CN111939317B - 一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明针对骨形态发生蛋白在存储使用过程中缺乏优质的载体材料这一问题，利用多巴胺自聚合的普适性将带正电荷的聚电解质、带负电荷的聚电解质、具有生物活性的陶瓷粉末通过层层组装的方式整合到钛基材上，构建了骨形态发生蛋白的缓释系统，实现了骨形态发生蛋白在病灶部位的长效缓释，且该缓释系统具有表面模量高、稳定、耐辐射、生物相容性好等优点，能够有效促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，预期能有效促进骨修复。

Description

一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法
技术领域
本发明涉及蛋白缓释系统的制备，具体是涉及一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法。
背景技术
骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是促进体内成骨重要的因子，能跨种诱导未分化间充质干细胞向成骨细胞方向增殖和分化，促进成骨，在颌面骨缺损修复、口腔种植、整形外科等领域被广泛应用。但目前，在应用过程中存在以下问题：
1）BMP易在体液中快速扩散，也容易被蛋白酶所分解，治疗浓度难以维持，不能在有效的时间内作用于更多的靶细胞，其诱导活性难以得到充分的发挥。
2）周期性给予BMP通常需要侵入性的过程，如注射或输液，这些都是痛苦和麻烦的方法，而且大剂量和经常性给予BMP，也是不实际的，并且费用昂贵。
3）BMP的作用不只是针对骨组织，它们也影响其他的细胞和器官。一个错误的给予会导致不该骨化的组织如临近肌肉、神经和血管的钙化。
4）BMP的半衰期比较短，在所需部位直接和持续给与是必要的。
5）对于较大的骨质缺损，BMP不能发挥支架作用，因此需要一种合适的载体材料与之协同作用。
如果能够将BMP与合适的载体结合，一则BMP的消耗量会大幅度降低，二则可限定BMP在特定的缺损部位发挥作用，避免扩散，避免异位成骨，也更安全。因此，研究能持续释放BMP的缓释系统是十分必要的。
目前用于制作缓释系统的材料主要包括天然载体、合成的生物可降解材料与其他无机物等。其中，天然载体如胶原、脱矿骨基质（demineralisedbone matrix，DBM）、壳聚糖等。这些材料的优势是具有良好的生物相容性和生物可吸收性，也可以改良。其缺点是因为是自然来源，取材加工过程中可能有疾病传播的可能，也有免疫原性，比起合成的聚合物结构复杂，专业生产复杂，多次加工会引起基质一致性上的差异，而且胶原与BMP的亲和性不佳，装载的BMP在植入体内两周就释放完毕；另外，这些聚合物缺乏机械强度，不能耐受压力。合成的生物可降解材料如聚乳酸（poly-lacticacid，PLA）、PGA及其共聚物（poly -lactide -co -glycolide，PLGA）等。这些材料来源丰富，可加工成各种形状，但它们的最大问题是对比同种异体骨移植，缺乏骨引导性，且具有疏水性，并且降解产物会使pH 降低。
因此，如何克服上述载体材料的缺点，构建一种更稳定、更安全和经济性较佳的骨形态发生蛋白缓释系统是临床上研究的主要挑战。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法，主要采用层层组装的方法，将与BMP有良好亲和性的生物大分子多糖、多肽和羟基磷灰石有机结合于一体构建仿生多层膜，并将BMP装载于该多层膜之上，实现一种骨形态发生蛋白缓释系统的构建，具有长效、稳定、安全、经济的优点，且工艺条件温和、可适用的基材范围广。
本发明采用的技术方案为，以钛材为基材，构建骨形态发生蛋白缓释系统：
包括以下步骤：
步骤一：活化钛材；将钛材洗涤、干燥，随后浸泡在含有多巴胺的缓冲液中，反应12~72小时后，得到PDA修饰的Ti基材；
步骤二：活化陶瓷粉末；将所述陶瓷粉末和多巴胺溶解于缓冲液中，震荡分散，在搅拌下反应12~72小时后，离心除去大颗粒，得到PDA@HA溶液;
步骤三：构建多层膜；将所述PDA修饰的Ti基材顺次在带正电的聚电解质溶液、带负电的聚电解质溶液、带正电的聚电解质溶液和所述PDA@HA溶液中各浸泡8~15min，每次浸泡完毕后，再用水进行清洗；
步骤四：循环浸泡；将步骤三中的浸泡、清洗过程循环操作，循环次数为n次，得到（+/-/+/PDA@HA）n多层膜。
进一步地优化制备方法，可以对所述（+/-/+/PDA@HA）n多层膜继续做强化处理。将所述（+/-/+/PDA@HA）n多层膜在交联溶液中浸泡6~24小时，随后用水充分洗涤、干燥即得到交联后多层膜，记作x（+/-/+/PDA@HA）n多层膜。
优选的，步骤一中所述含有多巴胺的缓冲液为多巴胺浓度为0.3~5.0mg/mL的Tris-HCl缓冲液，其pH为8~9。
优选的，步骤二中所述陶瓷粉末为羟基磷灰石、生物活性玻璃、磷酸钙、氧化铝或氧化锆中的任一种，所述陶瓷粉末和所述多巴胺的重量比为8~15:1。
优选的，步骤三中所述带正电的聚电解质溶液是壳聚糖溶液或聚赖氨酸溶液中的任一种，浓度为0.3~5.0mg/mL；和/或，所述带负电的聚电解质溶液为葡聚糖溶液、肝素溶液、硫酸肝素溶液、海藻酸溶液、透明质酸溶液、胶原溶液、明胶溶液、卡拉胶溶液或醋酸纤维素溶液中的任一种，浓度为0.3~5.0mg/mL；和/或，步骤三中所述PDA@HA溶液为PDA@HA浓度为0.3~5.0mg/mL的溶液。
优选的，所述循环次数n的取值大于3。
优选的，所述交联溶液为浓度为25~70mg/mL碳化二亚胺溶液、质量浓度为2.5%戊二醛溶液或质量浓度为1~4%的京尼平溶液中的至少一种，或，浓度为25~70mg/mL碳化二亚胺溶液和5~25 mg/mL硫代琥珀酰亚胺溶液的混合物。
本发明还包括一种骨形态发生蛋白缓释系统，其特征在于：是根据上述任一种构建方法制备的骨形态发生蛋白缓释系统。
本发明还包括一种装载有骨形态发生蛋白缓释系统的构建方法，其特征在于：将所述骨形态发生蛋白缓释系统浸泡到含有骨形态发生蛋白的溶液中进行装载；或，将含有骨形态发生蛋白的溶液直接滴加到所述骨形态发生蛋白缓释系统上。
本发明还包括一种装载有骨形态发生蛋白缓释系统，其特征在于：根据上述的构建方法制备的装载有骨形态发生蛋白缓释系统。
本发明的有益效果是：
本发明针对骨形态发生蛋白在存储使用过程中缺乏优质的载体材料这一问题，利用多巴胺自聚合的普适性将带正电的聚电解质如壳聚糖（Chi）或聚赖氨酸，带负电的聚电解质如葡聚糖、肝素、硫酸肝素、海藻酸、透明质酸（Ha）、胶原、明胶、卡拉胶或醋酸纤维素，具有生物活性的陶瓷粉末如羟基磷灰石（HA）、生物活性玻璃、磷酸钙、氧化铝或氧化锆，通过层层组装的方式整合到钛基材上，构建了骨形态发生蛋白的缓释系统，实现了骨形态发生蛋白在病灶部位的长效缓释，且该缓释系统具有表面模量高、稳定、耐辐射、生物相容性好等优点，能够有效促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，预期能有效促进骨修复。
以钛材作为基底材料时，主要是利用多巴胺在基底材料上类似于贻贝粘附蛋白的自聚合特性对钛材进行活化，经多巴胺活化后的钛材，可为后续对多层膜的铆定提供活性位点。随后引入多层膜，膜层组成主要是带正电的聚电解质、带负电的聚电解质和经PDA修饰的陶瓷颗粒，膜层的结构为（+/-/+/PDA@HA）n多层膜，其中，n代表四层膜的循环次数。
对于膜层材料的具体种类，本发明又做了具体的限定，优选的如带正电的壳聚糖（Chi），带负电的透明质酸（Ha），和具有生物活性的羟基磷灰石（HA），经n次循环得到的多层膜记作（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）n多层膜，其中，羟基磷灰石（HA）能为体内新骨生成提供Ca2+离子源，促进骨及前骨细胞的黏附增殖和成骨分化。
其中，针对羟基磷灰石本身具有在水中易团聚、分散性差的缺点，本发明采用多巴胺自聚合技术对其进行表面修饰以提高其分散性。经修饰后，羟基磷灰石的表观粒径减小，在水中的分散性大大增加，并且由于表面聚多巴胺的存在使得羟基磷灰石粒子能够与氨基结合，使得PDA@HA能够参与到与带氨基聚电解质的层层组装中。此外，在多层膜中，引入羟基磷灰石之后，可大大增加多层膜表面的杨氏模量，进一步地，对组装完成的多层膜进行化学交联，可以进一步提高多层膜的稳定性，且交联剂对多层膜的表面模量也有积极的影响。
表面模量的提高在这里意义重大。一般不同的细胞适应的材料软硬程度不同，神经细胞适合在较软的材料上进行繁殖分化，而骨细胞偏好较硬的材料。而本发明中涉及的骨形态发生蛋白主要用于骨细胞相关的领域，表面模量的提高有利于细胞的铺展、增殖和分化，通过增强多层膜表面的模量促进骨及前骨细胞的黏附增殖和成骨分化,为植入体表面新骨的生成提供良好的物理化学微环境。
随之，再通过后扩散法成功装载BMP，BMP的体外缓释因多层膜的交联而减缓，实现了病灶部位的长效缓释，且多层膜对成骨细胞增殖有明显促进作用，装载BMP之后，能够显著诱导间充质干细胞的成骨分化。此外，多层膜对所装载的BMP有很好的保护作用，γ射线灭菌后体外细胞ALP检测显示BMP-2仍有70%左右活性，体内实验评价结果表明BMP-2保有绝大部分生物活性。
综上所述，多层膜中三种不同种类的膜层相互配合：天然多糖良好的生物相容性、羟基磷灰石对骨细胞的良好亲和性，再加上随之装载的骨形态发生蛋白的长效缓释对成骨的促进作用，能够极大地促进间充质干细胞的增殖和细胞间融合，有效促进骨修复。同时，该方法液可拓展到其它蛋白类药物的装载和保护中。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1为羟基磷灰石透射电镜图： A）未修饰的羟基磷灰石，B）多巴胺修饰后的羟基磷灰石，C）多巴胺自聚物，可见多巴胺自聚物颗粒较小；
图2为动态光散射检测羟基磷灰石粒径的结果：A）多巴胺修饰前后的羟基磷灰石和多巴胺自聚物的粒径分布图，B）多巴胺修饰前后的羟基磷灰石和多巴胺自聚物的平均粒径柱状图；
图3为纳米压痕仪测得的（Chi/Ha）20多层膜和（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜表面模量。纵坐标为杨氏模量值，横坐标为交联剂EDC的浓度，分别为10、30、70mg/mL；
图4为（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜修饰的钛表面在不同温度下的BMP-2装载量：纵坐标为BMP-2的装载量， PEM-Ti为（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜修饰的钛表面，xPEM-Ti为交联（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜修饰的钛表面，Ti为未修饰的钛表面；
图5为（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜修饰的钛表面对所装载BMP-2的体外缓释情况（释放百分比）：横坐标为缓释时间，纵坐标为释放百分比，PEM-Ti为（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜修饰的钛表面，xPEM-Ti为交联（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜修饰的钛表面，Ti为未修饰的钛表面；
图6为（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜修饰的钛表面对所装载BMP-2的体外缓释情况（释放量）：横坐标为缓释时间，纵坐标为释放量，PEM-Ti为（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜修饰的钛表面，xPEM-Ti为交联（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜修饰的钛表面，Ti为未修饰的钛表面；
图7为CCK-8检测成骨细胞活力和增殖情况；
图8为间充质干细胞在不同基材表面培养14天后功能机制方面的western blot结果：A）代表性WB条带，B-D）RUNX-2，OCN，COL 1定量结果；
图9为Ti+PEM+BMP-2体系γ射线灭菌前后SEM表面形貌图：A，A’）灭菌前，B，B’）灭菌后；
图10为γ射线辐照灭菌前后的多层膜BMP-2缓释体系表面骨髓间充质干细胞的ALP表达（培养3天后）；
图11为多孔钛网支架大体观：A）裸支架，B）Ti+PEM+BMP-2支架，C）γ射线辐照灭菌后的Ti+PEM+BMP-2支架；
图12为γ辐照灭菌前后钛支架周围间充质干细胞的ALP表达（培养7天后）；
图13为Micro-CT重建Ti+PEM+BMP-2支架诱导的大鼠尾椎两横突之间的融合情况：γ- Ti+PEM+BMP-2指γ射线辐照灭菌后的Ti+PEM+BMP-2。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的说明。
实施例1：
步骤一：活化钛材。将钛材洗涤、干燥，随后浸泡在多巴胺浓度为1mg/mL、pH为8.5的Tris-HCl缓冲液中，反应48小时后，得到PDA修饰的Ti基材；
步骤二：活化陶瓷粉末。按重量比为10:1称取陶瓷粉末和多巴胺，并将所述陶瓷粉末和多巴胺溶解于Tris-HCl缓冲液中，在超声粉碎机中震荡数分钟，使陶瓷颗粒分散开，随后在搅拌下反应48小时，离心除去大颗粒，得到PDA@HA溶液；
步骤三：构建多层膜。将所述PDA修饰的Ti基材顺次在壳聚糖浓度为1mg/mL的溶液、透明质酸浓度为1mg/mL的溶液、壳聚糖浓度为1mg/mL的溶液和PDA@HA浓度为1mg/mL的溶液中各浸泡10min，每次浸泡完毕后，再用水进行清洗；
步骤四：循环浸泡；将步骤三中的浸泡、清洗过程循环操作，循环次数为10次，得到（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜，记为Ti+PEM。
实施例2：
进一步地，对实施例1中得到的（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜进行强化后处理，将所述（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜浸泡到含有碳化二亚胺（EDC）和硫代琥珀酰亚胺（sNHS）的交联溶液中过夜，其中，EDC浓度分别为30mg/mL，sNHS浓度为11mg/mL。随后用水充分洗涤、干燥即得到交联后的（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜。
实施例3：
进一步地，对实施例2中得到的交联后的（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜上装载骨形态发生蛋白，装载方法为：将所述交联后的（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜浸泡到浓度为20ug/mL，pH 3.0的骨形态发生蛋白-2（BMP-2）溶液中进行装载，最终可得到装载着BMP-2的缓释系统：Ti+PEM+BMP-2。
实施例4：
进一步地，对实施例1中得到的（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜进行强化后处理，将所述（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜浸泡到含有质量浓度为2.5%戊二醛、质量浓度为3%的京尼平的交联溶液中过夜。随后用水充分洗涤、干燥即得到交联后的（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜。
实施例5：
进一步地，对实施例4中得到的交联后的（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜上装载骨形态发生蛋白，装载方法为：将所述交联后的（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜浸泡到浓度为20ug/mL，pH 3.0的骨形态发生蛋白-2（BMP-2）溶液中进行装载，最终可得到装载着BMP-2的缓释系统：Ti+PEM+BMP-2。
实施例6：
进一步地，对实施例1中得到的（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜进行强化后处理，将所述（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜浸泡到含有30mg/mL的EDC交联溶液中过夜。随后用水充分洗涤、干燥即得到交联后的（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜。
实施例7：
进一步地，对实施例1中得到的（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜进行强化后处理，将所述（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜浸泡到含有质量浓度为2.5%戊二醛的交联溶液中过夜。随后用水充分洗涤、干燥即得到交联后的（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜。
实施例8：
进一步地，对实施例1中得到的（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜进行强化后处理，将所述（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜浸泡到含有质量浓度为3%的京尼平的交联溶液中过夜。随后用水充分洗涤、干燥即得到交联后的（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜。
对比例1：
步骤五中使用的交联溶液组成为：EDC浓度为10mg/mL，sNHS浓度为11mg/mL。
其他操作和实施例2相同。
对比例2：
步骤五中使用的交联溶液组成为：EDC浓度为70mg/mL，sNHS浓度为11mg/mL。
其他操作和实施例2相同。
对比例3：
步骤一：活化钛材。将钛材洗涤、干燥，随后浸泡在多巴胺浓度为1mg/mL、pH为8.5的Tris-HCl缓冲液中，反应48小时后，得到PDA修饰的Ti基材；
步骤二：活化陶瓷粉末。按重量比为10:1称取陶瓷粉末和多巴胺，并将所述陶瓷粉末和多巴胺溶解于Tris-HCl缓冲液中，在超声粉碎机中震荡数分钟，使陶瓷颗粒分散开，随后在搅拌下反应48小时，离心除去大颗粒，得到PDA@HA溶液；
步骤三：构建多层膜。将所述PDA修饰的Ti基材顺次在壳聚糖浓度为1mg/mL，pH4.0的溶液、透明质酸浓度为1mg/mL，pH 4.0的溶液中各浸泡10min，每次浸泡完毕后，再用水进行清洗；
步骤四：循环浸泡；将步骤三中的浸泡、清洗过程循环操作，循环次数为20次，得到（Chi/Ha）20多层膜；
步骤五：强化后处理。将所述（Chi/Ha）20多层膜浸泡到含有碳化二亚胺（EDC）和硫代琥珀酰亚胺（sNHS）的交联溶液中过夜，其中，EDC浓度分别为30mg/mL，sNHS浓度为11mg/mL。随后用水充分洗涤、干燥即得到交联后的（Chi/Ha）20多层膜。
对比例4：
步骤五中使用的交联溶液组成为：EDC浓度为10mg/mL，sNHS浓度为11mg/mL。
其他操作和对比例3相同。
对比例5：
步骤五中使用的交联溶液组成为：EDC浓度为70mg/mL，sNHS浓度为11mg/mL。
其他操作和对比例3相同。
对比例6：
根据实施例3中装载BMP-2蛋白的方法，将BMP-2直接装载在未经交联的Ti+PEM上，其中Ti+PEM的制备方法同实施例1。
对比例7：
根据实施例3中装载BMP-2蛋白的方法，将BMP-2直接装载在钛材（Ti）上，其中，对Ti的前处理（洗涤、干燥）同实施例1。
对比例8：
只经过洗涤、干燥的钛材（Ti）。
表1 实施例1~8与对比例1-8的对比表
项目 多层膜组成 交联与否
实施例1 （Chi/Ha/Chi/PDA@HA）<sub>10</sub> Ti+PEM（未交联）
实施例2 （Chi/Ha/Chi/PDA@HA）<sub>10</sub> Ti+PEM（交联）
实施例3 （Chi/Ha/Chi/PDA@HA）<sub>10</sub> Ti+PEM+BMP-2(交联)
实施例4 （Chi/Ha/Chi/PDA@HA）<sub>10</sub> Ti+PEM（交联）
实施例5 （Chi/Ha/Chi/PDA@HA）<sub>10</sub> Ti+PEM+BMP-2(交联)
实施例6 （Chi/Ha/Chi/PDA@HA）<sub>10</sub> Ti+PEM（交联）
实施例7 （Chi/Ha/Chi/PDA@HA）<sub>10</sub> Ti+PEM（交联）
实施例8 （Chi/Ha/Chi/PDA@HA）<sub>10</sub> Ti+PEM+BMP-2(交联)
对比例1 （Chi/Ha/Chi/PDA@HA）<sub>10</sub> Ti+PEM(交联)
对比例2 （Chi/Ha/Chi/PDA@HA）<sub>10</sub> Ti+PEM(交联)
对比例3 （Chi/Ha）<sub>20</sub> Ti+（Chi/Ha）<sub>20</sub>(交联)
对比例4 （Chi/Ha）<sub>20</sub> Ti+（Chi/Ha）<sub>20</sub>(交联)
对比例5 （Chi/Ha）<sub>20</sub> Ti+（Chi/Ha）<sub>20</sub>(交联)
对比例6 （Chi/Ha/Chi/PDA@HA）<sub>10</sub> Ti+PEM+BMP-2(未交联)
对比例7 — Ti-BMP-2
对比例8 — Ti
随后对各实施例与对比例中的得到缓释系统的缓释行为和相关性质进行测试与表征。
使用透射电镜、动态光散射法、扫描电镜、纳米压痕仪等对所得材料的表面性质及力学性能进行测试。
将装载了BMP-2的多层膜浸泡到37℃的PBS中，隔段时间检测浸泡的PBS溶液中BMP-2的浓度检测蛋白体外释放行为。
随后，再通过CCK-8试剂盒、染色实验检测多层膜表面成骨细胞的黏附增殖情况；通过蛋白印迹实验评价基于多层膜的BMP-2缓释系统对骨髓见充质干细胞成骨分化的促进作用。
抗辐射性能的测试，直接对各产品进行γ射线照射，随后检测γ射线照射前后的SEM表面形貌图、成骨诱导活性，最后通过大鼠椎间融合模型，将多层膜组装到多孔钛圆筒支架上，考察支架对椎间融合的促进作用。
检测结果参见附图1-13，其中，从附图8开始，“Ti+PEM”均指交联（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜修饰的钛表面。
本发明选用钛材作为基底材料，并利用多巴胺在基底材料上类似于贻贝粘附蛋白的自聚合特性对钛材进行活化，随后引入多层膜，膜层组成主要是壳聚糖（Chi）、透明质酸（Ha）和经PDA修饰的羟基磷灰石（HA），膜层的结构为（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）n多层膜，其中，n代表四层膜的循环次数。透明质酸（Ha）为聚阴离子，壳聚糖（Chi）为聚阳离子，羟基磷灰石则能为体内新骨生成提供Ca2+离子源，促进骨及前骨细胞的黏附增殖和成骨分化。多层膜中三种不同种类的膜层相互配合：天然多糖良好的生物相容性、羟基磷灰石对骨细胞的良好亲和性，再加上随之装载的骨形态发生蛋白的长效缓释对成骨的促进作用，能够极大地促进间充质干细胞的增殖和细胞间融合。
然而，羟基磷灰石本身具有在水中易团聚、分散性差的缺点，本发明采用多巴胺自聚合技术对其进行表面修饰以提高其分散性。经修饰后，羟基磷灰石的分散性增强、表观粒径减小（参见图1）。更具体地，参见图2，通过动态光散射检测羟基磷灰石（HA）、多巴胺修饰的纳米羟基磷灰石（PDA@HA）和多巴胺自聚物（PDA）的表观粒径，可知，羟基磷灰石在水中因为团聚表观粒径达1.759微米，经多巴胺修饰后，纳米羟基磷灰石在水中的分散性大大增加，表观粒径减小到381.8纳米。多巴胺在相同条件下自聚合得到的粒子粒径约133.4纳米。可见，多巴胺的修饰大大增加了纳米羟基磷灰石在水中的分散性，并且由于表面聚多巴胺的存在使得纳米粒子能够与氨基结合，使得PDA@HA能够参与到与带氨基聚电解质的层层组装中。此外，在多层膜中，引入羟基磷灰石之后，可大大增加多层膜表面的杨氏模量，参见图3。进一步地，对组装完成的多层膜进行化学交联，可以进一步提高多层膜的稳定性。且交联剂的浓度对多层膜的表面模量也有影响。
表面模量的提高在这里意义重大。一般不同的细胞适应的材料软硬程度不同，神经细胞适合在较软的材料上进行繁殖分化，而骨细胞偏好较硬的材料。而本发明中涉及的骨形态发生蛋白主要用于骨细胞相关的领域，表面模量的提高有利于细胞的铺展、增殖和分化，通过增强多层膜表面的模量促进骨及前骨细胞的黏附增殖和成骨分化,为植入体表面新骨的生成提供良好的物理化学微环境。
此外，比较实施例2、对比例6和对比例8，未修饰的钛表面比较平整，仅有一些切割或者抛光留下的痕迹，（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）10多层膜修饰后（包括交联和未交联）的钛表面呈现明显的颗粒状，颗粒尺寸约200-300 nm。多层膜修饰后的钛基材上骨形态发生蛋白的装载量大大增加，参见图4，可见，（Chi/Ha/Chi/PDA@HA）n多层膜是骨形态发生蛋白的良好装载平台。
在PBS溶液中进行BMP-2的体外缓释实验，结果参见图5、图6。未修饰的钛基材上大部分的BMP-2在最开始的几个小时内就释放到溶液中了，因其装载量很小，整体释放量较小。修饰了未交联的多层膜之后，BMP-2的释放速度明显下降，释放一周后膜内仍保有40%以上的BMP-2，溶液中BMP-2的浓度较大；对多层膜进行交联之后，BMP-2的释放速度进一步减缓，释放一周后约30%的BMP-2释放到溶液中。
因交联后多层膜稳定性增加，对BMP-2有更好的缓释作用，且能保持溶液中有足够高的BMP-2浓度。
生物相容性的评价结果如下：
多层膜的细胞相容性通过体外成骨细胞培养进行检测，首先用CCK-8试剂盒检测细胞活力和增殖情况，如图7所示，细胞初始上架率超过50%，随着时间的延长，多层膜和多层膜装载BMP-2这两组表面上的细胞数量明显增加，而Ti+BMP-2这一组中，BMP-2只在最初的数小时内突释，对细胞的增殖影响不大。进一步，将间充质干细胞种在材料表面，在成骨诱导培养基中培养14天之后，通过对细胞骨架和细胞核进行染色，以观察间充质干细胞在材料表面的铺展形貌。在未修饰的玻璃基材上，仅有少量细胞和细胞聚集体存在；BMP-2的存在使细胞和细胞聚集体的数量略有增加；多层膜对基材的包被对细胞增殖的促进作用较大，形成了大片聚集体；多层膜进一步结合BMP-2缓释材料表面细胞增殖能力进一步增强，形成的细胞聚集体有层叠呈网络状。可见多层膜中天然多糖良好的生物相容性、羟基磷灰石对骨细胞的良好亲和性、BMP-2蛋白的长效缓释对成骨的促进作用三者结合，能够极大地促进间充质干细胞的增殖和细胞间融合。
基于多层膜的BMP-2缓释体系对骨髓间充质干细胞成骨分化的促进作用通过蛋白印迹（western blotting）进行评价，结果如图8所示。可见，骨髓间充质干细胞在成骨诱导培养基中培养14天后，BMP-2的加入使得Ti上细胞内RUNX-2、OCN、COL 1等成骨分化指标明显增加，多层膜的包被虽然对细胞增殖有明显促进作用（参见图7），但是对成骨分化的促进作用有限，Ti-PEM+BMP-2体系上细胞各成骨分化指标大大增强，可见结合了多层膜对细胞增殖的促进作用和缓释的BMP-2对成骨分化诱导的持续促进作用，本研究中的基于多层膜的BMP-2缓释体系能够有效促进骨髓间充质干细胞的成骨分化，预期能有效促进骨修复。
进一步地，检测γ射线的影响：
蛋白类药物的存储和灭菌一直是制约其广泛使用的一大瓶颈。蛋白类药物通常具有特异性的三维结构，蛋白的生物功能性通常都来源于这种三维结构；但是三维结构比较脆弱，如何在存储尤其是灭菌过程中保持蛋白的结构和活性是蛋白类药物临床应用中的亟需解决的关键性问题。直接加热灭菌和环氧乙烷灭菌无疑会破坏蛋白结构导致蛋白失活，本研究中，我们采用γ射线辐照灭菌检测多层膜缓释体系对BMP-2蛋白活性的保护作用。缓释体系的灭菌采用Co60源γ射线照射，射线剂量为25 KGy。
参见图9辐照灭菌前后多层膜的表面形貌图，可见，γ射线照射灭菌后，多层膜的表面形貌并未有明显变化。
为检测辐照灭菌后多层膜内BMP-2蛋白的生物活性，骨髓间充质干细胞在多层膜表面的成骨分化情况通过对碱性磷酸酶（ALP）的测定来进行定量。由图10所示，无BMP-2的基材灭菌前后ALP表达量没有明显变化，没有多层膜包被的Ti+BMP-2基材在灭菌后BMP-2完全失活，而多层膜缓释体系内装载的BMP-2蛋白在灭菌后仍保存了大部分的生物活性。可见多层膜不仅仅能为BMP-2蛋白提供载体实现其在病灶部位的长效缓释，还能对蛋白进行保护，使其免受辐射的破坏。
最后，生物活性的评价结果如下：
本发明选择大鼠椎间融合模型，将多层膜组装到多孔钛圆筒支架上，考察支架对椎间融合的促进作用。
多孔钛基材卷成筒状，依次浸泡到壳聚糖（Chi）、透明质酸（Ha）、壳聚糖（Chi）、多巴胺修饰的羟基磷灰石（PDA@HA）溶液中，重复10个循环，得到Ti+PEM支架，进一步将支架浸泡到20 ug/mL的BMP-2溶液里装载蛋白，得到Ti+PEM+BMP-2支架，最终对支架进行辐照灭菌，灭菌剂量为25KGy，得到γ-Ti+PEM+BMP-2支架。
参见图11，为多孔钛支架的大体观，多层膜缓释系统的包被对支架的外观基本没有影响，仅改变了钛支架的反光情况；γ射线辐照灭菌之后支架外观没有变化。
将支架置于24孔板中进行间充质干细胞成骨分化培养，培养7天后用ELISA试剂盒对ALP进行定量，结果列于图12。可见，灭菌后Ti+PEM-BMP-2支架仍然具有较高的成骨诱导活性，与之前平面钛材料上的结果相一致
将圆筒状的多孔钛支架置入大鼠尾椎两横突之间，诱导两个横突之间的融合。4周后，取脊椎组织，Micro-CT重建骨组织结构，如图13所示，Ti支架对椎间融合的诱导有限，两横突并未实现融合；多层膜包被的钛支架对椎间融合有一定诱导作用，融合略有增加；BMP-2缓释体系的成骨诱导效果非常明显，两横突之前完全融合；有意思的是，γ射线辐照灭菌后的两横突之间的融合情况与未灭菌的支架类似。由此可见，虽然辐照灭菌使得缓释体系内BMP-2在体外检测时有部分活性丧失，但是被保留的那部分活性仍然能够达到在体内有效诱导骨再生的效果。
除上述优选实施例外，本发明还有其他的实施方式，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变和变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求书中所定义的范围。

Claims (10)

1.一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：活化钛材；将钛材洗涤、干燥，随后浸泡在含有多巴胺的缓冲液中，反应12~72小时后，得到PDA修饰的Ti基材；
步骤二：活化陶瓷粉末；将所述陶瓷粉末和多巴胺溶解于缓冲液中，震荡分散，在搅拌下反应12~72小时后，离心除去大颗粒，得到PDA@HA溶液;
步骤三：构建多层膜；将所述PDA修饰的Ti基材顺次在带正电的聚电解质溶液、带负电的聚电解质溶液、带正电的聚电解质溶液和所述PDA@HA溶液中各浸泡8~15min，每次浸泡完毕后，再用水进行清洗；
步骤四：循环浸泡；将步骤三中的浸泡、清洗过程循环操作，循环次数为n次，得到（+/-/+/PDA@HA）n多层膜。
2.根据权利要求1所述的一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法，其特征在于：将所述（+/-/+/PDA@HA）n多层膜在交联溶液中浸泡6~24小时，随后用水充分洗涤、干燥即得到交联后多层膜，记作x（+/-/+/PDA@HA）n多层膜。
3.根据权利要求1所述的一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法，其特征在于：步骤一中所述含有多巴胺的缓冲液为多巴胺浓度为0.3~5.0mg/mL的Tris-HCl缓冲液，其pH为8~9。
4.根据权利要求1所述的一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法，其特征在于：步骤二中所述陶瓷粉末为羟基磷灰石、生物活性玻璃、磷酸钙、氧化铝或氧化锆中的任一种，所述陶瓷粉末与所述多巴胺的重量比为8~15:1。
5.根据权利要求1所述的一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法，其特征在于：步骤三中所述带正电的聚电解质溶液是壳聚糖溶液或聚赖氨酸溶液中的任一种，浓度为0.3~5.0mg/mL；和/或，所述带负电的聚电解质溶液为葡聚糖溶液、肝素溶液、硫酸肝素溶液、海藻酸溶液、透明质酸溶液、胶原溶液、明胶溶液、卡拉胶溶液或醋酸纤维素溶液中的任一种，浓度为0.3~5.0mg/mL；和/或，所述PDA@HA溶液为PDA@HA浓度为0.3~5.0mg/mL的溶液。
6.根据权利要求1所述的一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法，其特征在于：所述循环次数n的取值大于3。
7.根据权利要求2所述的一种构建骨形态发生蛋白缓释系统的方法，其特征在于：所述交联溶液为浓度为25~70mg/mL碳化二亚胺溶液、质量浓度为2.5%戊二醛溶液或质量浓度为1~4%的京尼平溶液中的至少一种，或，浓度为25~70mg/mL碳化二亚胺溶液和5~25 mg/mL硫代琥珀酰亚胺溶液的混合物。
8.一种骨形态发生蛋白缓释系统，其特征在于：根据权利要求1至7任一项构建方法制备的骨形态发生蛋白缓释系统。
9.一种装载有骨形态发生蛋白缓释系统的构建方法，其特征在于：将权利要求8所述骨形态发生蛋白缓释系统浸泡到含有骨形态发生蛋白的溶液中进行装载；或，将含有骨形态发生蛋白的溶液直接滴加到所述骨形态发生蛋白缓释系统上。
10.一种装载有骨形态发生蛋白缓释系统，其特征在于：根据权利要求9的构建方法制备的装载有骨形态发生蛋白缓释系统。
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Layer-By-Layer Films as a Biomimetic Reservoir for rhBMP-2 Delivery: Controlled Differentiation of Myoblasts to Osteoblasts;Thomas Crouzier等;《Small》;20090312;第5卷(第5期);第598-608页 *
Polydopamine-Assisted Hydroxyapatite and Lactoferrin Multilayer on Titanium for Regulating Bone Balance and Enhancing Antibacterial Property;Tingting Shen等;《ACS Biomater. Sci. Eng.》;20180814;第4卷;第3211-3223页 *
Surface modification of titanium with collagen/hyaluronic acid and bone morphogenetic protein 2/7 heterodimer promotes osteoblastic differentiation;Chengzhong WU等;《Dental Materials Journal》;20201007;第39卷(第6期);第1072-1079页 *

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