CN105233810B - 一种仿生双链磷脂膜整体柱及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于色谱分离技术领域，公开了一种仿生双链磷脂膜整体柱及其制备方法与应用。所述整体柱是以1‑十二烷酰‑2‑(11‑甲基丙烯酰胺‑N‑十一烷酰)‑SN‑甘油‑3‑磷酸胆碱为功能单体，在交联剂、生孔剂和引发剂的条件下，通过热催化反应，在改性的石英毛细管内原位聚合而成；所述的仿生双链磷脂膜整体柱具有连续的整体的多孔结构。本发明的整体柱以1‑十二烷酰‑2‑(11‑甲基丙烯酰胺‑N‑十一烷酰)‑SN‑甘油‑3‑磷酸胆碱为功能单体进行制备，该功能单体以1‑月桂酰溶血卵磷酯为原料，通过仅两步的化学修饰即可得到，降低了制备成本；所得整体柱分离性能好，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于色谱分离技术领域，具体涉及一种仿生双链磷脂膜整体柱及其制备方法与应用。
背景技术
磷脂膜色谱又称固定化人工膜色谱(Immobilized Artificial Membrane,IAM)，是新药研究中广泛使用的一种模拟生物膜色谱法，由于固定相结构跟细胞膜磷脂层类似，具有很好的仿生特性，已成功应用于预测药物的小肠吸收、血脑屏障通透性、透皮吸收、体内分布、药效活性等方面[Valkó KL,Nunhuck SB,Hill AP.Estimating unbound volumeof distribution and tissue binding by in vitro HPLC-based human serum albuminand immobilised artificial membrane-binding measurements.J Pharm Sci.2011,100(3):849-862；Liu YY,Li LL,Dai RJ,Qu F,Geng LN,Li XM,Deng YL.Assessment of theEnzymatic Activity and Inhibition using HPFA with a Microreactor,Trypsin,Absorbed on Immobilized Artificial Membrane.J Chromatogr Sci.2010,48(2):150-155]。目前，商业化磷脂膜色谱柱只有磷脂酰胆碱(Phosphatidyl cholines，PC)的填充柱(Regis Chem Co,Morton Grove，IL，USA)，主要制备策略是通过双链的酯键、单链的醚键或者删除甘油骨架的单链将磷脂酰胆碱极性官能团键合到硅胶表面，可以很好地用于蛋白质分离和预测药物的膜渗透性等。但目前的IAM填充柱存在如色谱柱填充制备复杂、磷脂类型单一、细胞膜仿生性不强、pH适应范围窄等不足，严重限制了磷脂膜色谱柱在药物研发中的应用。
有机聚合物整体色谱柱(monolithic column)是由单体、交联剂、致孔剂和引发剂等组成的混合物通过原位聚合得到的连续均一的棒状聚合物，它具有制备过程简单、渗透性好、传质速度快、生物兼容性好、耐酸碱性好、单体种类多等优点，可实现快速、高效、高通量的分离，近年来已引起人们的热切关注[Smith NW,Jiang Z.Developments in the useand fabrication of organic monolithic phases for use with high-performanceliquid chromatography and capillary electrochromatography.J Chromatogr A2008,1184(1-2):416-440；Jiang Z,Smith NW,Liu Z.Preparation and application ofhydrophilic monolithic columns.J Chromatogr A 2011,1218(17):2350-2361.]。针对不同的分析客体和目的，设计合成新型的单体，并制备相关的特殊结构的整体柱，一直是整体色谱柱研究的热点。本课题组[Jiang Z,Reilly J,Everatt B,Smith NW.Novelzwitterionic polyphosphorylcholine monolithic column for hydrophilicinteraction chromatography.J Chromatogr A.2009,1216(12):2439-48.]用2-甲基丙烯酰羟乙基磷酰胆碱(MPC)为单体，成功制备了含2个碳链磷酸胆碱官能团的毛细管整体柱，具有良好通透性、机械强度和孔径分布，但与细胞膜磷脂层的18个碳链长度连接磷酸胆碱官能团的结构相差较大。在此基础之上，本课题组[Zhao XL,Chen WJ,Liu ZH,Guo JL,ZhouZY,Crommen J,Moaddel R,Jiang ZJ.A novel mixed phospholipid functionalizedmonolithic column forearly screening of drug induced phospholipidosis risk.JChromatogr A.2014,1367,99-108；Zhao XL,Chen WJ,Zhou ZY,Wang QQ,Liu ZH,MoaddelR,Jiang ZJ.Preparation of a biomimetic polyphosphorylcholine monolithiccolumnfor immobilized artificial membrane chromatography.J Chromatogr A.2015,1407,176-183.]设计并成功制备了含磷脂酰胆碱官能团的单链PC整体柱和由单链PC及磷脂酰丝氨酸(PS)组成的混合型磷脂膜整体柱均具有良好通透性和机械强度等特点，并且发现它们能分别应用于药物膜作用预测和药物磷脂沉积风险预警。但是，细胞膜的磷脂组成主要由双链磷脂构成，尽管单链磷脂膜固定相具有一定的仿生膜能力，但可能不能真实地模仿生物膜磷脂环境。这一猜想得到了Barbato等人的证实[Barbato F,Di Martino G,GrumettoL,La Rotonda MI.Prediction of drug-membrane interactions by IAM–HPLC:effectsof different phospholipid stationary phases on the partition of bases.Eur JPharm Sci.2004,22,261-269.]，他们认为：相对于单链磷脂膜仿生系统，双链磷脂膜固定相往往表现出更好地细胞膜环境模拟能力。此外，双链磷脂膜材料还可以被应用在色谱柱上构建双层磷脂膜分子骨架，进而作为载体固定膜蛋白[Marra KG,M.Winger T,R.HansonS,L.Chaikof E.Cytomimetic biomaterials.1.In-situ polymerization ofphospholipids on a alkylated surface.Macromolecules 1997,30,6483-6488.MoaddelR,W Wainer I.The preparation and development of cellular membrane affinitychromatography columns.Nature protocol 2009,4,197-205.]，从而在色谱固定相上真实地模拟细胞膜组成，最终获取可靠的药物膜作用信息。但迄今为止，双链PC整体柱的研究是非常少的，这可能归因于得到能用于制备双链PC整体柱的功能性单体是非常困难的。近期Wiedmer等[Moravcová D,Carrasco-Correa EJ,Planeta J,M,K.Wiedmer S.Phosphatidylcholine covalently linked to a methacrylate-basedmonolith as a biomimetic stationary phase for capillaryliquidchromatography.J Chromatogr A.2015,1402:27-35.]通过整体柱柱后修饰的方法，将大豆磷脂酰胆碱键合到基质柱上，成功制备了一种新型的含双链PC的磷脂膜整体柱并将其用于药物膜作用预测。但该整体柱可能仍然不能真实地模拟生物膜，因其在双链PC外引入了一条长烷基疏水链，这将不仅影响整个仿生系统的疏水环境，而且可能会不利于PC官能团在整体柱表面的有序排列，从而不能有效模拟细胞膜磷脂环境，最终导致药物膜作用预测能力下降。鉴此，制备与细胞膜磷脂双分子层高度接近的有机聚合物，开发出制备简单、重现性和稳定性好、选择性强、预测准确性高的新型双链磷脂膜整体色谱柱和以此为母体基质制备成的细胞膜亲和整体柱，可为新药研发中预测与药物膜相互作用、细胞膜渗透性、药物磷脂沉积安全性等有关的药理作用提供有效的技术支撑。
发明内容
为了解决以上现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种仿生双链磷脂膜整体柱。
本发明的另一目的在于提供一种上述仿生双链磷脂膜整体柱的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述仿生双链磷脂膜整体柱在药物筛选和蛋白质、多肽及小分子分离中的应用。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种仿生双链磷脂膜整体柱，所述整体柱是以1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱(MDSPC)为功能单体，在交联剂、生孔剂和引发剂的条件下，通过热催化反应，在改性的石英毛细管内原位聚合而成；所述的1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱结构式如下：
所述的仿生双链磷脂膜整体柱具有连续的整体的多孔结构。
上述仿生双链磷脂膜整体柱的制备方法，包括以下制备步骤：
将1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂混合，超声脱气后，灌入改性的石英毛细管柱内，然后将石英毛细管柱的两端封口，放入水浴中反应，反应完毕后除去石英毛细管中的未反应物，得到仿生双链磷脂膜整体柱。
所述的1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱功能单体通过如下方法制备：首先利用11-氨基十一酸与甲基丙烯酰氯反应，得到中间体脂肪酸11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷基酸(MDS)；然后将该中间体与1-月桂酰溶血卵磷酯(DPC)通过酯化反应得到1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱(MDSPC)；上述反应如下式所示：
所述的改性的石英毛细管通过如下方法制备：用1mol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管15min，再将石英毛细管两端封口放在100℃水浴锅反应2小时；然后用去离子水冲洗石英毛细管，直至流出来的液体pH为7.0；接着用甲醇冲洗石英毛细管后用氮气干燥4小时；干燥完毕后，把体积比为1:1的甲醇和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPs)混合液打进石英毛细管中，两端封口且放在60℃水浴锅内反应12小时；最后分别用甲醇和水各冲洗30分钟，氮气干燥12小时，即得改性的石英毛细管。
所述的交联剂优选乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)。
所述的生孔剂优选质量比为78.3:21.7～88.3:11.7的异丙醇与环己醇的混合物；更优选质量比为83.3:16.7的异丙醇与环己醇的混合物。
所述的引发剂优选偶氮二异丁腈(AIBN)。
优选地，所述1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱(MDSPC)功能单体与交联剂的质量比为40:60～60:40；所述引发剂的质量为MDSPC功能单体与交联剂总质量的0.5％～1.0％；所述MDSPC功能单体与交联剂的质量之和与生孔剂的质量比为29.43:70.57～39.43:60.57。更优选地，所述MDSPC功能单体与交联剂的质量比为45:55；所述引发剂的质量为MDSPC功能单体与交联剂总质量的1.0％；所述MDSPC功能单体与交联剂的质量之和与生孔剂的质量比为34.43:65.57。
所述的反应是指在60℃温度下反应2～24h。
所述除去石英毛细管中的未反应物是按照以下步骤进行操作：将石英毛细管的一端与高压泵连接，用有机溶剂进行冲洗；所述有机溶剂为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种。
上述仿生双链磷脂膜整体柱在药物筛选和蛋白质、多肽及小分子分离中的应用。
本发明采用1-月桂酰溶血卵磷酯(DPC)为原料，通过化学改性后得到功能性单体化合物1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱(MDSPC)，其一端具有磷酸胆碱结构，另一端具有可供聚合反应的丙烯酸酯类结构。本发明以MDSPC为功能单体，混合交联剂和生孔剂及引发剂，经过热催化反应，在石英毛细管内原位聚合成多孔的磷脂膜整体色谱柱，其材料表面具有仿生的磷酸胆碱结构，可以有效的模拟药物与细胞膜的相互作用，预测药物跨膜转运的相关参数及以此基质而制备磷脂膜-细胞膜亲和整体色谱柱。
本发明的制备方法及所得到的产物具有如下优点及有益效果：
(1)本发明的整体柱以1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱(MDSPC)为功能单体，通过共聚的方式，与交联剂EDMA，硅烷化试剂γ-MAPs(3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷)形成稳定的高聚材料，并与毛细管壁紧密结合，既具有细胞膜的仿生功能和生物兼容性好，又具有良好的通透性、机械强度、耐酸碱性好，并且克服了商业化磷脂膜硅胶柱上残留氨基和硅醇基等缺点，能被应用于药物筛选和蛋白质、多肽及小分子分离中；
(2)本发明的整体柱与现有单链磷脂酰胆碱整体柱相比，该类双链磷脂膜柱表现出更好地仿生能力，且有潜力固定膜蛋白从而更为真实地模拟细胞膜环境；
(3)本发明功能单体1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱的制备方法简单，解决了双链磷脂酰胆碱单体制备困难的问题。
附图说明
图1为实施例1的反应示意图；
图2为实施例2共聚反应的示意图；
图3为实施例3制备的仿生双链磷脂膜整体柱的扫描电镜图，其中a为放大至900倍电镜图，b为放大至5000倍电镜图；
图4为实施例3制备的仿生双链磷脂膜整体柱的能谱分析图；
图5为实施例3制备的仿生双链磷脂膜整体柱的液相保留行为图，其中横坐标表示流动相中乙腈的体积百分比，纵坐标表示两种化合物的保留时间；
图6为实施例3制备的仿生双链磷脂膜整体柱在反相模式下对10种药物的分离图，其中：1-N-乙酰对氨基酚；2-磺胺；3-苯磺酰胺；4-非那西丁；5-氢化可的松；6-辛可卡因；7-氯氮平；8-氯贝特；9-噻康唑；10-胺碘酮。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
本实施例功能单体1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱(MDSPC)的制备：
(1)在干燥的三口烧瓶中，加入4g 11-氨基十一酸，50mL乙醇，7mL水，室温下加入3g氢氧化钠，搅拌至混合物变澄清后，反应温度被降低至0℃，缓慢滴加2.7mL甲基丙酰氯溶液，继续反应3h后，反应恢复到室温并搅拌过夜。反应停止后，将反应液减压浓缩并用1mol/L稀盐酸调节pH至2.0，发现有大量白色絮状物生成。最后将絮状物减压抽滤，干燥得到3g中间体11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷基酸(MDS)。NMR鉴定为：1H NMR(300MHz,CDCl3)δ1.29(m,12H),1.49-1.65(m,4H),1.96(s,3H),2.32-2.37(t,2H),3.27-3.34(m,2H),5.31-5.32(t,1H),5.68(s,1H),5.86(s,1H)。
(2)在氮气保护下往三口烧瓶中加入含1.35g中间体MDS、1.1g 1-月桂酰溶血卵磷酯、336mg 4-二甲氨基吡啶的无水氯仿溶液，然后室温下磁力搅拌30分钟后，将反应温度降低到零度，缓慢滴加一定量的N,N'-二环己基碳二亚胺的氯仿溶液，滴加完成后，反应恢复到室温，继续反应96h。反应完成后，减压浓缩，得到的粗产物通过硅胶柱色谱(洗脱剂：CH2Cl2:CH3OH＝10:1至CH2Cl2:CH3OH:H2O＝65:25:4)进行纯化，最终得到0.8g目标化合物MDSPC。目标产物鉴定为：ESI-MS m/z:691.5[M+H]+,713.5[M+Na]+.1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.99-5.97(m,1H),5.69-5.67(m,1H),5.34-5.30(m,1H),5.23-5.20(m,1H),4.37-3.87(m,6H),3.47(t,J＝8.4Hz,2H),3.47-3.32(m,9H),3.33-3.26(m,2H),2.32-2.29(m,4H),1.97(s,3H),1.60-1.56(m 6H),1.36-1.21(s,28H),0.89(t,J＝6.4Hz,3H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ173.59,173.23,168.45,140.24,119.13,70.39,66.17,63.44,62.9559.22,54.27,39.7134.27,34.12,31.91,29.66,29.57,29.50,29.36,26.97,24.88,22.68,18.74,14.12。产物结构式如下：
本实施例的反应示意图如图1所示。
实施例2
本实施例仿生双链磷脂膜整体柱的制备：
将实施例1合成的1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱(MDSPC)，与交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、致孔剂异丙醇(Isopropanol)与环己醇(Cyclohexanol)的混合物和引发剂偶氮二异丁腈(AIBN)混匀，超声脱气5分钟，灌入改性的石英毛细管柱内，反应温度为60℃，反应12h，接高压泵用甲醇冲洗，即得仿生双链磷脂膜整体柱(poly(MDSPC-co-EDMA))。以上反应的示意图如图2所示。其中MDSPC与交联剂的质量比为45:55，致孔剂中异丙醇与环己醇的质量比为83.3:16.7，MDSPC与交联剂质量之和，与致孔剂的质量比为29.43:70.57，引发剂的质量为MDSPC与交联剂质量之和的1％。
所述改性的石英毛细管通过以下方法制备：用1mol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管15min，再将石英毛细管两端封口放在100℃水浴锅反应2小时；然后用去离子水冲洗石英毛细管，直至流出来的液体pH为7.0；接着用甲醇冲洗石英毛细管后用氮气干燥4小时；干燥完毕后，把体积比为1:1的甲醇和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPs)混合液打进石英毛细管中，两端封口且放在60℃水浴锅内反应12小时；最后分别用甲醇和水各冲洗30分钟，氮气干燥12小时，即得改性的石英毛细管。
用扫描电子显微镜观察本实施例制备的仿生双链磷脂膜整体柱的微观形貌，结果显示整体材料具有微米级的通孔和微米级的三维连续骨架。其能谱分析图显示整体材料在柱内部分布均匀。
实施例3
本实施例仿生双链磷脂膜整体柱的制备：
将实施例1合成的1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱(MDSPC)，与交联剂(乙二醇二甲基丙烯酸酯，EDMA)、致孔剂(异丙醇与环己醇混合)和引发剂(偶氮二异丁腈，AIBN)混匀，超声脱气5分钟，灌入改性的石英毛细管柱内，反应温度为60℃，反应12h，接高压泵用乙腈冲洗，即得仿生双链磷脂膜整体柱。其中MDSPC与交联剂的质量比为45:55，致孔剂中异丙醇与环己醇的质量比为83.3:16.7，MDSPC与交联剂质量之和，与致孔剂的质量比为34.43:65.57，引发剂的质量为MDSPC与交联剂质量之和的1％。
所述改性的石英毛细管通过以下方法制备：用1mol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管15min，再将石英毛细管两端封口放在100℃水浴锅反应2小时；然后用去离子水冲洗石英毛细管，直至流出来的液体pH为7.0；接着用甲醇冲洗石英毛细管后用氮气干燥4小时；干燥完毕后，把体积比为1:1的甲醇和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPs)混合液打进石英毛细管中，两端封口且放在60℃水浴锅内反应12小时；最后分别用甲醇和水各冲洗30分钟，氮气干燥12小时，即得改性的石英毛细管。
用扫描电子显微镜观察本实施例制备的仿生双链磷脂膜整体柱的微观形貌，结果如图3所示，从图3可以看出，整体材料具有微米级的通孔和微米级的三维连续骨架。其能谱分析图如图4所示，由图4可以看出，整体材料在柱内部分布均匀。
本实施例所得的仿生双链磷脂膜整体柱的保留行为测试：乙腈和水为流动相，甲苯和硫脲为测试化合物，结果如图5所示。
测试条件：
样品： 甲苯，硫脲；
流动相： 乙腈/水；
流速： 600nL/min；
检测波长： 214nm。
本实施例所得的仿生双链磷脂膜整体柱在反相模式下对10种药物的分离测试：
采用梯度的条件，测试10种随机挑选的药物在整体柱上的分离效果，结果如图6所示。
测试条件：
样品：1-N-乙酰对氨基酚；2-磺胺；3-苯磺酰胺；4-非那西丁；5-氢化可的松；6-辛可卡因；7-氯氮平；8-氯贝特；9-噻康唑；10-胺碘酮；
流动相： 乙腈，50mM乙酸铵溶液，pH＝7.4；
流速： 600nL/min；
梯度： 0％乙腈到100％乙腈，26min；
检测波长： 254nm。
本实施例所得的仿生双链磷脂膜整体柱用于制备细胞膜亲和色谱柱：
将培养的目标细胞(乳腺癌细胞MDA-MB-435和前列腺癌PC3细胞)或组织细胞，在冰浴中，匀浆和超声30min，4℃，3000g离心去掉细胞核内器官，获得细胞匀浆上清液；4℃，1000g离心10min，进一步去残留细胞内器官，吸取上清溶液；4℃，1000g离心20min，获得细胞膜沉淀。加入5～10mL体积的预冷生理盐水或等渗溶液，重悬得细胞膜备用溶液。
将细胞膜备用溶液吸入流动注射泵，恒速注入本实施例所得的仿生双链磷脂膜整体柱，旋转震动10～60min，4℃条件下反应6～24h，既可制备得磷脂单体-细胞膜亲和色谱柱，接入高效液相色谱仪，可进行药物筛选和蛋白质、多肽及小分子的分析。
实施例4
本实施例仿生双链磷脂膜整体柱的制备：
将实施例1合成的1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱(MDSPC)，与交联剂(乙二醇二甲基丙烯酸酯，EDMA)、致孔剂(异丙醇与环己醇混合)和引发剂(偶氮二异丁腈，AIBN)混匀，超声脱气5分钟，灌入改性的石英毛细管柱内，反应温度为60℃，反应12h，接高压泵用甲醇冲洗，即得仿生双链磷脂膜整体柱。其中MDSPC与交联剂的质量比为45:55，致孔剂中异丙醇与环己醇的质量比为83.3:16.7，MDSPC与交联剂质量之和，与致孔剂的质量比为39.43:60.57，引发剂的质量为MDSPC与交联剂质量之和的1％。
所述改性的石英毛细管通过以下方法制备：用1mol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管15min，再将石英毛细管两端封口放在100℃水浴锅反应2小时；然后用去离子水冲洗石英毛细管，直至流出来的液体pH为7.0；接着用甲醇冲洗石英毛细管后用氮气干燥4小时；干燥完毕后，把体积比为1:1的甲醇和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPs)混合液打进石英毛细管中，两端封口且放在60℃水浴锅内反应12小时；最后分别用甲醇和水各冲洗30分钟，氮气干燥12小时，即得改性的石英毛细管。
用扫描电子显微镜观察本实施例制备的仿生双链磷脂膜整体柱的微观形貌，结果显示整体材料具有微米级的通孔和微米级的三维连续骨架。其能谱分析图显示整体材料在柱内部分布均匀。
实施例5
本实施例仿生双链磷脂膜整体柱的制备：
将实施例1合成的1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱(MDSPC)，与交联剂(乙二醇二甲基丙烯酸酯，EDMA)、致孔剂(异丙醇与环己醇混合)和引发剂(偶氮二异丁腈，AIBN)混匀，超声脱气5分钟，灌入改性的石英毛细管柱内，反应温度为60℃，反应12h，接高压泵用甲醇冲洗，即得仿生双链磷脂膜整体柱。其中MDSPC与交联剂的质量比为40:60，致孔剂中异丙醇与环己醇的质量比为83.3:16.7，MDSPC与交联剂质量之和，与致孔剂的质量比为29.43:70.57，引发剂的质量为MDSPC与交联剂质量之和的1％。
所述改性的石英毛细管通过以下方法制备：用1mol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管15min，再将石英毛细管两端封口放在100℃水浴锅反应2小时；然后用去离子水冲洗石英毛细管，直至流出来的液体pH为7.0；接着用甲醇冲洗石英毛细管后用氮气干燥4小时；干燥完毕后，把体积比为1:1的甲醇和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPs)混合液打进石英毛细管中，两端封口且放在60℃水浴锅内反应12小时；最后分别用甲醇和水各冲洗30分钟，氮气干燥12小时，即得改性的石英毛细管。
用扫描电子显微镜观察本实施例制备的仿生双链磷脂膜整体柱的微观形貌，结果显示整体材料具有微米级的通孔和微米级的三维连续骨架。其能谱分析图显示整体材料在柱内部分布均匀。
实施例6
本实施例仿生双链磷脂膜整体柱的制备：
将实施例1合成的1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱(MDSPC)，与交联剂(乙二醇二甲基丙烯酸酯，EDMA)、致孔剂(异丙醇与环己醇混合)和引发剂(偶氮二异丁腈，AIBN)混匀，超声脱气5分钟，灌入改性的石英毛细管柱内，反应温度为60℃，反应12h，接高压泵用甲醇冲洗，即得仿生双链磷脂膜整体柱。其中MDSPC与交联剂的质量比为45:55，致孔剂中异丙醇与环己醇的质量比为88.3:11.7，MDSPC与交联剂质量之和，与致孔剂的质量比为34.43:65.57，引发剂的质量为MDSPC与交联剂质量之和的1％。
所述改性的石英毛细管通过以下方法制备：用1mol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管15min，再将石英毛细管两端封口放在100℃水浴锅反应2小时；然后用去离子水冲洗石英毛细管，直至流出来的液体pH为7.0；接着用甲醇冲洗石英毛细管后用氮气干燥4小时；干燥完毕后，把体积比为1:1的甲醇和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPs)混合液打进石英毛细管中，两端封口且放在60℃水浴锅内反应12小时；最后分别用甲醇和水各冲洗30分钟，氮气干燥12小时，即得改性的石英毛细管。
用扫描电子显微镜观察本实施例制备的仿生双链磷脂膜整体柱的微观形貌，结果显示整体材料具有微米级的通孔和微米级的三维连续骨架。其能谱分析图显示整体材料在柱内部分布均匀。
实施例7
本实施例仿生双链磷脂膜整体柱的制备：
将实施例1合成的1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱(MDSPC)，与交联剂(乙二醇二甲基丙烯酸酯，EDMA)、致孔剂(异丙醇与环己醇混合)和引发剂(偶氮二异丁腈，AIBN)混匀，超声脱气5分钟，灌入改性的石英毛细管柱内，反应温度为60℃，反应2h，接高压泵用丙酮冲洗，即得仿生双链磷脂膜整体柱。其中MDSPC与交联剂的质量比为45:55，致孔剂中异丙醇与环己醇的质量比为83.3:16.7，MDSPC与交联剂质量之和，与致孔剂的质量比为34.43:65.57，引发剂的质量为MDSPC与交联剂质量之和的1％。
所述改性的石英毛细管通过以下方法制备：用1mol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管15min，再将石英毛细管两端封口放在100℃水浴锅反应2小时；然后用去离子水冲洗石英毛细管，直至流出来的液体pH为7.0；接着用甲醇冲洗石英毛细管后用氮气干燥4小时；干燥完毕后，把体积比为1:1的甲醇和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPs)混合液打进石英毛细管中，两端封口且放在60℃水浴锅内反应12小时；最后分别用甲醇和水各冲洗30分钟，氮气干燥12小时，即得改性的石英毛细管。
用扫描电子显微镜观察本实施例制备的仿生双链磷脂膜整体柱的微观形貌，结果显示整体材料具有微米级的通孔和微米级的三维连续骨架。其能谱分析图显示整体材料在柱内部分布均匀。
实施例8
本实施例仿生双链磷脂膜整体柱的制备：
将实施例1合成的1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱(MDSPC)，与交联剂(乙二醇二甲基丙烯酸酯，EDMA)、致孔剂(异丙醇与环己醇混合)和引发剂(偶氮二异丁腈，AIBN)混匀，超声脱气5分钟，灌入改性的石英毛细管柱内，反应温度为60℃，反应24h，接高压泵用丙酮冲洗，即得仿生双链磷脂膜整体柱。其中MDSPC与交联剂的质量比为45:55，致孔剂中异丙醇与环己醇的质量比为83.3:16.7，MDSPC与交联剂质量之和，与致孔剂的质量比为34.43:65.57，引发剂的质量为MDSPC与交联剂质量之和的1％。
所述改性的石英毛细管通过以下方法制备：用1mol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管15min，再将石英毛细管两端封口放在100℃水浴锅反应2小时；然后用去离子水冲洗石英毛细管，直至流出来的液体pH为7.0；接着用甲醇冲洗石英毛细管后用氮气干燥4小时；干燥完毕后，把体积比为1:1的甲醇和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPs)混合液打进石英毛细管中，两端封口且放在60℃水浴锅内反应12小时；最后分别用甲醇和水各冲洗30分钟，氮气干燥12小时，即得改性的石英毛细管。
用扫描电子显微镜观察本实施例制备的仿生双链磷脂膜整体柱的微观形貌，结果显示整体材料具有微米级的通孔和微米级的三维连续骨架。其能谱分析图显示整体材料在柱内部分布均匀。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种仿生双链磷脂膜整体柱，其特征在于：所述整体柱是以1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱为功能单体，在交联剂、生孔剂和引发剂的条件下，通过热催化反应，在改性的石英毛细管内原位聚合而成；所述的交联剂是指乙二醇二甲基丙烯酸酯；所述的生孔剂是指质量比为78.3:21.7～88.3:11.7的异丙醇与环己醇的混合物；所述的引发剂是指偶氮二异丁腈；所述的1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱功能单体的结构式如下：
其通过如下方法制备得到：首先利用11-氨基十一酸与甲基丙烯酰氯反应，得到中间体脂肪酸11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷基酸；然后将该中间体与1-月桂酰溶血卵磷酯通过酯化反应得到1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱。
2.根据权利要求1所述的一种仿生双链磷脂膜整体柱，其特征在于：所述的仿生双链磷脂膜整体柱具有连续的整体的多孔结构。
3.权利要求1或2所述的一种仿生双链磷脂膜整体柱的制备方法，其特征在于包括以下制备步骤：
将1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱功能单体、交联剂、致孔剂和引发剂混合，超声脱气后，灌入改性的石英毛细管柱内，然后将石英毛细管柱的两端封口，放入水浴中反应，反应完毕后除去石英毛细管中的未反应物，得到仿生双链磷脂膜整体柱。
4.根据权利要求3所述的一种仿生双链磷脂膜整体柱的制备方法，其特征在于，所述的改性的石英毛细管通过如下方法制备：用1mol/L的NaOH溶液冲洗石英毛细管15min，再将石英毛细管两端封口放在100℃水浴锅反应2小时；然后用去离子水冲洗石英毛细管，直至流出来的液体pH为7.0；接着用甲醇冲洗石英毛细管后用氮气干燥4小时；干燥完毕后，把体积比为1:1的甲醇和3-(异丁烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷混合液打进石英毛细管中，两端封口且放在60℃水浴锅内反应12小时；最后分别用甲醇和水各冲洗30分钟，氮气干燥12小时，即得改性的石英毛细管。
5.根据权利要求3所述的一种仿生双链磷脂膜整体柱的制备方法，其特征在于：所述1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱功能单体与交联剂的质量比为40:60～60:40；所述引发剂的质量为1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱功能单体与交联剂总质量的0.5％～1.0％；所述1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱功能单体与交联剂的质量之和与生孔剂的质量比为29.43:70.57～39.43:60.57。
6.根据权利要求3所述的一种仿生双链磷脂膜整体柱的制备方法，其特征在于：所述的生孔剂是指质量比为83.3:16.7的异丙醇与环己醇的混合物；所述1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱功能单体与交联剂的质量比为45:55；所述引发剂的质量为1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱功能单体与交联剂总质量的1.0％；所述1-十二烷酰-2-(11-甲基丙烯酰胺-N-十一烷酰)-SN-甘油-3-磷酸胆碱功能单体与交联剂的质量之和与生孔剂的质量比为34.43:65.57。
7.根据权利要求3所述的一种仿生双链磷脂膜整体柱的制备方法，其特征在于：所述的反应是指在60℃温度下反应2～24h；所述除去石英毛细管中的未反应物是按照以下步骤进行操作：将石英毛细管的一端与高压泵连接，用有机溶剂进行冲洗；所述有机溶剂为甲醇、乙腈和丙酮中的至少一种。
8.权利要求1或2所述的仿生双链磷脂膜整体柱在药物筛选和蛋白质、多肽及小分子分离中的应用。
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