根据权利要求39-42中任一项所述的组合物，其包含HCV基因型7a的E2多肽。
45.一种在个体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求39-44中任一项所述的组合物，其中以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和抗体的量施用所述组合物。
46.一种在个体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求39-44中任一项所述的组合物，其中以有效地诱导针对HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的细胞毒性T淋巴细胞应答的量施用所述组合物。
47.一种在个体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的权利要求39-44中任一项所述的组合物，其中以有效地实现50％或更大的HCV基因型1a、1b、2a、2b、3a、4a、5a、6a和7a的中和的量施用所述组合物。
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