CN105190295A - 用于细菌监测的方法和设备 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于检测在宿主分析物内的靶成分例如细菌的系统，其包括具有有序阵列的孔的基底，所述孔的直径能够容纳靶的尺寸。所述基底可以是用宽带光源照射的周期性大孔硅阵列结构(MPSiAS)。对从所述基底衍射的反射光谱进行光学分析，以提供所述孔的有效光学厚度。快速傅立叶变换分析可用于所述光学分析。通过孔的有效光学厚度的变化，检测靶成分进入所述孔。因此，可以检测与下述细菌和病毒一样大的微生物，所述细菌和病毒的尺寸与照射的波长相当。具有靶细胞不可穿透的内部的孔可以补偿环境变化。检测可以实时地进行，从而可以实现生产线细菌监测。

Description

用于细菌监测的方法和设备

技术领域

本发明涉及特别是通过使用光学监测，检测和测量样品中细菌污染的领域。

背景技术

生物传感是工业中的重要领域，特别是在食品工业中，其中，检测和监测生物污染物水平(如食品中的细菌水平)对于维持现代健康标准极为重要。在食品工业中，不断监测从生产线掉落的产品的需要是特别重要和有问题的，因为任何造成产品的生物污染的生产故障必须在产品被装运用于销售之前检测出来。目前，通常通过测试来自各条生产线和批次的样品所生长的培养物来进行检测。但是，由于生长和测试这种培养物所需要的时间，即使使用现代加速培养生长和测量技术，在检测到污染之前，可能已经有大量的产品被生产和包装好以备装运了，从而导致相当大的损失。现有技术例如表面等离子体共振(SPR)可以恒定地监测产品内生物污染物的水平，但这样的技术是昂贵的，通常的安装花费数万美元。由于不同的生产线生产大量不同的产品，这种生物传感技术通常对于食品工业的普遍使用而言过于昂贵，并且似乎不存在可以高成本效益广泛在线监测食品的低成本生物传感设备。

近年来，多孔硅(以下称为PSi)已成为有前景的用于生物传感应用以及用于以纳米级尺寸传感其他靶的纳米材料。常见基于PSi的光学传感器和生物传感器由纳米孔隙(通常尺寸小于20nm)或介孔(通常在20-100nm范围内)的薄膜组成，因此其横截面尺寸比所使用的光波长小得多。通常，这些孔隙在薄膜装置的生产过程中随机地产生。这些传感器的操作基于用靶分析物替换孔隙内的介质和/或用靶分析物渗透，并且观察光学反射率所产生的变化。PSi膜的有效折射率的变化表现为反射谱的波长偏移。只有渗入这些纳米结构的靶分子可以被检测到。事实上，已成功地证明诸如荧光分子、有机磷酸盐、挥发性有机化合物、DNA和蛋白质的多种化学和生物分析物的传感和生物传感。许多这些研究采用反射干涉傅立叶变换光谱法(RIFTS)来监测介孔硅薄膜内的生物相互作用。

这种填充的或部分填充的、且随机定位的孔隙可以被视为简单地具有与未填充的孔隙不同的有效折射率，因为孔隙比光波长小得多。因此，孔隙的随机性质不会导致光散射，而是将来自硅基底与填充的和未填充的孔隙的组合的总反射光平均(averagingout)。然而，这种检测方案不适用于靶向大生物或其他物质(species)，例如其尺寸为约数百纳米至数微米及以上的那些，包括细胞、细菌和病毒。如果产生具有这种较大孔隙的多孔硅，基底成为被称为“黑硅”的材料，其看上去如此，是因为它强烈地散射来自大尺寸孔隙的随机分布的光。基本上所有的入射光都被孔隙随机地散射，并被吸收在介质中，使其不能被用于传感。因此，现有技术的多孔硅技术不能被用于传感或生物传感较大尺寸的靶，所述尺寸是用于传感的光波长的重要部分。

存在替代方法，其不是在其孔隙内，而是在生物传感器表面的顶部直接捕获较大的细胞靶之后即监测反射光谱强度的变化。然而，这些类型的传感器是有局限的，因为反射光谱的强度变化可能有不可预测的来源，例如环境效应和非特异性结合事件。此外，因为这样的表面结合传感器没有利用大的多孔体积，灵敏度可能较低。

近年来，已经尝试开发新的用于快速检测一般细菌、尤其是致病菌的生物测定(bioassay)和生物传感器。然而，尽管在该领域内取得了显著进步，但目前的技术缺乏“实时”或在实验室环境之外检测微生物的能力。

因此，对下述检测方法和设备存在迫切需求，所述检测方法和设备至少克服一些现有技术的系统和方法的缺点，并且特别地，能够执行大生物污染物质水平的连续监测，所述大生物污染物质例如活细胞、致病细菌、孢子和病毒，或者类似尺寸的其他物质，即通常等于或大于可见光的波长的尺寸。

在本说明书的这一部分和其他部分中提到的每种出版物的公开内容在此通过引用以其整体并入本文。

发明内容

本公开描述示例性的新方法和系统，其用于大靶的检测和浓度测量，所述大靶例如细胞、细菌或病毒等形式的微生物，或其他大型特定生物或其他靶。

本公开的方法和系统基于孔隙或微室内的靶成分的捕获，并且可以通过注意它们的下列特性而简要地总结：

(a)这些靶被捕获在尺寸被选择以容纳预期靶的孔隙或微室内，并因此应该至少与靶一样大。此外，微室或孔隙的表面可以被修饰或调整，以提高细胞对孔隙的捕获和附着。例如，孔隙的表面化学、孔隙表面的粗糙度以及其湿润性(疏水性的或亲水性的)可以根据待检测的靶细胞和细菌的特定类型进行调整。

(b)排列孔隙/室的顺序，使得入射到其上的光被散射或反射，但不是随机的，而是形成一组衍射级(asetofdiffractionorders)，例如光栅典型的衍射图案。在这种情况下，背散射光所测量的零级衍射图案允许直接传感所述孔隙/微室的有效光学厚度(EOT)。因此，预期衍射光的零级显示出干涉图案，其由孔隙的EOT确定。可以调整孔隙的深度，以允许EOT的灵敏检测。

(c)通过使用孔隙中的介质的折射率的变化来指示孔隙内的靶细胞的存在，从而实现传感。所述介质通常是用于维持靶细胞的液体或缓冲液，并且其折射率的变化改变进入孔隙并从孔隙反射的光的EOT。

(d)一种特定的但并非唯一的方法，尤其是在EOT大于光的光波长(EOT>λ)的时候特别可用的检测EOT的方法，是使用快速傅立叶变换分析，由此，反射光的光谱进行傅立叶变换，以获得单一的强度峰，其位置表征所述EOT。

(e)用于实现上述设备和方法的特别方便的设置(arrangement)采用二维周期性大孔硅阵列结构(MPSiAS)。多种制备技术可以被用于制备这样的MPSiAS基质，例如电化学方法或采用反应离子蚀刻(RIE)的干法蚀刻法。然而，应当理解的是，这些方法和结构可以被其他材料和平台应用，例如其他半导体、有机聚合物、凝胶、玻璃，甚至金属表面。

现在，考虑上述特征的更多细节。由于靶的尺寸等于或大于常用光源(包括紫外、可见光和近红外光谱范围)的波长，不能使用孔径大到足以容纳这些靶的现有技术的PSi基底，因为，如前所述，由于大尺寸分布和孔隙的随机位置，含有这种大孔隙的无序装配的基底上的入射光照射将导致随机散射光。在本公开的设备和方法中，使用孔隙或微结构的二维(2D)有序阵列，在垂直于孔隙平面的方向照射。该结构克服了在尺寸大于用于测量的光的波长的孔隙上光学测量中的现有技术的问题。这种结构是有效的层状相光栅，并且能够以2D周期性大孔硅阵列结构(MPSiAS)的形式来方便地实现，其孔径被配置来适应靶的尺寸。例如，如果待捕获的细菌细胞的典型尺寸是在0.5-2μm范围内，这些孔隙或微室的尺寸可以被制备成在1-10μm的范围内，以容纳那些细胞。然后，这些结构被用作检测诸如细菌细胞的靶的光学传感平台(opticalsensingplatform)。可以通过以下方法来制备PSi光子晶体的这种周期性结构，其孔径尺寸与细菌细胞的尺寸相当：通过光刻法以及其后的电化学阳极氧化过程(使用氢氟酸基溶液)或者诸如反应离子蚀刻(RIE)的干法蚀刻技术，来将孔隙的图案蚀刻入标准的市售的硅晶片(siliconwafer)。这两种方法在半导体工业中均是公知的，并且与标准的硅处理技术兼容。所得的PSi结构作为层状光栅或相光栅，根据由物理光学确定的光栅周期与光波长之间的严格关系，其将反射光以不同的角度散射为一组衍射级(asetofdiffractionorders)。如果与孔隙表面垂直采集所述反射光，只对零级衍射进行测定。这通常通过使用具有适当的f数的光学透镜以及用于传送入射光并采集背散射的零级反射光的光纤来实现。在这种情况下，只有与孔隙深度相关联的相位延迟有助于由背散射光所产生的干涉图案。这种干涉图案被用于所述孔隙的有效光学厚度(EOT)的测量。

在孔隙内的靶细胞的存在改变孔隙内的介质的折射率，从而改变层状光栅内的孔隙的有效光学厚度(EOT)。填充有靶细胞的介孔的百分比越大，EOT的变化就越大。因此，EOT的测量使得能够发现宿主溶液内的靶细胞的浓度。通过用宽带光源照射MPSiAS层，可以实时进行层状光栅的EOT的测量。待测波长范围内的反射光光谱是来自MPSiAS的顶面的反射以及来自穿过孔隙并且从它们的底部表面反射的光的复杂组合。可以用于测量反射光谱的一种方便的方法是对该光谱进行快速傅立叶变换(FFT)分析，通过它获得单一强度峰，其位置表征了所述层的有效EOT。然而，应当理解，可以使用任何其他光谱分析法，或直接光路差方法。这提供了被靶细胞填充的孔隙的百分比的测量(有时称为孔隙的“填充因子”)。因此，当孔隙内的宿主分析物被待测的靶细胞替换时，由于孔内的光学介质的折射率的变化，EOT也发生变化，因此FFT分析的输出峰的位置也发生改变。峰的位置偏移越多，孔隙内的靶细胞的浓度越高。由于光学测量基本上可以即时地执行，因此这些装置给宿主溶液内的靶细胞浓度提供有效的实时测量，唯一的延迟是用宿主溶液的靶细胞来有效地填充有序的孔隙结构的时间。此外，由于PSi阵列结构可以通过常规的半导体技术容易地制备，可以以低成本大批量生产阵列芯片。此外，所述光学测量系统也容易以微型光谱仪的形式得到，使得监测系统的成本相比目前使用的用于检测生物污染的现有技术系统可以大量减少，也许减少两个数量级。

为了抵御环境变化的作用(即使没有孔隙结构含量上的任何变化，其也将导致EOT的偏移)，可以使用双孔结构，其中孔的内端的横截面，其是远离暴露于宿主溶液的表面的这一端，小于孔的外部的横截面尺寸。在这种情况下，靶细胞可以被捕获在外部，但不能穿过所述孔的较窄的内部。然而，宿主溶液不穿过所述内部，并且不论宿主溶液内是否存在捕获的靶细胞而测量宿主溶液。对于这样的双孔结构，检测到三个与有效光路差关联的FFT峰，其来自于(i)从基底的表面到内部的底部；(ii)从所述表面到所述外部的底部；以及(iii)内部和外部的底部之间。由于靶细胞浓度是通过EOT(i)和EOT(ii)相对于EOT(iii)的改变而测定的，当环境变化同等地改变所有这三个EOT至第一级时，与孔的内部相关联的峰EOT(iii)可以被用作补偿环境变化的基线标记，特别是环境温度的变化。此外，通过使用合适的选择性涂层，所述内部可以用于检测捕获在孔的外部的靶细胞的分泌物。

上文描述的装置和方法使得能够确定在MPSiAS的孔中捕获的靶成分的存在，并定量估计它们在宿主分析物中的比较水平。尽管对于靶身份是唯一的某些应用而言这可能是足够的信息，然而，在许多具有多个不同的靶成分的应用中，这些靶成分全部具有与靶成分的尺寸相似或者更小的尺寸，这可以使它们能够被捕获在孔里，使得进行的光学分析不提供特定靶识别的信息。因此，例如，在打算用于确定诸如某些大肠杆菌(E.coli)菌株的细菌病原体的存在的系统中，分析物中其他细菌(其也可能被捕获在装置的孔隙内)的存在将对于确定大肠杆菌的水平的测量造成问题。因此，为了执行这样的具体测定，可能有必要提供某种形式的识别机制，以便特异地捕获打算检测和测量的靶微生物，从而提供装置的选择性水平。因此，例如，可以处理孔壁的表面化学，以提供用于捕获期望用所述装置测量的微生物的捕获探针。然后，它们保持被捕获的状态，而其他细菌和细胞则不会。通过涂覆对靶微生物具有高亲和力的特异性抗体或适体或其他肽类来获得所需的效果。然后，可能需要仿生机构来确保孔内的捕获探针的定向，使它们捕获进来的细菌或其他细胞或生物体。对于待检测和测量的微生物，所使用的识别部分通常将是特异性的。因此，可以提供一定范围的不同的检测装置，每个检测装置都用适合于其期望测量的微生物的识别部分来处理。原则上，在本公开中所描述的生物传感器可含有多个2D-MPSiAS甚至2D-MPSiAS的阵列(每一个可以是几百微米乘以几百微米，高达几毫米乘以几毫米)。这些MPSiAS中的每一个可以被官能化，以选择性地检测不同类型的微生物，从而可以通过这种传感器来完成多级细菌识别。

本公开的MPSiAS装置还可用于执行确定微生物活力的方法，即区分活细胞和死细胞。因此，如果所述装置被用于捕获特定类型的细菌细胞，引入生长培养基将导致活菌数的倍增。由于孔隙的有效折射率增大，这将反映在EOT信号位置的偏移上。

尽管在本公开中的阵列已经被描述为在硅中形成，用这种通用和方便的材料可以形成阵列，但应当理解的是，使用硅基底并不意味着以任何方式限制本发明，并且本发明可以使用其他材料，例如玻璃或塑料基底，以及那些不同于在本公开中描述的制造技术来实现。然而，硅的一个可能的优点是将其他电子装置和电路与MPSiAS传感器整合到相同的芯片上的能力；例如用于遥感应用的无线通信能力。

此外，尽管本公开的方法和结构通常被描述为适用于检测尺寸等同于或者稍微大于用于检测的光的波长的量级的生物靶的检测，但应当理解的是，这些方法和结构并不意在限于这些生物靶，而是应当理解为适用于检测任何类型的合适尺寸的靶，无论是生物类的还是非生物类的。这样的其他应用可以是在水技术、环境污染测量、化学工业以及其他领域中。

此外，由于具有波长范围的白光光源或宽带光源应当用于本公开所描述的设备内且执行本申请的方法，并且这些光源的波长可以远远延伸超出在其中进行光谱检测的区域，应当理解，无论是在本公开中还是权利要求书所主张的，用于进行检测的光或照射的波长应理解为其中主要的能源被浓缩的波长，例如峰强度点的波长，或者含有光强度的大部分的光谱区的平均波长，或者检测器的最大灵敏度的波长，或类似的定义。在任何情况下，术语入射照射的波长以及具有类似含义的表述并不旨在包括基于光源的发射光谱的极端的波长的限制，其中检测效率或照射水平低得不切实际。

此外，靶成分所进入且被其捕获且其有效光学深度被测量的阱(trap)，在本公开中被不同地描述为孔隙、微室和孔(well)，所有这些被理解为是指相同的特征。术语“孔”在权利要求书中被用作表示这些特征的简单的通用术语。

因此，根据在本公开中描述的装置的示例性实施，提供用于检测在宿主分析物中的靶成分的系统，所述系统包括：

(i)含有在其表面形成的有序阵列的孔的基底，至少一些所述孔的横向尺寸使得靶成分能够容纳(fit)在其中，

(ii)宽带照射源，其发射一定范围的波长，并被设置以照射所述基底的表面，

(iii)光学检测器，其被设置以使其采集从基底衍射的光，并输出反射光谱信号，以及

(iv)信号处理单元，其适用于分析反射光谱信号，以提供所述孔的有效光学深度的量度，

其中至少一些所述孔的横向尺寸与光学检测器检测到的照射源的波长至少一样大。

在这样的系统中，信号处理单元可以使用快速傅立叶变换来分析反射光谱信号。在这种情况下，根据对反射光谱的快速傅立叶变换分析的结果所得到的峰的位置来确定有效光学深度。此外，可设置光学检测器以与基底垂直，从而其采集来自基底的零级的衍射光。

此外，在上述系统的替代的实施方式中，所述孔的有效光学深度可以提供捕获在孔的阵列之内的靶成分的浓度的指征，进而还提供分析物内的靶成分的浓度的指征。

在任何上述系统中，有序阵列的孔可以包括层状光子晶体光栅。此外，所述基底可以是硅芯片，并且有序阵列的孔可以通过微电子制作工艺制备。

另外的实施方式可以涉及例如先前所描述的那些系统，在其中靶成分是尺寸大于被光学检测器元件检测到的照射源的波长的细菌细胞。所述孔可包括捕获探针，所述捕获探针对于期望由所述系统测量的靶细胞具有高亲和性。这样的捕获探针可以被涂覆在孔的壁上。作为具体实例，靶成分可以是微生物，并且所述捕获探针可以是抗体、适体或其他肽类中的任何一种。这些微生物可以是细菌细胞，并且捕获探针可以是特异性抗体。此外，所述孔可以结合细胞的营养供应，使得在供给营养供应之后能够观察到微生物的生长。然后，供给营养供应后微生物缺乏生长可以被用作微生物一般是死亡的指征。此外，在任何这些系统中，至少一些孔可以包括适合于待检测的靶成分的识别部分。如果是这样，则基底可以包括至少两个不同的区域，在每个区域内的孔包括不同的识别部分，使得每个不同区域能够同时检测不同的靶成分。

通常，任何上述系统可适合于提供微生物的实时检测。

另一示例性的实施方式可以涉及例如任何前面描述的那些系统，其中至少一些孔具有至少两个具有不同横向尺寸的连续部分，并且其中比第一部分远离所述表面的第二部分的横向尺寸小于所述第一部分的横向尺寸。在这样的构造中，第二部分的尺寸可以使得靶成分不能穿透第二部分，而宿主分析物能够穿透所述第二部分。在这种情况下，至少一些孔的第二部分的测得的有效光学深度的变化可以被用作标记以补偿环境条件的变化，所述环境条件的变化引起第一部分和第二部分的有效光学深度的变化。第二部分可以对捕获在第一部分内的靶可能分泌的物质具有敏感性。在这种情况下，敏感性可被用来提供关于捕获在孔的第一部分内的靶水平的其他信息。

另一种实施方式执行检测宿主分析物中的靶成分的方法，所述方法包括：

(i)提供含有在其表面形成的有序阵列的孔的基底，

(ii)用宽带照射照射所述基底的表面，

(iii)检测从基底衍射的光，并从中产生反射光谱信号，并且

(iv)根据反射光谱信号，确定所述孔的有效光学深度的量度，

其中至少一些孔的横向尺寸大于被检测的宽带照射的波长。

在这种方法中，根据反射光谱信号确定所述孔的有效光学深度的量度的步骤可以通过快速傅立叶变换分析进行。在任何情况下，检测可以与基底垂直进行，使得从基底衍射的零级光被检测到。所述靶成分可以是细菌，并且所述宿主分析物可以是水、缓冲液、血液、尿液或者食品加工过程中得到的溶液中的任意一种。

在该方法的一些实施方式中，至少一些孔可以具有至少两个具有不同横向尺寸的连续部分，并且比第一部分远离所述表面的第二部分的横向尺寸应该小于第一部分的横向尺寸。在这种方法中，第二部分的尺寸可以使得靶成分不能够穿透第二部分，而宿主分析物能够穿透所述第二部分。任何这样的方法还可以包括检测至少一些孔的第二部分的有效光学深度的变化的步骤，从而可以补偿环境条件的变化，所述环境条件的变化引起第一部分和第二部分的有效光学深度的变化。

附图说明

结合附图，通过下面的详细描述，将更全面地理解和评价本发明，在附图中：

图1A和1B显示本公开中描述的类型的二维周期性大孔硅阵列结构(MPSiAS)的SEM显微照片图；

图1C示意性地显示使用如本申请中所公开的检测微生物的结构的示例性系统；

图1D是显示用于确定在图1C的系统中的靶浓度的光输出的示例图；

图1E示意性地说明使用电化学蚀刻法制备图1A中所示的类型的装置的制备步骤；

图2示意性地说明采用图1A或1B所示的类型的MPSiAS而构成的细菌监测系统；

图3显示采用例如图2所示的系统输出大肠杆菌K12(E.coliK12)水平的典型实时检测的实施例；

图4A至图4C示意性地说明模型，通过该模型用细菌物质填充MPSiAS的孔隙通过用该系统进行的有效光学厚度测量的变化来反映；

图5显示不同传感实验的一些测量ΔEOT值以及相应的用图4A至图4C的模型计算得到的填充率；并且

图6A示意性地说明替代性的MPSiAS几何形状，其具有具两个不同横截面的孔隙，并且图6B显示随之发生的从这种阵列反射的光的FTT输出图。

发明详述

下面参考图1A，其说明示例性二维周期性大孔硅阵列结构(MPSiAS)的横截面SEM显微照片图，在插图中显示了顶视图，所述示例性二维周期性大孔硅阵列结构(MPSiAS)的孔径适于配合靶细菌细胞的尺寸。在图1A中所示的是光刻后通过电化学蚀刻制备而成的阵列的结构。为了描述本公开的系统和方法，在此详细描述中所使用的非限制性的实例具有带有孔隙的基底结构，所述孔隙的尺寸适合于检测大肠杆菌K-12细菌-其直径为0.8-2μm。图1A所示结构的周期是约3μm。图1B显示出用干法蚀刻作为替代的制备技术所制备的MPSiAS的实例的平面以及横截面SEM显微照片图。在本实施例中，所述结构的周期是约3μm。

现在参考图1C，其示意性地说明MPSiAS基底10的孔12的有序阵列如何作为层状光栅(或相光栅)，其根据光栅的周期与光波长之间的关系，将落在所述结构上的入射光11以不同的角度反射成一组衍射级。对于垂直于阵列表面采集到的光，只测量了零级衍射，即θ＝0的背散射光，其中θ是衍射角，得到下面的零级反射光的强度I的表达式：

$I(\mathrm{\θ}=0)=I_0{\cos }^2({\mathrm{\ψ}}_0/2)---\left(1\right)$

其中

$2{\mathrm{\ψ}}_0=2kL=\frac{2\mathrm{\π}}{\mathrm{\λ}}\left(2n_{0}L\right)---\left(2\right)$

并且ψ0是入射和反射光束之间的相位延迟，λ是自由空间光波长，k是波数，L是孔隙的深度，n₀是填充孔隙的介质的折射率，因此术语2n₀L是所述装置的顶面与所述孔的底面之间的光程差，其被称为层状光栅的有效光学厚度(EOT)。通过使用具有相当深的孔的相光栅，其通常是光波长的几倍到几十倍的量级，可以得到从光栅结构的顶部反射的光与从孔的底部反射的光之间的干涉图案，类似于从法布里-珀罗干涉(FabryPerotinterference)所获得的光谱响应。

为了在装载分析物溶液的时候监测所述装置的EOT，进行来自MPSiAS层的反射光谱的快速傅立叶变换(FFT)，得到特征单峰，其位置指示EOT，如以任意单位表示的反射强度I随以nm计的光路差变化的图1D的示例图中所示。在图1D所示的实施例中，看到光程差在15μm的量级。一旦细菌渗透入大孔中，即完成传感，其诱导可以通过RIFTS分析实时监测和定量的EOT中的可测量的变化。所述峰的强度与大孔阵列上方的细菌浓度有关。

现在参考图1E，其显示电化学阳极化之后使用光刻制备MPSiAS样品的一种示例性方法的制备链。按照传统的半导体加工，SiO₂层13通过热氧化形成于多孔硅晶片10的顶面上，然后通常通过电子束或全息光刻形成的光致抗蚀剂层14和掩模，以定义所期望的2-D孔隙或孔结构图案。然后，将未曝光的光致抗蚀剂除去，以暴露蚀刻图案15，接着通过光刻氧化物掩模进行碱性蚀刻，以便在硅晶片顶部生成倒金字塔槽16的二维图案。这些倒金字塔被用作形成具有所需的轮廓和深度的孔隙或孔结构的初始开口。电化学蚀刻工艺17可有利地被用于此，在黑暗的条件下进行，使用氢氟酸(HF)和二甲基甲酰胺(DMF)的溶液，以恒定的电流密度，典型地为30mA/cm²的量级，用于这种类型的基底和孔尺寸。对于大肠杆菌检测的当前实施例，可以使用周期为2.5μm-4μm并且深度的范围在2.5-7.5μm的结构，以便允许阵列内的细菌细胞的便捷捕获。在通常可能在黑暗条件下进行的阳极化之后，采用HF(49％)和DMF(1:7体积/体积)的电解质溶液，在30mA/cm²的恒定电流密度下125s，任选在H₂O:NH₃:H₂O₂比例为5:1:1的溶液中将所得的刚处理的PSi进行化学氧化，以制备亲水性多孔SiO₂基质。然后，可以修饰氧化的MPSiAS样品，以便用特异性或非特异性化学将所述多孔表面官能化，以便靶向感兴趣的微生物，例如，通过使带正电荷的基团的表面官能化，例如，通过使用2-氨基丙基三乙氧基硅烷(在甲苯中稀释的2％APTES)。由于大多数细菌携带净负表面电荷，在带正电的表面上促进大肠杆菌的附着。

现在参考图2，其示意性地说明构造以实施上文描述的方法的示例性细菌监测系统。显示的MPSiAS20安装在传感器单元的取样室21内，其具有通过O形环23密封在壳体上的诸如有机玻璃的透明盖22，以便将分析物宿主液体保持在采样室内。待测试的样品液体流过采样室，如图2中的箭头24所示。宽带光源，在图2中显示为钨灯25，可以通过光纤进料(优选分叉光纤探针26)被投射到采样室内，并且从硅芯片反射的光可以由相同的光纤探针采集。现在分析这种反射光的光谱，在图2所示的示例性系统中，其通过诸如购自OceanOpticsInc.ofDunedin,FL,USA的OceanOpticsUSB4000的迷你分光计27来执行，然后，方便地通过市售的软件，例如购自WavemetricsInc,ofPortlandOR,USA的IgorPro,v.6.03，进行干涉仪的反射光谱28的FFT分析。在图2所示的监测系统中，输出29显示为显示的EOT相对于时间所绘制的连续图，EOT的水平的变化指示由所述系统检测到的靶细菌细胞的水平的变化。但是，可以配置处理系统，以使其提供细菌浓度的直接读数。这需要事先校准运行，其中，由系统测得的细菌浓度用另一种直接观察法来核对，例如使用共聚焦激光扫描显微镜。

现在参考图3，其显示大肠杆菌K12水平的典型实时检测的输出的实例，使用如在图2中所描述的系统。图3的顶部图显示随着经过的时间而测得的EOT的值，而底部图显示反射强度相对于时间绘制的图。每隔15秒记录输出数据。在这些图中，将引入大肠杆菌细菌之前和之后的FFT光谱的变化相对于时间绘图。一旦细菌细胞被捕获在所述孔隙内，通过测量EOT的变化以及传感器的强度可以完成传感。在上图中，在右手侧纵坐标上显示测得的孔隙的EOT相对于时间绘图。左手侧纵坐标显示变化，即测量的ΔEOT。这些图显示0.1ml/min的0.85％w/v的NaCl盐水溶液的恒定流量的初始基线图。在47分钟的时间点，10⁶细胞/mL的大肠杆菌K12在盐水中的细菌悬浮液被输送到检测器系统。观察到约45纳米的EOT的快速增加。此EOT变化归因于孔隙内的细菌的捕获，其导致折射率的增加。与此同时，在图3的下图里，反射强度相对于时间绘图，并且，如所观察到的，反射强度降低约3％，这可能是由于细菌细胞引起的光散射。光学研究证明大肠杆菌的检测极限量级是10⁵细胞/mL。

图3的插图显示EOT偏移本身的时间缩放图，以显示可以检测细菌水平的速度。如所观察到的，对于该特定的MPSiAS，细菌填充所述孔隙所产生的全部45nm的EOT偏移在不到1分钟内发生，这意味着可以在这段时间之内提供细菌污染物的存在的指示，从而说明在在线实时监测中所述装置的有效性。因此，反射光的零级衍射显示根据孔隙内累积的相的光谱干涉图案，其允许实时检测细菌捕获。

现在参考图4的三个部分，其示意性地说明显示下述方式的模型：MPSiAS孔隙被细菌或其他大细胞物质填充由所述系统执行的有效光学深度测量的变化来反映。

所述模型试图将传感器的光学读数(即EOT偏移)与例如通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)技术的直接显微研究确定的孔隙的填充因子所表示的细菌浓度相关联。通过CLSM数据的图像分析，可以量化被细菌占据的孔隙的相对数目，这个值被称为MPSiAS的“填充率”。在图4的线(A)中，显示MPSiAS的示意图，其具有含有捕获细菌40的一些孔隙。在图4的线(B)中，部分填充且部分空白的孔被厚度为且折射率为n的有效连续层代替，其中小于细菌的平均长度h，因为只有一些孔隙被填充。图4的线(C)显示用于模拟传感实验的数学模型的示图。因此，对于给定的EOT偏移，所述模型预测相应的填充率。细菌的折射率(n)和宿主盐溶液的折射率(n₀)分别为1.4和1.33，因此，模型中的唯一的自由参数是填充孔隙的有效厚度或等价的“有效填充因子”(eff)。这可以被定义为：

$\mathrm{eff}={(l/L)}^2---\left(3\right)$

其中L是孔隙深度，并且因为阵列是二维阵列而有所述平方关系。该量可从图4的线(B)显示的模型来估计，其是：

$eff=\frac{\mathrm{\Δ}EOT/EOT}{\mathrm{\Δ}n/n_0}---\left(4\right)$

其中Δ(EOT)/EOT是在传感实验期间测量的EOT的相对变化，并且Δn＝n-n₀是由于细菌捕获引起的折射率的绝对值的变化。MPSiAS的填充率可以直接与有效填充因子关联，如下所示：

填充率＝eff·(体积_孔隙/体积_大肠杆菌)(5)

现在参考图5，其是显示不同的传感实验测得的一些ΔEOT值以及通过图4的模型计算的对应的填充率的表格。图5显示MPSiAS传感器的填充率值，特征在于2.5μm和4μm的不同周期。所述值是通过平均在每个传感器的不同位置采集到的至少5幅图像而计算得到的。如从图5所观察到的，具有高周期(即，较大孔隙)的结构表现出较大的EOT偏移，对应于优异的细菌捕获。所述模型的结果与由CLSM技术估计的填充率相当一致，这表明即使模型是近似的(approximations)，单它提供了传感事件的合理描述。例如，对于样品1，所述模型预测填充率为约25％，而CLSM数据得到约21％的填充率值。所述填充率值之间的偏差主要归因于模型的假设。首先，在模型中，细菌作为均匀液体填充孔隙。这种假设将细胞的复杂结构及其异质性过于简单化了。第二，由于垂直于孔隙的表面采集反射光，只测量了零级衍射的强度。因此，由于MPSiAS的典型孔隙形貌(参照图1A)，所述模型将孔隙的开口的约25％的直径视为有效相干反射面(effectivecoherentreflectivesurface)，其被用于计算有效孔体积以及因此得到的填充率。另一个偏差的原因可能在于由于在实验传感设备以及CLSM中采集的光学数据的光斑大小的差异。在传感设备中，从单点测定EOT信号(典型直径为1mm)，而CLSM测量值是根据传感器表面的五个不同区域而平均的。

从C.Pacholski等人的美国专利申请公开US2007/0108465，“PorousMicrostructureMulti-LayerSpectroscopyandBiosensing”中已知，常规多孔硅薄膜结构可以构造为配备具有两个不同横截面的孔隙，外部或上部具有较大的平均直径(圆筒形孔隙分布)，且内部或下部具有较窄的平均直径。在这项申请中，上部的孔径限制为20-50nm，如根据现有技术的随机多孔硅装置所预期的，而下部的孔径的量级为<20nm。因此，这些孔隙无法测量较大的微生物，如本公开所述。在Pacholski申请中，所述结构由两层PSi组成，每一层具有孔隙分布，所述孔隙具有不同的和随机的直径，下层比上层具有更小的平均直径。

现在参考图6A，其说明上文在图1A至5中所述的那些结构的替代性MPSiAS结构，其具有两部分的孔隙结构。对比于Pacholski所示的内容，图6A的实施方式显示单个层状光栅结构60，其具有单一的周期，但其中光栅的每个周期由两个部分组成。上部较宽，并具有直径d₁和长度l₁，而下部较窄，具有直径d₂和长度l₂。如果靶细胞的直径表示为D，则这两个部分的孔径应遵循以下条件：

d₂<D<d₁

在这种情况下，靶细胞61能够渗透进孔隙的上部，并且能够在那里被捕获，但不能够渗入孔隙的下部。但是，宿主溶液可以流入所述孔隙的两个部分，如图6A所示意性说明的那样。

当由白光宽带光源照射时，发生从光栅到一组衍射级的反射，这也是按照周期p和光波长之间的关系。和之前一样，只通过光学采集零级反射，但是由两部分的孔隙获得更复杂的干涉图案。现在参考图6B，其是FTT空间内的反射光的强度相对于光程差EOT绘制得到的图。显示三个峰，其被标记为：

(i)2·n₀·l₁(每个孔隙的部分1的EOT)

(ii)2·n₀·l₂(每个孔隙的部分2的EOT)，以及

(iii)2·n₀·(l₁+l₂)(包括孔径的两部分的总长度的EOT)，

其中n₀是宿主分析物溶液的折射率。

然而，这些峰的表现不同于在Pacholski中所述的那些，因为物理机制是不同的，其直接基于宿主溶液(具有折射率n₀)以及靶细胞(具有折射率n)的光学厚度和折射率。另一方面，在Pacholski结构中，所述层的有效光学厚度(EOT)和有效折射率基于溶液/靶分子的折射率与多孔介质的折射率的复合平均(complexaveraging)。因此，本申请的两部分MPSiAS允许宿主溶液(在较低的部分，下标为2，如图6A中所示)以及靶细胞(在较高的部分，下标为1，如图6A中所示)的光学厚度的直接传感，而在Pacholski结构中，EOT测量更复杂的函数，其涉及宿主/靶以及它们包埋于其中的多孔介质的特性的复合平均(complicatedaveraging)。

在本申请的两部分MPSiAS中，如果孔隙的两个部分都填充有宿主分析物溶液，则环境条件的任何变化导致所有三个峰按比例移动，至少在第一级中，维持它们之间的相同比例。

然而，如果现在具有折射率n的细菌细胞进入孔隙的顶部1，假设n>n₀，依赖于l₁的峰(ii)和峰(iii)将偏移到右边较大的EOT值。因此，峰(ii)移动到位置2nl₁，并且峰(iii)移动到位置2(nl₁+n₀l₂)。将(n-n₀)的值表示为Δn，峰(ii)和(iii)各自移动的距离为2Δnl₁。

在另一方面，仅仅依赖于l₂的峰(i)不偏移，因为在没有靶成分进入时，其光路长度l₂没有发生变化。因此，不受靶细胞捕获影响的第一峰2·n₀·l₂与其他两个峰之间的距离是已经被装置的孔隙捕获的细菌(或靶)细胞的数目的量度，与以相似的方式影响所述峰的环境变化无关。捕获的靶成分的数目越大，峰(ii)和峰(iii)的右移就越多。此外，第二峰和第三峰之间的距离可以被用作消除信号随机波动的参考，其可能会导致“假警报”的事件。当然，如果n<n₀，则峰移将会朝向较短的EOT水平。

通过测量第一峰(i)与其他两个峰(ii)和(iii)之间的相对偏移，此阵列配置使得可以消除环境变化对于细菌浓度的测量的影响，由此，由于下部的峰的偏移与由于上部或上部和下部的峰之间的偏移被用作环境标记(environmentalmarker)。

如果所述孔隙的下窄部具有对于捕获在孔隙的上宽部的微生物可能分泌的物质的靶选择性，可以实现这种双横截面的孔隙的额外的和新颖的优点。随后，这样的实施通过捕获在装置内的微生物的存在乃至数量提供进一步确认水平。因此，例如，所述孔隙的下窄部可以含有捕获物质(trappingmaterial)，其用于与捕获在上部的细菌可能分泌的蛋白质或毒素结合。这些物质的选择性捕获将导致所述孔隙的窄部的折射率变化，其将反映在孔隙的窄部的EOT特性的进一步变化上，从而提供在孔隙的上宽部内的特定细菌的存在的第二量度。例如，产生志贺毒素的大肠杆菌生物(STEC)是能够导致散发性和流行性腹泻、出血性大肠炎以及有可能威胁生命的溶血尿毒综合征的病原体。STEC具有若干毒力因子，并且产生志贺毒素(Stx1和/或Stx2)是最关键的。即使在实验室环境下，及时地检测和识别非O157：H7STEC血清型更加困难。因此，通过使用双横截面的孔隙结构以及用志贺毒素受体(聚糖的抗体)进行的窄孔隙的适当的表面改性，可以区分STEC与非STEC。

本领域技术人员理解，本发明不限于上文已经具体显示和描述的内容。相反，本发明的范围包括上文所述的多种特征的组合与亚组合，以及本领域技术人员阅读了上面的描述之后可能想到的不在现有技术内的它们的变型和修改。

Claims (30)

1.用于检测在宿主分析物中的靶成分的系统，所述系统包括：

含有在其表面形成的有序阵列的孔的基底，至少一些所述孔的横向尺寸使得所述靶成分能够容纳在其中；

宽带照射源，其发射一定范围的波长，并被设置以照射所述基底的所述表面；

光学检测器，其被设置以使其采集从所述基底衍射的照射，并输出反射光谱信号；以及

信号处理单元，其适用于分析所述反射光谱信号，以提供所述孔的有效光学深度的量度，

其中至少一些所述孔的横向尺寸与所述光学检测器检测到的所述照射源的波长至少一样大。

2.根据权利要求1所述的系统，其中所述信号处理单元采用快速傅立叶变换分析所述反射光谱信号。

3.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中设置所述光学检测器以与所述基底垂直，使得其采集来自所述基底的零级的衍射光。

4.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述孔的所述有效光学深度提供在所述孔的阵列内捕获的所述靶成分的浓度的指征。

5.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述孔的所述有效光学深度提供所述分析物内的所述靶成分的浓度的指征。

6.根据权利要求2所述的系统，其中所述有效光学深度根据对所述反射光谱的快速傅立叶变换分析的结果所得到的峰的位置而确定。

7.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述有序阵列的孔包括层状光子晶体光栅。

8.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述基底是硅芯片，并且所述有序阵列的孔通过微电子制作工艺制备。

9.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述靶成分是细菌细胞，所述细菌细胞的尺寸大于所述光学检测器元件检测到的所述照射源的波长。

10.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述孔包括捕获探针，所述捕获探针对于期望由所述系统测量的靶细胞具有高亲和性。

11.根据权利要求10所述的系统，其中所述捕获探针被涂覆在所述孔的壁上。

12.根据权利要求10所述的系统，其中所述靶成分是微生物，并且所述捕获探针是抗体、适体或其他肽类中的任一种。

13.根据权利要求12所述的系统，其中所述微生物是细菌细胞，并且所述捕获探针是特异性抗体。

14.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中所述系统适合于提供微生物的实时检测。

15.根据权利要求10所述的系统，其还包括细胞营养供应，从而在施加所述营养供应之后能够观察到所述微生物的生长。

16.根据权利要求15所述的系统，其中施加所述营养供应之后所述微生物缺乏生长表明微生物一般是死亡的。

17.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中至少一些所述孔包括适合于待检测的所述靶成分的识别部分。

18.根据权利要求17所述的系统，其中所述基底包括至少两个不同的区域，在每个所述区域内的孔包括不同的识别部分，从而每个不同的所述区域能够同时检测不同的靶成分。

19.根据前述权利要求中任一项所述的系统，其中至少一些所述孔具有至少两个具有不同横向尺寸的连续部分，并且其中比第一部分远离所述表面的第二部分的横向尺寸小于所述第一部分的横向尺寸。

20.根据权利要求19所述的系统，其中所述第二部分的尺寸使得所述靶成分不能穿透所述第二部分，而所述宿主分析物能够穿透所述第二部分。

21.根据权利要求19和20中任一项所述的系统，其中至少一些孔的所述第二部分的所述测得的有效光学深度的变化被用作标记以补偿环境条件的变化，所述环境条件的变化引起所述第一部分和所述第二部分的所述有效光学深度的变化。

22.根据权利要求19和20中任一项所述的系统，其中所述第二部分对捕获在所述第一部分内的靶可能分泌的物质具有敏感性。

23.根据权利要求22所述的系统，其中所述敏感性用来提供关于捕获在所述孔的所述第一部分内的靶水平的其他信息。

24.用于检测宿主分析物中的靶成分的方法，所述方法包括：

提供含有在其表面形成的有序阵列的孔的基底，至少一些所述孔的横向尺寸使得所述靶成分能够容纳在其中；

用宽带照射在一定范围的波长下照射所述基底的所述表面；

检测从所述基底衍射的照射，并从中产生反射光谱信号；并且

根据所述反射光谱信号，确定所述孔的有效光学深度的量度，其中至少一些所述孔的横向尺寸大于所述检测照射的波长。

25.根据权利要求24所述的方法，其中从所述反射光谱信号确定所述孔的有效光学深度的量度的步骤通过快速傅立叶变换分析来进行。

26.根据权利要求24和25中任一项所述的方法，其中所述检测可以与所述基底垂直进行，从而检测从所述基底衍射的零级光。

27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述靶成分是细菌，并且所述宿主分析物是水、缓冲液、血液、尿液或者食品加工过程中得到的溶液中的任意一种。

28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中至少一些所述孔具有至少两个具有不同横向尺寸的连续部分，并且其中，比第一部分远离所述表面的第二部分的横向尺寸小于所述第一部分的横向尺寸。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第二部分的尺寸使得所述靶成分不能穿透所述第二部分，而所述宿主分析物能够穿透所述第二部分。

30.根据权利要求28和29中任一项所述的方法，其还包括检测至少一些所述孔的所述第二部分的有效光学深度的变化的步骤，从而可以补偿环境条件的变化，所述环境条件的变化引起所述第一部分和所述第二部分的所述有效光学深度的变化。