CN105214140A - 协同调控骨质疏松症中局部骨重建及愈合的钛合金的功能化界面构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种协同调控骨质疏松症中局部骨重建及愈合的钛合金的功能化界面构建方法，首先将钛合金表面预处理，然后在钛合金表面吸附多巴胺，固定明胶，最后通过层层自组装技术将降钙素及细胞因子BMP2组装到钛合金表面，获得的具有功能界面的钛合金能够调控间充质干细胞和破骨细胞的生物学行为，促进骨质疏松症模型中植入体的骨整合，在骨疾病治疗及骨移植技术中有重要的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明属于医用材料领域，具体涉及一种协同调控骨质疏松症中局部骨重建及愈合的钛合金的功能化界面构建方法。
背景技术
钛及钛合金材料由于其独特的机械性能和良好的生物性能，被广泛地应用于假肢和牙科领域。然而，由于钛及钛合金植入体与自然骨之间的固定主要依赖于骨和植入体材料之间简单的机械锁合，并且，植入体与自然骨之间长时间的摩擦易产生碎削和纤维包囊，这些因素最终会诱发骨溶，导致植入失败。上述问题对于骨质疏松症患者而言，由于其骨密度降低，骨强度和微结构改变，进一步增加了植入体植入的难度，降低了植入手术的成功率。
过去几十年，研究人员致力于通过表面工程的方法提高钛及钛合金表面性能，从而促进骨整合，有效治疗骨质疏松症引发的骨缺损或断裂。一种方法是将生物功能性活性大分子(例如细胞外基质成分、胶原、生长因子等)固定到钛材表面。因为这些分子能调控细胞的生物学行为，促进体内骨重建及愈合。比如，研究证实I型胶原及磷酸钙覆盖的钛材植入骨质疏松症小鼠中后能刺激植入体界面新骨的生成以及矿化；碱性成纤维生长因子能促进经过卵巢切除的小鼠中钛材植入体的固定强度。另一种是将抗骨质疏松症的药物(例如二磷酸盐、组织蛋白酶抑制剂、雷尼酸锶、降钙素等)覆盖到植入体表面。研究证实钛材料表面覆盖阿伦磷酸钠或唑来膦酸钠可以有效的抑制破骨细胞的增殖并抑制其活性，同时加速骨质疏松症小鼠中植入体与自然骨的机械整合。其它的治疗性药物如雷诺昔芬、雌激素都陆续引入钛材界面用于治疗或预防骨质疏松症引发的骨折，因为这些分子能限制骨吸收提高骨愈合。而本课题组在先前的研究中，利用含β-雌二醇的介孔硅杂化多层膜修饰钛材表面，发现这样的结构极大的提高了骨相关基因的表达，有利于维持骨的动态平衡。
降钙素是一种具有32个氨基酸线性多肽，能够治疗骨质疏松症。据报道具有骨质疏松症的病人经过降钙素治疗1年后，有效提高了病人腰椎和臀部的骨量。这有赖于降钙素在抑制破骨细胞的同时能刺激成骨细胞的活性。
骨形态发生蛋白-2(BoneMorphogeneticProtein2，BMP2)可以上调骨质疏松症病人干细胞成骨相关基因(如Runx2,DLX5及骨钙素)的表达，从而促进骨质疏松症病人干细胞成骨分化的能力。
基于此，本发明拟利用层层组装技术将抗骨质疏松症药物降钙素和骨诱导因子BMP2组装到钛合金表面壳聚糖/明胶多层膜中，以期达到调节骨相关细胞生物学行为的目的，实现植入体周围骨的重构及愈合，增加植入体与骨之间的整合。
发明内容
本发明提供了一种协同调控骨质疏松症中局部骨重建及愈合的钛合金的功能化界面构建方法，该方法操作简单、成本低廉、通用性强，不需要特殊设备。利用该方法制备的钛合金功能界面能够调控间充质干细胞和破骨细胞的生物学行为，促进骨质疏松症动物模型中植入体的骨整合，在骨疾病治疗及骨移植技术中有重要的临床应用价值。
本发明采取的技术方案如下：
1、协同调控骨质疏松症中局部骨重建及愈合的钛合金的功能化界面构建方法，包括如下步骤：
a.钛合金表面预处理：
将钛合金置于体积分数30～50％的硝酸溶液中，50～70℃孵育30～60min，清洗后沸水中浸泡1h；
b.多巴胺的吸附及明胶的固定：
将预处理后的钛合金置于0.5～6mg/mL多巴胺溶液中，20～30℃避光放置6～48h后清洗，然后用1～4mg/mL的明胶溶液浸泡8-16h，清洗并干燥；所述多巴胺溶液用5～15mM，pH8.5的Tris缓冲溶液配制；明胶溶液用pH值7.4的PBS缓冲液配制；
c.钛合金表面降钙素及BMP2杂化多层膜的制备：
将步骤b处理后的钛合金依次浸泡于1～10mg/mL壳聚糖溶液、1～10mg/mL明胶溶液和0.5～5μg/mL的降钙素溶液中，清洗后再依次浸泡于1～10mg/mL明胶溶液、1～10mg/mL壳聚糖溶液、1～10mg/mL明胶溶液及0.5～5μg/mL的BMP2溶液中，各溶液浸泡时间均为5～15min；
所述壳聚糖溶液用体积分数1％的醋酸溶液配制；降钙素溶液和明胶溶液用pH值7.4的PBS缓冲液配制；BMP2溶液用100mM，pH值5.1的醋酸钠溶液配制。
优选的，所述步骤a中所述钛合金为TC4钛合金。
优选的，所述步骤b中多巴胺溶液浓度为2mg/mL，明胶溶液浓度为2mg/mL。
优选的，所述步骤c中壳聚糖溶液浓度为2mg/mL，明胶溶液浓度为2mg/mL，降钙素溶液浓度为2μg/mL，BMP2溶液浓度为2μg/mL。
优选的，包括如下步骤：
a.钛合金表面预处理：
将钛合金置于体积分数40％的硝酸溶液中，60℃孵育40min，清洗后沸水中浸泡1h；
b.多巴胺的吸附及明胶的固定：
将预处理后的钛合金置于2mg/mL多巴胺溶液中，20～30℃避光放置12h后清洗，然后用2mg/mL的明胶溶液浸泡10h，清洗并干燥；所述多巴胺溶液用10mM，pH值8.5的Tris缓冲溶液配制；明胶溶液用pH值7.4的PBS缓冲液配制；
c.钛合金表面降钙素及BMP2杂化多层膜的制备：
将步骤b处理后的钛合金依次浸泡于2mg/mL壳聚糖溶液、2mg/mL明胶溶液和2μg/mL的降钙素溶液中，清洗后再依次浸泡于2mg/mL明胶溶液、2mg/mL壳聚糖溶液、2mg/mL明胶溶液及2μg/mLBMP2溶液中，各溶液浸泡时间均为5～15min；
所述壳聚糖溶液用体积分数1％的醋酸溶液配制；降钙素溶液和明胶溶液用pH值7.4的PBS缓冲液配制；BMP2溶液用100mM，pH值5.1的醋酸钠溶液配制。
优选的，还包括步骤d，所述步骤d为“根据需要的膜层数重复n(n为正整数)次步骤c的操作”。
更优选的，所述步骤d为“重复4次步骤c的操作”。
其中，步骤a中利用硝酸预处理TC4钛合金表面，可增加材料表面的羟基基团，引发多巴胺的吸附；
步骤b中利用多巴胺修饰羟基处理的钛合金表面，可引发明胶层的沉积，将其作为引发层启动后续多层膜的组装；
步骤c中采用层层自组装技术将细胞因子BMP2及降钙素组装到壳聚糖/明胶多层膜修饰的钛合金表面，制备出系统调控骨质疏松症中局部骨重建及愈合的功能化钛合金界面系统。
本发明的有益效果在于：本发明通过层层自组装技术将细胞因子BMP2及降钙素组装到壳聚糖/明胶多层膜修饰的钛合金表面，获得了系统调控骨质疏松症中局部骨重建及愈合的功能化钛合金界面系统。该方法操作简单、成本低廉、通用性强，不需要特殊设备。利用该方法制备的钛合金功能界面能够调控间充质干细胞和破骨细胞的生物学行为，促进骨质疏松症动物模型中植入体的骨整合，在骨疾病治疗机骨移植技术中有重要的临床应用价值。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
图1扫描电镜图，其中，a图为未经组装的TC4表面；b-d图依次为经LBL、LBL/CT和LBL/CT/BMP2组装过后的TC4表面。
图2材料表面接触角检测结果。
图3降钙素及BMP2分别从TC4/LBL/CT/BMP2中的累积释放曲线。
图4骨髓间充质干细胞在不同底物表面培养7天后成骨相关基因的表达，其中，a图为BMP2、Runx2及osterix基因的表达；b图为ALP、OCN及OPN基因的表达；c图为OPG及RANKL基因的表达；d图为OPG/RANKL基因表达的比率；n＝3，**p<0.01。
图5动物实验结果。其中，a-d图依次为样本TC4、TC4/LBL、TC4/LBL/CT和TC4/LBL/CT/BMP2植入4周后的X-射线影像图，e图则为植入4周及12周后，不同样本与宿主骨之间的界面结合力检测(push-out检测)，n＝3.**p<0.01。
具体实施方式
下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
文中，TC4表示Ti6Al4V钛合金，CT表示降钙素，BMP2为骨形态发生蛋白-2，LBL为层层组装技术。
本发明首先利用硝酸预处理Ti6Al4V(TC4)钛合金表面，增加材料表面的羟基基团，引发多巴胺的吸附，从而使明胶沉积，将其作为引发层启动后续多层膜的组装；最后采用层层自组装技术将细胞因子BMP2及降钙素组装壳聚糖/明胶多层膜修饰的钛合金表面，制备出系统调控骨质疏松症动物模型中局部骨重建及愈合的功能化钛合金界面系统。
在制备过程中，众多因素影响钛合金功能界面的构建，例如抗骨质疏松症药物降钙素的浓度、活性因子的使用浓度、明胶及壳聚糖的沉积浓度及沉积时间等，不同的制备条件可得到不同表面形貌特征的钛合金材表面结构。
可行的制备方法如下：
协同调控骨质疏松症中局部骨重建及愈合的钛合金的功能化界面构建方法，包括如下步骤：
a.钛合金表面预处理：
将钛合金置于体积分数30～50％的硝酸溶液中，50～70℃孵育30～60min，清洗后沸水中浸泡1h；
b.多巴胺的吸附及明胶的固定：
将预处理后的钛合金置于0.5～6mg/mL多巴胺溶液中，20～30℃避光放置6～48h后清洗，然后用1～4mg/mL的明胶溶液浸泡8-16h，清洗并干燥；所述多巴胺溶液用5～15mM，pH8.5的Tris缓冲溶液配制；明胶溶液用pH值7.4的PBS缓冲液配制；
c.钛合金表面降钙素及BMP2杂化多层膜的制备：
将步骤b处理后的钛合金依次浸泡于1～10mg/mL壳聚糖溶液、1～10mg/mL明胶溶液和0.5～5μg/mL的降钙素溶液中，清洗后再依次浸泡于1～10mg/mL明胶溶液、1～10mg/mL壳聚糖溶液、1～10mg/mL明胶溶液及0.5～5μg/mL的BMP2溶液中，各溶液浸泡时间均为5～15min；
所述壳聚糖溶液用体积分数1％的醋酸溶液配制；降钙素溶液和明胶溶液用pH值7.4的PBS缓冲液配制；BMP2溶液用100mM，pH值5.1的醋酸钠溶液配制；
d.重复步骤c的操作n次，直到所期望的[(Gel/Chi/Gel/CT)/(Gel/Chi/Gel/BMP2)]n多层膜组装到TC4表面(其中Gel代表明胶，Chi代表壳聚糖，CT代表降钙素)。
作为最佳实施例的制备方法如下：
a.钛合金表面酸处理：将55mL体积分数65～68％的浓硝酸加入到44mL双蒸水中，制备体积分数40％的硝酸溶液；将直径为15mm，厚度为1mm的Ti6Al4V圆片或直径为3mm，高度为13mm的Ti6Al4V钛棒置于体积分数40％的硝酸溶液中，60℃孵育40min；清洗后煮沸1h；
b.多巴胺的吸附及明胶的固定：配置浓度为10mM的Tris缓冲溶液，用该Tris缓冲液配置浓度为2mg/mL的多巴胺溶液；将步骤a处理后的Ti6Al4V置于多巴胺溶液中，室温放置12h；润洗TC4三遍后，用2mg/mL的明胶溶液浸泡10h；双蒸水润洗，干燥备用；
c.钛合金TC4表面降钙素及BMP2杂化多层膜的制备：首先用100mM的NaAC溶液(pH＝5.1)制备浓度2μg/mL的BMP2溶液，1％(v/v)醋酸制备浓度为2mg/mL的壳聚糖溶液，PBS缓冲液(pH＝7.4)制备浓度为2mg/mL的明胶溶液和浓度为2μg/mL的降钙素溶液；将步骤b制备的明胶修饰的TC4样本依次浸泡于2mg/mL壳聚糖溶液、2mg/mL明胶溶液、2μg/mL降钙素溶液中，各溶液分别浸泡5～15min，每浸泡完一次用双蒸水润洗两次，每次润洗1min；随后将该样本依次浸泡于2mg/mL明胶溶液、2mg/mL壳聚糖溶液、2mg/mL明胶溶液及2μg/mL的rhBMP2溶液中，每浸泡完一次用二蒸水润洗两次，每次润洗1min；重复本步骤4次。
以下是构建功能化界面的相关结果：
用扫描电镜和接触角检测监控钛合金TC4表面多层膜的构建。如图1中a-d图分别为处理前后的钛合金表面的扫面电镜图。从图中可以看出，未经任何修饰的TC4钛合金表面较为粗糙，有少许划痕，这可能是由抛光处理造成的(图1中a图)。不同多层膜沉积后，TC4/LBL(图1中b图)、TC4/LBL/CT(图1中c图)、TC4/LBL/CT/BMP2(图1中d图)三个样本表面无明显差异。但相对于纯TC4样本，多层膜覆盖后的样本表面较为光滑且材料表面出现了细胞的颗粒状结构，这可能是由于多层膜结构中聚阳离子和聚阴离子在组装的过程形成复合颗粒引起的。图2显示，从第五层开始，材料表面接触角分别为40°，34°，47°，33°及40°，相对应于降钙素、明胶、壳聚糖、明胶以及BMP2为最外层时接触角的大小。后续TC4钛合金表面多层膜的沉积形成的接触角也产生了类似的的规律。结果表明BMP2及降钙素杂化多层膜已经在TC4钛合金表面形成，且[(Gel/Chi/Gel/CT)/(Gel/Chi/Gel/BMP2)]n多层膜n为4时，效果最好。
下面对钛合金功能化界面进行相关功能测试：
一.钛合金功能界面调控抗骨质疏松症药物及活性因子的释放
本研究考察降钙素及BMP2活性因子从钛合金功能界面中的释放行为。
首先用异硫氰酸罗丹明(rhodamineisothiocyanat,RITC)及异硫氰酸荧光素(FITC)分别标记BMP2及降钙素(Calcitonin，CT)，得到RITC-BMP2及FITC-CT分子。随后用RITC-BMP2及FITC-CT在TC4植入体表面构建荧光标记的多层膜，即TC4/LBL/CT-FITC/BMP2和TC4/LBL/CT/BMP2-RITC。将上述样本置于PBS缓冲溶液(pH7.4)中，37℃孵育，在相应的时间点取出培养液进行荧光强度检测，根据释放荧光强度及初始的沉积量做出RITC-BMP2及FITC-CT的释放曲线。
如图3所示，在36h和72h内RITC-BMP2从多层膜中的释放量分别约达到30％和50％，随后RITC-BMP2持续释放。孵育14天后，TC4植入体表面仍有约18％的RITC-BMP2残留。对于CT-FITC组装的钛合金表面，FITC-CT的释放趋势与RITC-BMP2相类似。然而，与RITC-BMP2相比，FITC-CT在7天内的释放量低于RITC-BMP2，而8天后，FITC-CT显示了较高的释放速率。这可能与BMP2及降钙素在多层膜中的位置及扩散速度的差异相关。结果表明随TC4表面多层膜的降解，BMP2及降钙素可以实现较长时间内的持续释放。
二.钛合金功能界面调控干细胞的分化
选取制备得到的样本，考察TC4钛合金材料表面骨髓间充质干细胞成骨相关基因的表达。首先进行骨髓间充质干细胞的原代培养。将第三代或四代骨髓间充质干细胞接种在TCPS，纯TC4,TC4/LBL,TC4/LBL/CT以及TC4/LBL/CT/BMP2植入体表面，细胞接种密度为2×104个细胞/cm2。培养7天后，收集细胞并用Trizol试剂盒提取总RNA。将总RNA反转录成cDNA，用于后续的定量PCR(qPCR)检测。目的基因的表达用β-actin基因进行归一，并通过2(-DDCT)方法进行计算。如图4所示，TC4/LBL/CT/BMP2表面MSCs显示了高水平的成骨相关基因的表达，包括碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、BMP2、核转录相关因子2、osterix、以及骨保护素。与纯TC4样本相比，TC4/LBL/CT/BMP2相应地上调MSCs中碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、BMP2、核转录相关因子2、osterix、以及骨保护素等基因分别至1.6倍,1.53倍,1.81倍,2.0倍,1.2倍,1.84倍和1.2倍(图4中a-c图)。此外，与纯的TC4或TC4/LBL相比，样本TC4/LBL/CT也显示了较高水平的MSCs内成骨相关基因的表达(图4中a-c图)。相反的，TC4/LBL/CT/BMP2或TC4/LBL/CT表面MSCs内RANKL的表达水平较纯TC4和TC4/LBL样本表面的细胞低(图4中c图)。因此，在所有的样本中，TC4/LBL/CT/BMP2表面MSCs内OPG与RANKL的表达比率最低(图4中d图)。结果表明TC4钛合金功能界面有利于诱导干细胞向成骨细胞的分化，促进骨生成。
三.钛合金功能界面诱导骨质疏松症动物模型体内骨生成
利用卵巢切除法构建兔子的骨质疏松症模型。选取制备得到的TC4/LBL/CT/BMP2圆棒样本，以及TC4,TC4/LBL,TC4/LBL/CT圆棒植入骨质疏松症兔子模型的股骨骨端。用静脉注射苯巴比妥钠及肌肉注射麻醉兔子，将兔子手术部位剃毛消毒后，利用手术电转(直径为3cm长度为13mm)在兔子股骨骨端转孔，将不同的样本插入转孔中。植入4周后，用x-射线影像观察不同钛合金植入体在骨质疏松症兔子骨股端的位置及其周围骨生成的状况。同时，植入4周及12周后，处死兔子，取出还有样本的兔子骨股端，利用push-out检测方法考察植入体与自然骨之间的整合力。
如图5中a-d图显示了植入四周后不同样本在兔子骨股端的位置，结果显示兔子体内所有样本没有发生移位或松散，所有的样本仍固定在原位。然而，push-out检测试验显示(图5中e图)，植入四周后，TC4/LBL/CT/BMP2样本与周围骨组织之间的界面结合强度均显著高于其它的样本(p<0.01)。同时TC4/LBL/CT与周围骨组织的界面结合强度也高于纯的TC4及TC4/LBL样本。植入12周后，可以观察到同样的趋势。研究表明具钛合金功能界面(TC4/LBL/CT/BMP)比未经处理的钛合金而言更能促进植入体界面的骨重构，增加植入体与自然骨的骨整合性。这可能是因为TC4表面含有降钙素与BMP2的多层膜结构提供了一个模拟的细胞外微环境网络体系，能促进骨相关细胞之间的相互作用及生物学交流，最终促进骨生成。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
Claims (7)
1.协同调控骨质疏松症中局部骨重建及愈合的钛合金的功能化界面构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.钛合金表面预处理：
将钛合金置于体积分数30～50％的硝酸溶液中，50～70℃孵育30～60min，清洗后沸水中浸泡1h；
b.多巴胺的吸附及明胶的固定：
将预处理后的钛合金置于0.5～6mg/mL多巴胺溶液中，20～30℃避光放置6～48h后清洗，然后用1～4mg/mL的明胶溶液浸泡8-16h，清洗并干燥；所述多巴胺溶液用5～15mM，pH8.5的Tris缓冲溶液配制；明胶溶液用pH值7.4的PBS缓冲液配制；
c.钛合金表面降钙素及BMP2杂化多层膜的制备：
将步骤b处理后的钛合金依次浸泡于1～10mg/mL壳聚糖溶液、1～10mg/mL明胶溶液和0.5～5μg/mL的降钙素溶液中，清洗后再依次浸泡于1～10mg/mL明胶溶液、1～10mg/mL壳聚糖溶液、1～10mg/mL明胶溶液及0.5～5μg/mL的BMP2溶液中，各溶液浸泡时间均为5～15min；
所述壳聚糖溶液用体积分数1％的醋酸溶液配制；降钙素溶液和明胶溶液用pH值7.4的PBS缓冲液配制；BMP2溶液用100mM，pH值5.1的醋酸钠溶液配制。
2.根据权利要求1所述的协同调控骨质疏松症中局部骨重建及愈合的钛合金的功能化界面构建方法，其特征在于，所述步骤a中所述钛合金为TC4钛合金。
3.根据权利要求1所述的协同调控骨质疏松症中局部骨重建及愈合的钛合金的功能化界面构建方法，其特征在于，所述步骤b中多巴胺溶液浓度为2mg/mL，明胶溶液浓度为2mg/mL。
4.根据权利要求1所述的协同调控骨质疏松症中局部骨重建及愈合的钛合金的功能化界面构建方法，其特征在于，所述步骤c中壳聚糖溶液浓度为2mg/mL，明胶溶液浓度为2mg/mL，降钙素溶液浓度为2μg/mL，BMP2溶液浓度为2μg/mL。
5.协同调控骨质疏松症中局部骨重建及愈合的钛合金的功能化界面构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.钛合金表面预处理：
将钛合金置于体积分数40％的硝酸溶液中，60℃孵育40min，清洗后沸水中浸泡1h；
b.多巴胺的吸附及明胶的固定：
将预处理后的钛合金置于2mg/mL多巴胺溶液中，20～30℃避光放置12h后清洗，然后用2mg/mL的明胶溶液浸泡10h，清洗并干燥；所述多巴胺溶液用10mM，pH值8.5的Tris缓冲溶液配制；明胶溶液用pH值7.4的PBS缓冲液配制；
c.钛合金表面降钙素及BMP2杂化多层膜的制备：
将步骤b处理后的钛合金依次浸泡于2mg/mL壳聚糖溶液、2mg/mL明胶溶液和2μg/mL的降钙素溶液中，清洗后再依次浸泡于2mg/mL明胶溶液、2mg/mL壳聚糖溶液、2mg/mL明胶溶液及2μg/mLBMP2溶液中，各溶液浸泡时间均为5～15min；
所述壳聚糖溶液用体积分数1％的醋酸溶液配制；降钙素溶液和明胶溶液用pH值7.4的PBS缓冲液配制；BMP2溶液用100mM，pH值5.1的醋酸钠溶液配制。
6.根据权利要求1～5任一项所述的协同调控骨质疏松症中局部骨重建及愈合的钛合金的功能化界面构建方法，其特征在于，还包括步骤d，所述步骤d为“根据需要的膜层数重复n(n为正整数)次步骤c的操作”。
7.根据权利要求6所述的协同调控骨质疏松症中局部骨重建及愈合的钛合金的功能化界面构建方法，其特征在于，所述步骤d为“重复4次步骤c的操作”。
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