CN105255945B - 一种使用家蚕制备镇痛多肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使用家蚕制备镇痛活性多肽的方法，属于基因工程领域。所述制备方法如下：根据家蚕核型多角体病毒（BmNPV）密码子使用频率优化芋螺毒素ω‑MVIIA基因序列，经化学合成后连入供体质粒pFastBacDual，再引入绿色荧光蛋白（EGFP）基因，构建重组供体质粒pFBD‑MVIIA/EGFP。使用Bac‑to‑Bac方法将MVIIA/EGFP转座到BmNPV，形成重组病毒vBmMVIIA/EGFP。将重组病毒DNA转染至家蚕细胞，获得BV粒子，借助绿色荧光测定BV粒子滴度后，以200 pfu的BV粒子注射家蚕，感染5天后，收获家蚕血液。通过小鼠醋酸扭体试验证实，表达芋螺毒素ω‑MVIIA的受感染家蚕的血液具有显著的镇痛活性，平均扭体次数仅3.55次，明显高于注射生理盐水的对照组（37.30次）。本发明为表达具有镇痛活性的芋螺毒素ω‑MVIIA提供了新的方法，具有潜在的应用价值。
Description
技术领域
本发明公开了一种使用家蚕制备镇痛活性多肽的方法，属于基因工程领域。
背景技术
芋螺毒素是由海洋软体动物芋螺(Conus)分泌的一类用于自卫和捕食的活性肽类毒素。芋螺毒素分子质量小，通常由10-30个氨基酸残基组成，大多富含半胱氨酸，具有高度保守的二硫键骨架。芋螺毒素种类繁多，可达5万种以上，其一级结构多变，但信号肽及前导肽序列保守。根据保守的信号肽序列，芋螺毒素可分为：A、M、O、I、P、 S、T等超家族（superfamily），再依据家族中毒素的半胱氨酸骨架，结合其药理活性，又可分为α、μ、ω、δ、Ψ、σ、λ、κ、γ等家族（family）。芋螺毒素能特异性地作用于体内多种（钾、钠、钙等）离子通道、细胞膜上的各种神经递质和激素的受体，从而干扰细胞或神经中的信号传递。因此，在治疗慢性疼痛、急性疼痛、癫痫、神经保护、心血管疾病、精神失常、运动失调、痉挛症、癌症及中风等方面具有广泛的应用前景。如O-超家族中的ω-芋螺毒素可直接作用于钙离子通道，阻断痛觉传递，并具有镇痛效应。由于芋螺毒素在作为分子探针用于神经药理研究及作为新型药物前导物开发临床用新药方面具有极高的研究和利用价值。在芋螺毒素中，ω-MVIIA来源于海洋生物幻芋螺（Conus magus，也称僧袍芋螺），能特异地阻断钙离子通道，阻止疼痛信号的传导，以其为有效成分的Ziconotide（商品名PrialtTM）已被FDA批准用于治疗慢性疼痛（Terlau, Olivera. Conus venoms: a rich source of novel ion channel-targeted peptides. Physiol Rev. 2004, 84: 41-68）。
目前，芋螺毒素的获得主要是依赖于芋螺的天然毒液的提取。但是，由于芋螺中芋螺毒素含量低，且大量采集海洋生物也不利于保持生态平衡。因此，利用经典的生化提取的方法直接从芋螺中分离芋螺毒素已经难以满足研究和药物生产的需要，从而使芋螺毒素的深入研究及开发受到一定限制。许多科学家希望采用多肽固相合成的方法来解决这一困难，其技术路线是通过分离天然芋螺毒素后测序或采用基因克隆方式获得芋螺毒素序列，然后采用人工化学合成获得更多量的芋螺毒素。一些结构简单的芋螺毒素，如已经得到应用的ω-MVIIA，已可通过化学合成法来获得。但是人工合成芋螺毒素的成本很高，还不能完全满足作为药物商业化生产的要求。因此，有科学家提出可将芋螺毒素的基因转化到大肠杆菌或酵母等微生物中表达，但芋螺毒素的氨基酸序列短，后期分离纯化比较困难，且翻译后修饰复杂，在微生物表达系统中无法解决C端酰胺化的问题，不能获得高活性的重组芋螺毒素（Zhan et al. A fusion protein of conotoxin MVIIA and thioredoxinexpressed in Escherichia coli has significant analgesic activity. BiochemBiophys Res Commun. 2003, 311: 495-500）。
家蚕杆状病毒表达系统是以家蚕核型多角体病毒（BmNPV）为载体，家蚕为宿主的昆虫杆状病毒表达载体系统，其操作安全、表达水平高，能对重组蛋白进行糖基化、信号肽切除等翻译后加工，获得的重组蛋白具有比较完整的生物学功能。特别关键的是，研究发现家蚕抗菌肽CMIV具有C端酰胺化（屈贤铭,吴克佐,邱雪贞.经聚肌胞苷酸诱导家蚕蛹血淋巴中六种抗菌体的分离与鉴定.生物化学与生物物理学报. 1986,18(3):284-291），说明家蚕中存在酰胺化途径，在家蚕中有望解决芋螺毒素ω-MVIIA的C端酰胺化的问题，从而获得高活性的重组ω-MVIIA。此外，家蚕杆状病毒表达系统也可用于开发家蚕生物反应器，成本低廉，易于产业化。
本发明利用基因工程技术，构建了携带芋螺毒素ω-MVIIA基因的重组BmNPV病毒，采用小鼠醋酸扭体试验证实，表达芋螺毒素ω-MVIIA的受感染家蚕的血液具有显著的镇痛活性。本发明为表达具有镇痛活性的芋螺毒素ω-MVIIA提供了新的方法，具有潜在的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中对基因工程表达芋螺毒素ω-MVIIA的不足而公开一种表达具有镇痛活性的重组芋螺毒素的制备方法及其应用。
本发明通过以下技术方案实现上述目的：
（1）根据BmNPV密码子使用频率优化芋螺毒素ω-MVIIA基因序列；
（2）合成优化后的ω-MVIIA基因，经BamHI/HindIII双酶切后，连入经同样酶切的供体质粒pFastBacDual，并连入绿色荧光蛋白（EGFP）基因，构建重组供体质粒pFBD-MVIIA/EGFP；
（3）采用Bac-to-Bac法，将重组供体质粒pFBD-MVIIA/EGFP上的ω-MVIIA基因和EGFP基因转座到BmNPV，通过蓝白斑筛选，获得含有重组BmNPV的白色大肠杆菌菌落，从大肠杆菌中提取BmNPV基因组DNA，并进行PCR鉴定，筛选出含有ω-MVIIA基因的重组BmNPV，将其命名为vBmMVIIA/EGFP；
（4）重组病毒感染的家蚕血液的镇痛活性的验证：经脂质体转染获得重组病毒BV粒子（出芽型病毒粒子），借助绿色荧光检测病毒滴度；用重组病毒的BV粒子注射家蚕，借助绿色荧光收集感染家蚕的血液，采用小鼠醋酸扭体法证实，该血液制备物具有显著的镇痛活性。
本发明的有益效果：
本发明根据家蚕核型多角体病毒（BmNPV）高效表达基因的密码子使用频率，优化了芋螺毒素ω-MVIIA基因序列，使之适合在BmNPV的天然宿主家蚕中表达。经化学合成密码子优化的芋螺毒素ω-MVIIA基因后，借助基因工程手段，ω-MVIIA基因导入BmNPV，获得重组病毒。小鼠醋酸扭体实验证实，受携带芋螺毒素ω-MVIIA基因的重组病毒感染的家蚕血液具有明显的镇痛活性，小鼠的平均扭体次数仅为3.55次，明显高于生理盐水对照组（37.30次）。本发明还在重组病毒中导入了绿色荧光蛋白（EGFP）基因，借助绿色荧光不仅能检测重组病毒BV粒子的滴度，还能检测接种病毒的家蚕是否有效感染重组病毒。利用本发明所述方法，有望利用易于饲养的家蚕大量表达具有镇痛活性的芋螺毒素ω-MVIIA，为其应用奠定基础。
附图说明
图1：ω-MVIIA基因的密码子优化。1：原始的ω-MVIIA基因序列，2：密码子优化的ω-MVIIA基因序列，3：编码的ω-MVIIA前体蛋白序列。
图2：重组BmNPV的PCR鉴定结果。M：DNA marker；1-4：重组BmNPV扩增产物。
图3：病毒感染的家蚕。1：普通BmNPV（vBm）感染的家蚕，无绿色荧光，2：感染重组BmNPV vBmMⅦA/EGFP的家蚕，呈肉眼可见的绿色荧光。
图4：镇痛活性分析结果。vBmMVIIA/EGFP：重组病毒vBmMVIIA/EGFP感染的家蚕血液样品，0.9%NaCl：对照组。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
本发明实施例所用的载体pFastBacDual易被类似功能的载体替换，本发明所用的BmNPV病毒及家蚕也可被同类病毒及昆虫宿主替换。
实施例1：芋螺毒素ω-MVIIA基因的合成与重组BmNPV的构建
在对家蚕核型多角体病毒（BmNPV）poh、gp64、VP39等高效表达基因（GenBank：L33180）进行密码子使用频率分析的基础上，对芋螺毒素ω-MVIIA基因（GenBank：FJ959111）的密码子进行优化（见图1），经密码子优化的ω-MVIIA基因的序列为SEQ IDNO.1，其编码的ω-MVIIA前体蛋白序列为SEQ ID NO.2。
采用化学方法合成ω-MVIIA基因（由上海捷瑞生物技术有限公司合成），经BamHI/HindIII双酶切后，连入经同样酶切的供体质粒pFastBacDual（购自Invitrogen公司），形成重组质粒pFBD-MVIIA。使用引物对P1/P2（SEQ ID NO.3；SEQ ID NO.4）扩增绿色荧光蛋白（EGFP）基因，经KpnI/XhoI双酶切后，连入pFBD-MVIIA，进一步得到重组质粒pFBD-MVIIA/EGFP。重组质粒经DNA测序验证后，进行后续操作。
采用通用的Bac-to-Bac法，将重组供体质粒pFBD-MVIIA/EGFP上的ω-MVIIA基因和EGFP基因转座到BmNPV，通过蓝白斑筛选，获得含有重组BmNPV的白色大肠杆菌菌落，从大肠杆菌中提取BmNPV基因组DNA，并进行PCR鉴定，筛选出含有ω-MVIIA基因的重组BmNPV（见图2），将其命名为vBmMVIIA/EGFP。
实施例2：重组ω-MVIIA的表达与镇痛活性分析
采用脂质体法将提取的vBmMⅦA/EGFP DNA转染离体培养的家蚕细胞，培养5天后，在荧光显微镜下可观察到绿色荧光。收集细胞培养物，离心后取上清液，再次转接到离体培养的家蚕细胞，反复接种扩增病毒，可在荧光显微镜下观察到强烈的荧光信号。采用终点稀释法，借助绿色荧光测定重组病毒vBmMVIIA/EGFP的BV粒子的滴度，为1.6×107pfu/mL。
适当稀释高滴度的重组病毒液，以200 pfu的BV粒子注射5龄家蚕，感染5天后，重组病毒vBmMⅦA/EGFP感染的家蚕体表呈现强烈的绿色荧光，而用不含ω-MVIIA基因和EGFP基因的普通BmNPV（vBm）感染的家蚕无绿色荧光（见图3）。
收集体表具绿色荧光的家蚕的血液，离心后上清液用于分析镇痛效应。取300 mL蚕血上清液注射20只雄性小鼠，每只小鼠的体重为20±0.2 g的小鼠，对照组小鼠只注射生理盐水（0.9% NaCl），45min后注射0.2 mL 0.6%醋酸刺激扭体行为，对20 min内每只小鼠的扭体动作进行计数，然后对实验数据进行统计分析。结果表明，注射生理盐水的对照组有明显的扭体行为，20min内平均扭体次数为37.30次，而注射重组病毒感染的家蚕血液的小鼠的扭体次数为3.55次（见图4），明显高于对照组，这表明，表达ω-MVIIA的家蚕血液具明显的镇痛效应。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏大学
<120> 一种使用家蚕制备镇痛多肽的方法
<130> 一种使用家蚕制备镇痛多肽的方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 216
<212> DNA
<213> 幻芋螺（Conus magus）
<400> 1
atgaaactga cgtgtgttgt gatcgttgcc gtgctgttgc ttacggcgtg tcaactcatc 60
acagcagatg acagccgtgg cacgcagaag catcgtgcct tgcgctcgac caccaaattg 120
agtatgtcta ctcgctgcaa gggtaaaggc gcgaaatgta gccgtctgat gtatgactgc 180
tgcaccggct cgtgccgcag tggtaaatgt ggctaa 216
<210> 2
<211> 71
<212> PRT
<213> 幻芋螺（Conus magus）
<400> 2
Met Lys Leu Thr Cys Val Val Ile Val Ala Val Leu Leu Leu Thr Ala
1 5 10 15
Cys Gln Leu Ile Thr Ala Asp Asp Ser Arg Gly Thr Gln Lys His Arg
20 25 30
Ala Leu Arg Ser Thr Thr Lys Leu Ser Met Ser Thr Arg Cys Lys Gly
35 40 45
Lys Gly Ala Lys Cys Ser Arg Leu Met Tyr Asp Cys Cys Thr Gly Ser
50 55 60
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65 70
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttaggtacca tggtgagcaa gggcgagga 29
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gcactcgagt tacttgtaca gctcgtccat g 31
Claims (5)
1.一种使用家蚕制备镇痛活性多肽的制备方法，其特征在于，具体操作包含以下步骤：
（1）根据BmNPV密码子使用频率优化芋螺毒素ω-MVIIA基因序列，经密码子优化的ω-MVIIA基因的序列为SEQ ID NO.1，其编码的ω-MVIIA前体蛋白序列为SEQ ID NO.2；
（2）导入EGFP基因，构建重组供体质粒pFBD-MVIIA/EGFP；
（3）筛选含有ω-MVIIA基因的重组BmNPV病毒vBmMVIIA/EGFP，即重组芋螺毒素ω-MVIIA。
2.根据权利要求1所述的一种使用家蚕制备镇痛活性多肽的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述构建重组供体质粒pFBD-MVIIA/EGFP具体方法为：首先合成优化后的ω-MVIIA基因，经BamHI/HindIII双酶切后，连入经同样酶切的供体质粒pFastBacDual，并连入EGFP基因，得到重组供体质粒pFBD-MVIIA/EGFP。
3.根据权利要求1所述的一种使用家蚕制备镇痛活性多肽的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述筛选含有ω-MVIIA基因的重组BmNPV病毒vBmMVIIA/EGFP的具体方法为：采用Bac-to-Bac法，将重组供体质粒pFBD-MVIIA/EGFP上的ω-MVIIA基因和EGFP基因转座到BmNPV，通过蓝白斑筛选，获得含有重组BmNPV的白色大肠杆菌菌落，从大肠杆菌中提取BmNPV基因组DNA，并进行PCR鉴定，筛选出含有ω-MVIIA基因的重组BmNPV，将其命名为vBmMVIIA/EGFP。
4.一种根据权利要求1所述方法获得的重组芋螺毒素ω-MVIIA，所述重组芋螺毒素ω-MVIIA具有镇痛活性。
5.根据权利要求4所述的重组芋螺毒素ω-MVIIA在制备镇痛药物中的应用。
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| Effects of single and mixed infections with wild type and genetically modified Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus on movement behaviour of cotton bollworm larvae;Liljana Georgievska等;《 Entomologia Experimentalis Et Applicata》;20101231;56-67 |
| 类芋螺毒素基因的克隆及其斜纹夜蛾重组杆状病毒转移载体的构建;孙兴鲁等;《中国蚕业》;20110501;8-13 |
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