CN105242038A - 一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生elisa的快速检测方法 - Google Patents

一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生elisa的快速检测方法 Download PDF

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李璐
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Abstract

本发明公开了一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，包括MG分子印迹膜的制备、模板的洗脱、半抗原的合成、酶标抗原的合成和检测，利用多巴胺自聚合原理制备MG分子印迹聚合物膜，并将此MG-MIPs作为仿生抗体，利用它对MG抗原和酶标记MG抗原的竞争性吸附，建立直接竞争的ELISA快速检测方法。由于所制备的MG-MIPs膜厚度小，使该检测方法具有灵敏和快速的特点，以合成的分子印迹薄膜作为仿生抗体，不仅具有选择特异性，而且能够实现对残留孔雀石绿的快速检测。

Description

一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法
技术领域
本发明涉及化学检测技术领域，具体是一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法。
背景技术
孔雀石绿（MalachiteGreen）是一种三苯甲烷类物质，又称为盐基块绿、碱性孔雀绿、孔雀绿、碱性绿、中国绿或苯胺绿，为具有金属光泽的深绿色结晶状固体。孔雀石绿具有严重的致癌、致畸和致突变等副作用，2002年我国己将其列入“食品动物禁用的兽药及其化合物清单”及水产养殖禁用药物中。但由于其杀菌效果好，价格便宜，导致有些养殖户还在继续使用，因而发展高通量、准确的水产品孔雀石绿残留检测方法十分重要。
目前我国有关水产品MG的检测方法大多还是基于HPLC和HPLC-MS/MS。这些检测方法存在样品前处理复杂，检测成本高等缺点。因此发展高灵敏、低成本、能从复杂基体中快速检测MG等水产品药残的方法己迫在眉睫。
分子印迹技术的应用可为水产品药物残留的检测提供新的途径，分子印迹技术（molecularimprintingtechnology，MIT)是模仿抗原抗体的反应原理，制备出对目标分子具有专一性识别和选择能力的分子印迹聚合物。该分子印迹聚合物具有构效预定性、特异识别性和广泛适用性的显著特点，目前分子印迹技术已广泛应用于食品等复杂基体中药残的分析。
酶联免疫(ELISA)法检测具有快速、灵敏的优点。与分子印迹技术结合起来，以合成的分子印迹聚合物作为仿生抗体，不仅具有选择特异性，而且可以重复利用。
但传统的酶标板上做分子印迹的方法存在一些不足：（1）有机溶剂的使用，会对酶标板造成不同程度的损坏；（2）合成分子印迹膜除了模板外，还需要功能单体、交联剂、引发剂共同作用，合成过程相对复杂；（3）模板分子的洗脱困难；（4）合成的分子印迹膜在水溶液中的选择性差。
发明内容
本发明的目的在于提供一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，具体检测步骤如下：
（1）MG分子印迹膜的制备
取模板分子孔雀石绿（MG）与多巴胺溶于一定pH的Tris-HCL溶液中，混合均匀后移取200μL于96孔板中，将96孔板置于转速为300r/min的酶标震荡仪上，26～28℃下聚合反应一定时间；
（2）模板的洗脱
用甲醇：乙酸的体积比为8～10:1的超声清洗孔板三次，再用超纯水洗至中性，于60℃下烘干，得到96孔板上的MG分子印迹膜（MIP）；
非分子印迹膜(NIP)的合成除不加入模板分子MG外，其余操作步骤与上述分子印迹膜的制备相同；
（3）半抗原的合成
将4-甲酰基苯甲酸、N,N-二甲基苯胺和无水ZnC12溶解在无水乙醇中，氮气保护下加热回流23～25h，冷却至室温，加入甲醇，调节pH至沉淀产生，过滤沉淀，真空干燥后得到羧基化的隐性孔雀石绿（CLMG）；用三氯甲烷溶解CLMG，加入四氯对苯醌和冰醋酸，在24～26℃下搅拌反应1.5h，反应产物经等体积三氯甲烷-四氯甲烷洗涤两次，真空干燥后得到羧基化孔雀石绿（CMG）；
（4）酶标抗原的合成
将CMG溶于质量分数为20%的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液，边磁力搅拌边加入EDC，调pH4.5～5.0，反应18～22min后，迅速加入辣根过氧化物酶（HRP），调pH为7.0，室温反应2.5～3.5h后，得到CMG-HRP偶联物；
（5）检测
准确吸取100μLMG-PBS缓冲溶液于分子印迹膜中，然后立即加入稀释度1:1500的酶标抗原溶液100μL，不加MG溶液的孔为对照组，室温孵育1.5～2.5h，弃上层溶液，每孔加入150μL底物显色液，显色30min后加入50μL终止液，立即在酶标仪上读数，然后计算各个浓度下MG对抗原抗体结合反应的抑制率，绘制MG直接竞争ELISA标准曲线。
作为本发明进一步的方案：所述步骤（1）中的一定的pH为7.5、8、8.5或9。
作为本发明进一步的方案：所述步骤（1）中聚合反应的时间为3h、5h、7h或9h。
作为本发明进一步的方案：所述步骤（5）中的底物显色液为邻苯二胺。
作为本发明再进一步的方案：所述步骤（5）中的终止液为2mol/L的硫酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）DA在水溶液中就可以发生自聚合作用，整个聚合过程不使用有机溶剂，避免了对酶标板的腐蚀；（2）反应简单、方便；（3）模板分子很容易被洗脱出来；（4）大大提高聚合物在水溶液中的选择性，使其应用范围更加广泛。
利用多巴胺自聚合避免了传统酶标板上分子印迹的缺点，而酶联免疫法检测快速、灵敏，将二者结合起来，以合成的分子印迹薄膜作为仿生抗体，不仅具有选择特异性，而且能够实现对残留孔雀石绿的快速检测。
附图说明
图1为MG分子印迹膜（MIP）和非分子印迹膜(NIP)的吸附动力学曲线图。
图2为MG分子印迹膜（MIP）和非分子印迹膜(NIP)的等温吸附曲线图。
图3为MG直接竞争ELISA标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中，一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，具体检测步骤如下：
（1）MG分子印迹膜的制备
取模板分子孔雀石绿（MG）与多巴胺溶于一定pH的Tris-HCL溶液中，混合均匀后移取200μL于96孔板中，将96孔板置于转速为300r/min的酶标震荡仪上，27℃下聚合反应一定时间；
（2）模板的洗脱
用甲醇：乙酸的体积比为9:1的超声清洗孔板三次，再用超纯水洗至中性，于60℃下烘干，得到96孔板上的MG分子印迹膜（MIP）；
非分子印迹膜(NIP)的合成除不加入模板分子MG外，其余操作步骤与上述分子印迹膜的制备相同；
（3）半抗原的合成
将4-甲酰基苯甲酸、N,N-二甲基苯胺和无水ZnC12溶解在无水乙醇中，氮气保护下加热回流24h，冷却至室温，加入甲醇，调节pH至沉淀产生，过滤沉淀，真空干燥后得到羧基化的隐性孔雀石绿（CLMG）；用三氯甲烷溶解CLMG，加入四氯对苯醌和冰醋酸，在25℃下搅拌反应1.5h，反应产物经等体积三氯甲烷-四氯甲烷洗涤两次，真空干燥后得到羧基化孔雀石绿（CMG）；
（4）酶标抗原的合成
将CMG溶于质量分数为20%的N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液，边磁力搅拌边加入EDC，调pH4.5～5.0，反应20min后，迅速加入辣根过氧化物酶（HRP），调pH为7.0，室温反应3h后，得到CMG-HRP偶联物；
（5）检测
准确吸取100μLMG-PBS缓冲溶液于分子印迹膜中，然后立即加入稀释度1:1500的酶标抗原溶液100μL，不加MG溶液的孔为对照组，室温孵育2h，弃上层溶液，每孔加入150μL邻苯二胺，显色30min后加入50μL2mol/L的硫酸，立即在酶标仪上读数，然后计算各个浓度下MG对抗原抗体结合反应的抑制率，绘制MG直接竞争ELISA标准曲线。
抑制率（B/B0）=样品吸光度（B）/阴性吸光度（B0）；
如图1和图2所示，分别是MG分子印迹膜（MIP）和非分子印迹膜(NIP)的吸附动力学曲线、等温吸附曲线。
绘制MG直接竞争ELISA标准曲线如图3所示。
优选的，所述步骤（1）中的一定的pH为7.5、8、8.5或9。
优选的，所述步骤（1）中聚合反应的时间为3h、5h、7h或9h。
所建立ELISA方法的特异性验证：选择孔雀石绿及其结构类似物甲基紫、亮绿作为分析物，建立dcELISA标准曲线，分别得到对应的IC50值，计算出交叉反应率（CR），如表1的结果表明，所制备的分子印迹聚合物膜对孔雀石绿具有较高的选择性。
表1MG及其类似物的IC50值和交义反应率
结构类似物 IC50（μg/L） 交叉反应率CR（％）
孔雀石绿 10.31 100
甲基紫 100.7 10.2
亮绿 66.70 15.5
实际样品的添加回收实验：将10μL、20μL、50μL100μg/L的MG标准溶液分别加入到990μL、980μL、950μL的自来水样品和1g鱼肉浆液中，按照建立的dcELISA方法测定加标回收率。如表2所示的实验结果表明，所建立的方法能够应用于实际样品检测中，并且检测效果较好。
表2ELISA法对样品中MG的添加回收测定结果
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图视为限制所涉及的权利要求。

Claims (5)

1.一种水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，其特征在于，具体检测步骤如下：
（1）MG分子印迹膜的制备
取模板分子MG与多巴胺溶于一定pH的Tris-HCL溶液中，混合均匀后移取200μL于96孔板中，将96孔板置于转速为300r/min的酶标震荡仪上，26～28℃下聚合反应一定时间；
（2）模板的洗脱
用甲醇：乙酸的体积比为8～10:1的超声清洗孔板三次，再用超纯水洗至中性，于60℃下烘干，得到96孔板上的MG分子印迹膜；
（3）半抗原的合成
将4-甲酰基苯甲酸、N,N-二甲基苯胺和无水ZnC12溶解在无水乙醇中，氮气保护下加热回流23～25h，冷却至室温，加入甲醇，调节pH至沉淀产生，过滤沉淀，真空干燥后得到CLMG；用三氯甲烷溶解CLMG，加入四氯对苯醌和冰醋酸，在24～26℃下搅拌反应1.5h，反应产物经等体积三氯甲烷-四氯甲烷洗涤两次，真空干燥后得到CMG；
（4）酶标抗原的合成
将CMG溶于质量分数为20%的N,N-二甲基甲酰胺溶液，边磁力搅拌边加入EDC，调pH4.5～5.0，反应18～22min后，迅速加入HRP，调pH为7.0，室温反应2.5～3.5h后，得到CMG-HRP偶联物；
（5）检测
准确吸取100μLMG-PBS缓冲溶液于分子印迹膜中，然后立即加入稀释度1:1500的酶标抗原溶液100μL，不加MG溶液的孔为对照组，室温孵育1.5～2.5h，弃上层溶液，每孔加入150μL底物显色液，显色30min后加入50μL终止液，立即在酶标仪上读数，然后计算各个浓度下MG对抗原抗体结合反应的抑制率，绘制MG直接竞争ELISA标准曲线。
2.根据权利要求1所述的水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中的一定的pH为7.5、8、8.5或9。
3.根据权利要求1所述的水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，其特征在于，所述步骤（1）中聚合反应的时间为3h、5h、7h或9h。
4.根据权利要求1所述的水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，其特征在于，所述步骤（5）中的底物显色液为邻苯二胺。
5.根据权利要求1所述的水产品孔雀石绿分子印迹膜仿生ELISA的快速检测方法，其特征在于，所述步骤（5）中的终止液为2mol/L的硫酸。
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