CN105255860B - 一种能使ctab法提取到真菌高质量基因组dna的方法 - Google Patents
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Abstract
一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，属于分子生物技术领域。CTAB法提取DNA的接种选用含菌种的细沙直接接种、和/或用孢子悬液接种后再添加细沙培养、和/或培养的菌丝在提取DNA磨样时添加细沙磨样，至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末）时止。上述一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，可以显著提高提取的DNA的含量，并且对DNA的品质及得率都有显著提高；且该方法操作方便、实验稳定性强、可重复性高、准确快捷，在满足DNA提取质量的同时，又可在磨样环节大大节省劳动强度，即使大量提取DNA样品时一样有较高的磨样速度，极大的缩短了磨样时间与人磨样的疲劳度及提取失败的概率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物技术领域，具体为一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法。
背景技术
DNA是遗传信息的载体，是重要遗传物质。基因组DNA提取作为分子实验中基础而重要的技术手段应用在各个研究领域。很多研究需要大量实验材料，一定数量及高质量的DNA样品是进行PCＲ扩增、限制性酶切、Southern 杂交、测序等分子生物学研究的保障。DNA提取工作量大，而且纯度要求高，DNA的提取质量和效率严重影响实验结果。因此，用合适的方法获取高质高量的DNA显得极为重要。DNA的提取方法有很多，常用的方法有CTAB法、SDS法等，这些DNA提取方法在原理上基本一致，都是先裂解细胞，再利用有机溶剂进行多次抽提，使蛋白质等沉淀于有机溶剂中，而核酸保留在水相中。由于不同材料在化学成分、组织结构等方面的差异，使不同方法对某一具体材料的提取效率差异很大。其中，CTAB法是一种快速简便的提取总DNA的方法，主要采用机械破碎真菌细胞，然后加入CTAB液分离缓冲液将DNA溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。对于真菌而言，其细胞中含有较多的蛋白质、糖类、酚类、脂类、色素及其它干扰物，要获取完整的高质量DNA，需要一种高效稳定的方法。因此很多科研工作者都在试图寻找一种既快速便捷又能保证基因组DNA质量 的方法。CTAB及SDS法提取DNA的效果虽还算理想，但也有较大的不足之处，其中，CTAB法虽然可以有效去除真菌材料中的酚类等杂质，但步骤繁琐，耗时过长，DNA提取量不大，使所获DNA浓度及纯度不够高，导致后续实验的成功率受限。SDS法虽可快速提取基因组DNA应用于分子标记，但提取的DNA仅局限于分子标记等对DNA质量要求不高的实验，很难满足对DNA质量要求高的分子实验，如基因克隆、分子杂交等。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法的技术方案，该方法能显著提高DNA的含量、质量及得率，在分子实验中有应用价值。
所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于用CTAB法提取DNA的接种时直接用保菌的含目的菌的细沙接种、和/或用配制的孢子悬液均匀涂板接种后再加入细沙培养、和/或培养的菌丝在提取DNA磨样时加入细沙磨样，所有样品均需磨样至菌丝呈现丝滑状超细粉末时止。
所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于用CTAB法提取DNA的接种时直接用保菌的含目的菌的细沙接种、配制的孢子悬液均匀涂板接种后再加入细沙培养和培养的菌丝在提取DNA磨样时加入细沙磨样；具体包括以下步骤：
1)在SDAY平板上铺上一层灭菌后的玻璃纸，加入80-120µL的0.02%吐温水，再用含保有目的菌的60-120目细沙0.05-0.12g接种至SDAY玻璃纸上；
2）再取100 µL用灭菌后的0.02%吐温水配制成的1×107个/ml的孢子悬液均匀涂板接种，然后添加60-120目灭菌后的细沙0.05-0.12 g至接种后的平板上，最后24-26℃培养2-3天；
3)2-3天后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70℃冰箱预冷的研钵中，再加入60-120目的灭菌后的细沙0.05-0.12g，然后再加液氮进行快速研磨2-8 min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末时止，最后按照CTAB法步骤操作，提取过程减少在空气中暴露，所有离心过程使用冷冻离心机在3-5℃下离心。
所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于CTAB法提取DNA的接种时用保菌的含目的菌的细沙直接接种包括以下步骤：
1)在SDAY平板上铺上一层灭菌后的玻璃纸，加入100-200 µL的0.02%吐温水，再用含保有目的菌的60-120目细沙0.1-0.4g接种至SDAY玻璃纸上用涂棒均匀涂板, 24-26ºC培养2-3天；
2）然后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70℃冰箱预冷的研钵中，加液氮进行快速研磨2-8 min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末时止，再按照CTAB法步骤操作，提取过程减少在空气中暴露，所有离心过程使用冷冻离心机在4℃下进行。
所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于CTAB法提取DNA的孢子悬液涂板后添加细沙方式接种包括以下步骤：
1）用灭菌后的0.02%吐温水配制成1×107个/ml的孢子悬液，取100-200 µL悬液用涂棒均匀涂板接种于SDAY平板表面的玻璃纸上，再添加60-120目灭菌后的细沙0.1-0.4 g至接种的平板上，然后24-26℃培养2-3天；
2）然后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70℃冰箱预冷的研钵中，加液氮进行快速研磨2-8 min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末时止，再按照CTAB法步骤操作，提取过程应尽量减少在空气中暴露，所有离心过程使用冷冻离心机在4℃下离心。
所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于CTAB法用培养的菌丝在提取DNA磨样时加入细沙磨样包括以下步骤：
1)用含目的菌的细沙和/或配制成的1×107个/ml的孢子悬液接种于SDAY平板表面的玻璃纸上，24-26℃培养2-3天；
2)然后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70℃冰箱预冷的研钵中，加入60-120目的灭菌后的细沙0.1-0.4 g加液氮进行快速研磨2-8 min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末（约600-1000目）时止，再按照CTAB法步骤操作，提取过程减少在空气中暴露，所有离心过程使用冷冻离心机在3-5℃下离心。
所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于步骤1）中：加入120-180 µL的0.02%吐温水，再加入80-100目含目的菌种的细沙0.2-0.3 g至SDAY玻璃纸上用涂棒涂板均匀, 25℃培养2.5天；步骤2）中：研磨时间为3-7 min，优选为4-6min。
所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于步骤1）中：取120-160 µL 1×107个/ml孢子悬液涂板均匀后，再添加80-100目灭菌后的细沙0.2-0.3 g至平板上，25℃培养2.5天；步骤2）中：研磨时间为3-7 min，优选为4-6 min。
所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于步骤1）中：取120-180 µL孢子悬液直接用涂棒均匀涂板接种于SDAY平板表面的玻璃纸上，25℃培养2.5天；步骤2)中加入80-100目的灭菌后的细沙0.2-0.3 g加液氮进行快速研磨3-5 min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末（约600-1000目）时止。
所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于所述的真菌为球孢白僵菌、绿僵菌或蛹虫草等丝状真菌。
上述一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，可以显著提高提取的DNA的含量，并且对DNA的品质及得率都有显著提高，适用性很强。该方法操作方便，实验稳定性强，可重复性高，快捷实用，在保证DNA提取质量的同时，可节省磨样时间，即使大量提取DNA样品时也同样有较高的磨样速率，一般在2-8 min内就可以完成磨样，显著缩短磨样时间，减轻磨样疲劳度，提高样本提取的成功率。而且，提取的DNA经浓度、纯度检测、PCR扩增、片段克隆、聚丙烯酰胺凝胶电泳等分子实验验证，均表明利用本方法提取的基因组DNA从浓度、纯度、质量完全可应用于需要DNA的分子实验，如分子杂交、基因克隆及分子标记等。
本申请文件中涉及的百分含量除另有说明外，其余均为纯物质的重量百分依含量。
附图说明
图1为实施例1-3提取的基因组凝胶电泳检测结果；实施例1：泳道1-3；实施例2：泳道4-6；实施例3：泳道7-9；M：marker IV；对照ck：泳道11-13；
图2为实施例4-6提取的基因组凝胶电泳检测结果；实施例4：泳道1-3；实施例5：泳道5-7；实施例6：泳道9-11；M：marker IV；对照ck：泳道13-15。
具体实施方式
下面再结合具体实施例和对比试验对本发明作进一步的说明。
实施例1
用灭菌后的0.02%吐温水配制成1×107个/ml的孢子悬液，取100 µL悬液直接用涂棒均匀涂板接种于SDAY平板表面的玻璃纸上，25℃培养2.5天。然后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70℃冰箱预冷的研钵中，加入60目的灭菌后的细沙0.3 g加液氮进行快速研磨3min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末（600-1000目）时止，再按照CTAB法步骤操作，提取过程尽量减少在空气中暴露，所有离心过程使用冷冻离心机在4℃下离心。
实施例2
用灭菌后的0.02%吐温水配制成1×107个/ml的孢子悬液，取150 µL悬液用涂棒均匀涂板接种于SDAY平板表面的玻璃纸上，再添加70目的灭菌后的细沙0.1 g，25℃培养2.5天。然后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70℃冰箱预冷的研钵中，加液氮进行快速研磨4 min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末（600-1000目）时止，再按照CTAB法步骤操作，提取过程尽量减少在空气中暴露，所有离心过程使用冷冻离心机在4℃下离心。
实施例3
在SDAY板上铺上一层灭菌后的玻璃纸，加入120μL的0.02%吐温水，再加入80目适量（0.2 g）含目的菌种的细沙至SDAY玻璃纸上用涂棒涂板均匀；25℃培养3天。然后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70℃冰箱预冷的研钵中，加液氮进行快速研磨5min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末（600-1000目）时止，再按照CTAB法步骤操作，提取过程尽量减少在空气中暴露，所有离心过程使用冷冻离心机在4℃下离心。
实施例4
在SDAY板上铺上一层灭菌后的玻璃纸，加入150μL的0.02%吐温水，再加入120目适量（0.15g）含目的菌种的细沙至SDAY玻璃纸上用涂棒涂板均匀，25℃培养2天。然后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70℃冰箱预冷的研钵中，加入液氮进行快速研磨6min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末时止，再按照CTAB法步骤操作，提取过程尽量减少在空气中暴露，所有离心过程使用冷冻离心机在4℃下离心。
实施例5
用灭菌后的0.02%吐温水配制成1×107个/ml的孢子悬液，取180 µL悬液用涂棒均匀涂板接种于SDAY平板表面的玻璃纸上，再添加90目的灭菌后的细沙0.1g至平板上，25℃培养2.5天。然后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70℃冰箱预冷的研钵中，加液氮进行快速研磨3min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末时止，再按照CTAB法步骤操作，提取过程尽量减少在空气中暴露，所有离心过程使用冷冻离心机在4℃下离心。
实施例6
在SDAY板上铺上一层灭菌后的玻璃纸，加入100 µL的0.02%吐温水，再加入100目0.05g含目的菌种的细沙至SDAY平板的玻璃纸上，再加入配制成的1×107个/ml的孢子悬液100 µL涂板均匀接种于SDAY平板表面的玻璃纸上，然后添加80目灭菌后的细沙0.08g至接种后的平板上，25℃培养2天；2天后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70℃冰箱预冷的研钵中，再加入120目的灭菌后的细沙0.12g，并加液氮进行快速研磨6 min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末时止，最后按照CTAB法步骤操作，提取过程减少在空气中暴露，所有离心过程使用冷冻离心机在4℃下离心。
为进一步说明本发明的有益效果，下面通过试验说明本发明接种方式和磨样方式对提取的DNA含量与质量的影响。
试验1：试验采用浙江大学生命科学学院微生物研究所提供的球孢白僵菌野生菌株Bb2860（WT）,（NCBI登录号: EJP69119.1, EJP65371.1, EJP70746.1,EJP62160.1）的单基因敲除突变菌株及其基因回补菌株，将按实施例1方法，及按实施例2方法，按实施例3方法，及按传统CTAB法分别提取各菌株的DNA，并凝胶电泳及测其含量（浓度）。其中试验结果如表1和图1所示。
试验结果表明：以实施例1-3得到的DNA含量(浓度）平均值为6318.8，对照组平均值为1317.8，实施例1-3显著高于对照组。其中，A260/A280的波动范围均在1.81-1.87之间，说明DNA未受蛋白质或酚类物质污染，RNA含量少，DNA的质量较好，纯度较高。因此本方法提取的DNA质量和浓度都比较理想，符合标准。
琼脂糖电泳检测：用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量是一种常用的检测手段，3 µL提取的 DNA样品用0.7%琼脂糖凝胶电泳如图1所示。
图1电泳检测结果表明：实施例1-3所在泳道条带清晰、明亮，所有电泳条带均无杂带，且无非特异带，显示DNA降解少、纯度高。明显优于对照组CK。表明该方法提取的DNA质量较好， 完全可用于分子杂交、PCR扩增及分子标记等实验。
实验结果如表二：
试验结果表明：以实施例4-6得到的DNA含量(浓度）平均值为6529.2，对照组平均值为1356.7，实施例4-6显著高于对照组。其中，A260/A280的波动范围均在1.80-1.90之间，说明DNA未受蛋白质或酚类物质污染，RNA含量少，DNA的质量较好，纯度较高。因此本方法提取的DNA质量和浓度也都比较理想，符合标准。
采用不同的基因进行同样的试验，均能达到相同的有益效果。其中，实施例6虽然操作略为繁琐，但是试验效果最好，无论从提取的DNA质量与浓度上均明显优于实施例1-5。且A260/A280的波动范围在1.80-1.82之间，质量比较稳定，RNA和蛋白等污染几乎不存在。说明若能同时满足接种要求，并结合磨样进行控制，得到的DNA的含量及质量最好，得率也会有显著提高，该方法简便但具有较大的应用价值。
图2电泳检测结果表明：实施例4-6所在泳道条带清晰、明亮，所有电泳条带均无杂带，且无非特异带，显示DNA降解少、纯度高。明显优于对照组CK。其中实施例6电泳条带最明亮。表明该方法提取的DNA质量均较好，完全可用于分子杂交、PCR扩增及分子标记等实验，实施例6得到的DNA质量最好。
从上述试验的数据可以看出，细沙直接接种、悬液接种后培养时混入细沙培养和磨样时额外添加细沙等处理方式均可显著提高提取的DNA含量（浓度）、质量及得率。但若能同时满足各类要求，并结合磨样方法进行控制，得到的DNA的含量及质量最高，得率也会有显著提高，该方法简便但具有较大的应用价值。另外，鉴于这类接种、培养和磨样技术控制的方法可以提高真菌提取的DNA含量的启示，亦可以对其他生物体的DNA提取方法或技术进行改进与优化。
Claims (7)
1.一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于用CTAB法提取DNA的接种时直接用保菌的含目的菌的细沙接种、和/或用配制的孢子悬液均匀涂板接种后再加入细沙培养、培养的菌丝在提取DNA磨样时加入细沙磨样，所有样品均需磨样至菌丝呈现丝滑状超细粉末时止；
CTAB法提取DNA的接种时用保菌的含目的菌的细沙直接接种包括以下步骤：
1)在SDAY平板上铺上一层灭菌后的玻璃纸，加入100-200 µL的0.02%吐温水，再用含保有目的菌的60-120目细沙0.1-0.4g接种至SDAY玻璃纸上用涂棒均匀涂板， 24-26ºC培养2-3天；
2）然后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70℃冰箱预冷的研钵中，加液氮进行快速研磨2-8min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末时止，再按照CTAB法步骤操作，提取过程减少在空气中暴露，所有离心过程使用冷冻离心机在4℃下进行；
CTAB法提取DNA的孢子悬液涂板后添加细沙方式接种包括以下步骤：
1）用灭菌后的0.02%吐温水配制成1×107个/ml的孢子悬液，取100-200 µL悬液用涂棒均匀涂板接种于SDAY平板表面的玻璃纸上，再添加60-120目灭菌后的细沙0.1-0.4 g至接种的平板上，然后24-26℃培养2-3天；
2）然后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70℃冰箱预冷的研钵中，加液氮进行快速研磨2-8min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末时止，再按照CTAB法步骤操作，提取过程应尽量减少在空气中暴露，所有离心过程使用冷冻离心机在4℃下离心；
CTAB法用培养的菌丝在提取DNA磨样时加入细沙磨样包括以下步骤：
1)用含目的菌的细沙和/或配制成的1×107个/ml的孢子悬液接种于SDAY平板表面的玻璃纸上，24-26℃培养2-3天；
2)然后刮取玻璃纸上的菌丝放入-70℃冰箱预冷的研钵中，加入60-120目的灭菌后的细沙0.1-0.4 g加液氮进行快速研磨2-8 min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末时止，再按照CTAB法步骤操作，提取过程减少在空气中暴露，所有离心过程使用冷冻离心机在3-5℃下离心；
所述丝滑状超细菌丝 粉末为600-1000目。
2.如权利要求1所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于CTAB法提取DNA的接种时用保菌的含目的菌的细沙直接接种的步骤1）中：加入120-180 µL的0.02%吐温水，再加入80-100目含目的菌种的细沙0.2-0.3 g至SDAY玻璃纸上用涂棒涂板均匀，25℃培养2.5天；步骤2）中：研磨时间为3-7 min。
3.如权利要求1所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于CTAB法提取DNA的孢子悬液涂板后添加细沙方式接种的步骤1）中：取120-160 µL 1×107个/ml孢子悬液涂板均匀后，再添加80-100目灭菌后的细沙0.2-0.3 g至平板上，25℃培养2.5天；步骤2）中：研磨时间为3-7 min。
4.如权利要求1所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于CTAB法用培养的菌丝在提取DNA磨样时加入细沙磨样的步骤1）中：取120-180 µL孢子悬液直接用涂棒均匀涂板接种于SDAY平板表面的玻璃纸上，25℃培养2.5天；步骤2)中加入80-100目的灭菌后的细沙0.2-0.3 g加液氮进行快速研磨3-5 min至菌丝最终呈现丝滑状超细粉末时止。
5.如权利要求1所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于所述的真菌为球孢白僵菌、绿僵菌或蛹虫草。
6.如权利要求2所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于步骤2）中：研磨时间为优选为4-6 min。
7.如权利要求3所述的一种能使CTAB法提取到真菌高质量基因组DNA的方法，其特征在于步骤2）中：研磨时间为4-6 min。
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Legal Events
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20180810 Termination date: 20211123 |