CN105188786A - 微粒及内皮细胞和脱细胞化的器官和组织的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供在具有完整的细胞外基质血管网络的再内皮化的脱细胞化的器官或组织移植物中维持毛细血管腔直径、降低毛细血管腔直径的减小或增加毛细血管腔直径的方法。所述方法基于向脱细胞化的ECM施用内皮细胞和微粒。

Description

微粒及内皮细胞和脱细胞化的器官和组织的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2013年3月15日提交的美国申请序列号61/790,118的权益，将其公开内容以引用的方式并入本文。

发明背景

组织工程是通过植入细胞、支架以及可溶性介质的组合来寻求修复或再生损伤或病变的组织和器官的快速发展的领域。通常在2维(2D)培养条件下实现当前干细胞分化和原代细胞培养。该系统允许特定细胞群的扩增，但是其维持功能性细胞表型以维持高密度的细胞培养以及长期原代或分化的细胞功能的能力有限制。例如，相比某些细胞疗法所需的大量原代细胞的有限可获得性，在保留分化为特定谱系的能力的同时，干细胞的数量可以大量扩增。对于干细胞命运的控制(例如分化)，不管是在体内还是在体外，主要都归因于基因和分子介质(例如生长因子和转录因子)。尽管干细胞和祖细胞的分化可导致细胞具有合适的谱系特异的基因表达或组织特异的基因表达，但是分化的细胞可能缺乏体外或体内应用所需的功能特性。

发明概述

本发明提供在具有完整血管床的哺乳动物器官、组织或其部分的再内皮化和/或再细胞化(用除内皮细胞外的细胞)的细胞外基质中，维持毛细血管腔直径、降低毛细血管腔直径的减小或增大毛细血管腔直径的方法，例如确保移植后合适的毛细血管直径以维持连续的血液流动。该方法包括提供或制备具有完整血管床的哺乳动物器官、组织或其部分的脱细胞化的细胞外基质，以及提供或制备内皮细胞群体或能够分化成内皮细胞的干细胞群体或祖细胞群体。向脱细胞化的细胞外基质中同时引入或顺序引入一定量的细胞和一定量的含有生物相容性纳米颗粒或微粒的第一水性溶液。细胞的量能有效地将脱细胞化的细胞外基质的脉管系统的再内皮化，并且在再内皮化期间或在其之后，相对于相应的缺少纳米颗粒或微粒的再内皮化脱细胞化的细胞外基质，当通过脉管系统循环时，，纳米颗粒或微粒的量维持脉管系统的毛细血管腔直径，或降低脉管系统的毛细血管腔直径减少，例如降低至约4微米，或增加脉管系统的毛细血管腔直径，例如高达约15至约20微米。在一个实施方案中，纳米颗粒或微粒是生物可降解的。在一个实施方案中，在加入添加剂(addedagent)或能量源之后，纳米颗粒或微粒是可快速生物降解的。在一个实施方案中，纳米颗粒或微粒不是生物可降解的。纳米颗粒可由任何生物相容性材料形成，并且可以是允许其通过脉管系统的任何形状。在一个实施方案中，纳米颗粒或微粒的形状是球形的或椭圆形的。在一个实施方案中，纳米颗粒或微粒的平均直径是约0.5μm至约30μm或约5μm至约20μm。在一个实施方案中，纳米颗粒或微粒是可变形的。在一个实施方案中，纳米颗粒或微粒由聚合物形成，所述聚合物包括天然存在的和合成的(非天然存在的)聚合物。在一个实施方案中，纳米颗粒或微粒由蛋白和非蛋白聚合物形成。在一个实施方案中，对纳米颗粒或微粒进行修饰，以使其包含羧化物、酯、胺、醛、醇或卤化物以及功能分子，如磁性分子的配体。在一个实施方案中，添加外部能量源，例如，但不限于：降解颗粒的光、磁、机械力或超声。在一个实施方案中，在再内皮化之后添加水性溶液。在一个实施方案中，通过用另一溶液洗涤再内皮化的脉管系统来移除纳米颗粒或微粒，所述溶液不含所述颗粒，并且可含有降解颗粒的物质。在一个实施方案中，所述方法包括引入含有生物相容性纳米颗粒或微粒的第二水性溶液，所述纳米颗粒或微粒的平均直径比第一溶液中的纳米颗粒或微粒的平均直径大至少10％。颗粒的浓度可以发生变化，并且可以是实现目的的任何量。例如，每μL的第一溶液可包含约300至约50,000,000个颗粒。

脱细胞化的细胞外基质可来自任何器官或组织，只要所述器官和组织具有允许溶液循环进入其血管导管并循环流出其血管导管的完整的血管(毛细血管)床(“完整的”脉管系统)。在一个实施方案中，脱细胞化的器官为脱细胞化的心脏、胰腺、肝脏、肾脏、骨或肺。可使用能够将具有完整脉管系统的脱细胞化的器官、组织或其部分的细胞外基质脉管系统再内皮化的任何细胞类型。例如，所述细胞可以是从iPS细胞获得的。在一个实施方案中，通过注射或灌注或它们的组合将细胞引入基质。在一个实施方案中，通过注射或灌注或它们的组合将细胞引入脉管系统。在一个实施方案中，向脱细胞化的细胞外基质中引入的细胞是原代细胞。在一个实施方案中，向脱细胞化的细胞外基质中引入的细胞是意图将器官、组织或其部分完全或部分再细胞化的多种不同的细胞类型。在一个实施方案中，向脱细胞化的细胞外基质中引入的细胞是人胚胎干细胞。在一个实施方案中，细胞与灌注的脱细胞化的器官、组织或其部分是同种异体的。在一个实施方案中，细胞与灌注的脱细胞化的器官、组织或其部分是异种的。

附图简要说明

图1A显示了灌注脱细胞化的猪肝脏的照片。

图1B-C分别显示了灌注脱细胞化的猪肝脏的血管和实质基质的扫描电子显微镜(SEM)照片。

图2提供了浸入脱细胞化的大鼠肝脏的总视图，其中在低放大倍数(左)和高放大倍数(右)下均可观测到基质磨损。

图3显示了浸入脱细胞化的大鼠肝脏的SEM照片(A和B)以及灌注脱细胞化的大鼠肝脏的SEM照片(C和D)。

图4提供了浸入脱细胞化的肝脏的组织结构(A，H&E染色；B，三色染色)和灌注脱细胞化的肝脏的组织结构(C，H&E染色；D，三色染色)。

图5显示了大鼠心脏的浸入脱细胞化(顶行)与灌注脱细胞化(底行)的比较。

图6显示了利用大鼠肾脏的浸入脱细胞化(顶行)与灌注脱细胞化(底行)的比较。

图7显示了脱细胞化的肾脏的SEM照片。

图8A显示了灌注脱细胞化的心脏的SEM照片，同时图8B显示了浸入脱细胞化的心脏的SEM照片。

发明详述

本发明提供工程化的细胞和ECM，其通过物理以及分子相互作用，经由控制那些细胞的环境而直接控制细胞行为。特别地，本发明提供工程化的具有灌注脱细胞化的ECM的器官、组织或生物反应器，所述灌注脱细胞化的ECM移植有包含细胞组合的细胞群体，并经历了例如包括灌注可溶性介质的培养条件，该ECM结构和培养条件产生与相应的原始器官基本相同的功能细胞和毛细血管腔直径，例如约5μm至约10μm或约3μm至约20μm。特别地，由于维持了毛细血管腔直径，本发明可以为成人细胞和胚细胞以及部分分化的祖细胞的细胞分化、生长和表型表达提供改善的调节，以及为分化的细胞类型提供改善的维持。还包括原代细胞的生长和功能维持，所述原代细胞包括胎儿来源的细胞，例如从胎儿细胞或新生儿细胞中获得的器官特异的细胞(例如定型至特定谱系但未终末分化的细胞)。

本发明提供灌注脱细胞化的器官或组织来源的细胞外基质(ECM)的用途以及在这些基质的细胞外基质脉管系统中可用于支持以下的系统：具有血管(例如内皮的)细胞的这些基质再细胞化，或干细胞或祖细胞分化和/或成熟为内皮细胞，或原代细胞的维持或分化，或它们的任何组合。原代细胞是从生物体中获得的细胞，然后，通常将其进行体外培养，但是那些细胞不能无限增殖。分化的细胞包括原代细胞和已经体外分化的细胞，例如本发明的灌注脱细胞化的基质中的干细胞或祖细胞。在一个实施方案中，至少5％、10％或20％或更多的分化细胞具有功能上成熟的表型。组织是具有共同结构和功能的细胞群体，例如上皮组织、结缔组织、肌肉组织(骨骼肌、心肌或平滑肌)以及神经组织，并且包括覆盖或内衬或连结器官的柔软的层。器官是以结构单元连接在一起的行使共同功能的一些组织(两种或更多种)。器官包括但不限于：脑、肝脏、胰腺、骨、心脏、胃、肾脏、肺、全身肌肉、胸腺、肛门和肠。如本文使用的，器官包括可灌注的全部器官或器官的部分或其血管化的结构，组织包括含有血管化的组织的任何结构，例如气管。

在一个实施方案中，本发明提供器官或组织特异的细胞外基质(ECM)支架在再内皮化中的用途，该用途利用可需要分化或成熟的细胞，如干细胞或祖细胞。分化是一个过程，细胞通过该过程获得不同于原始细胞群体的新表型，例如不同的细胞基因和/或蛋白表达和/或功能。成熟进一步将细胞群体的表型阐明为具有体内细胞群体中的细胞的正常成熟功能能力。在一个实施方案中，支架是器官的灌注脱细胞化的ECM部分。在另一实施方案中，支架是灌注脱细胞化的ECM器官。

与其它脱细胞化技术(如基于浸入的脱细胞化)相比，来自器官或组织的灌注脱细胞化的ECM保留了更多的天然微结构，包括完整的血管和/或微血管系统。例如，来自器官或组织的灌注脱细胞化的ECM保留了胶原含量以及其它结合和信号因子以及脉管系统结构，因而为引入的细胞的功能分化或细胞功能维持提供了具有天然诱因的生态位环境。在一个实施方案中，在合适的条件(包括合适的压力和流量)下，利用灌注脱细胞化的ECM的脉管系统，用细胞和/或介质灌注来自器官或组织的灌注脱细胞化的ECM，以模拟通常存在于生物体中的条件。人体尺寸的器官的正常压力为约40至约200mmHg，其中产生的流动速率取决于进入的灌注血管直径。对于正常的人体心脏，产生的灌注速率为约20至约200mL/min/100g。利用此系统，接种的细胞可达到的接种浓度比在2D细胞培养条件下达到的接种浓度大约5x至高达约1000x并且不像2D培养系统，ECM环境允许细胞进行进一步的功能分化，例如祖细胞分化成显示具有持续功能的器官或组织特异表型的细胞。在一个实施方案中，培养条件与ECM来源的组合允许引入至ECM的细胞进行功能分化。

在一个实施方案中，方法包括选择器官或组织的灌注脱细胞化的基质以及包含内皮细胞的细胞群体或能够分化成内皮细胞的祖细胞的细胞群体。在一定条件下，将选择的灌注脱细胞化的基质与细胞群体接触一段时间，来为灌注脱细胞化的基质提供再细胞化，并且使细胞群体中的祖细胞分化成功能细胞。在一个实施方案中，引入纳米颗粒和微粒，并使其与细胞一起通过脉管系统进行循环。在一个实施方案中，在再内皮化之后，引入纳米颗粒和微粒，并使其通过脉管系统进行循环。在一个实施方案中，所述器官为心脏。在另一实施方案中，所述器官为肝脏。在另一实施方案中，所述器官为胰腺。在另一实施方案中，所述器官为肺。

在一个实施方案中，本发明提供在再内皮化的灌注脱细胞化的基质中维持毛细血管腔直径的方法。所述方法包括选择器官或组织的灌注脱细胞化的基质以及能够分化成内皮细胞或内皮细胞的干细胞群体。在一定条件下，将选择的灌注脱细胞化的基质与细胞接触一段时间来为灌注脱细胞化的基质提供再内皮化，并且提供内皮细胞或者使群体中的干细胞分化成功能性内皮细胞。在一个实施方案中，干细胞为诱导的多能干(iPS)细胞。在一个实施方案中，干细胞为胚胎干(ES)细胞，例如，人ES细胞。在一个实施方案中，干细胞为成体干细胞。

在一个实施方案中，本发明的方法使用器官或组织ECM的一部分，例如心脏的心房或心室，或者胰腺的内部结构，包括胰岛。在一个实施方案中，所述部分的厚度为约5至约10mm。在一个实施方案中，所述部分的厚度为约70至约100mm。

可从任何来源获得ECM器官或组织基质，所述来源包括但不限于心脏、肝脏、肺、骨骼肌、脑、胰腺、脾脏、肾脏、子宫、眼睛、脊髓、全身肌肉或膀胱，或其任何部分(例如主动脉瓣、二尖瓣、肺动脉瓣、三尖瓣、肺静脉、肺动脉、冠状脉管系统、隔膜、右心房、左心房、右心室或左心室)。实体器官是指具有“基本闭合的”脉管系统的器官。关于器官的“基本闭合的”脉管系统意为，假设主要的血管被插管、被结扎或者以其它方式受限制，在用液体灌注后，大部分液体包含于实体器官中或从天然血管结构中流出，并且不从实体器官中漏出。尽管具有“基本闭合的”脉管系统，上文列出的许多器官具有确定的“入口”或“出口”血管，在灌注期间，可将其用于引入液体以及使液体移动遍及器官。此外，其它类型的血管化器官或组织可以是灌注脱细胞化的，所述器官或组织为例如，全部或部分关节(例如，膝、肩部或臀部)、肛门、气管或脊髓。进一步，当为更大的血管化结构(如整个腿部)的部分时，无血管组织例如，软骨或角膜可以是脱细胞化的。

由于灌注脱细胞化保存了完整的基质和微环境，包括完整的血管和微血管系统，因而具有基本闭合的血管系统的器官的灌注脱细胞化的基质特别有用，可将该血管系统用于递送细胞以及向体外细胞递送营养物和/或分化或维持因子。可通过其它方法来递送细胞和营养物和/或其它因子，所述方法为例如，注射或被动方法或其组合。在一个实施方案中，将目标细胞群体灌注入灌注脱细胞化的器官ECM，其允许接种至血管导管外的间隙空间或基质。这包括主动迁移和/或细胞返回其天然微结构，例如内皮细胞返回脉管系统。在一个实施方案中，将目标细胞群体灌注入灌注脱细胞化的ECM中，然后引入第二细胞群体，例如β细胞群体，随后引入内皮细胞群体，所述内皮细胞留于血管导管中，如同在其天然微环境中。在一个实施方案中，将目标细胞群体灌注入灌注脱细胞化的ECM中，然后引入第二细胞群体，例如内皮细胞群体，随后引入包含β细胞的细胞群体，所述内皮细胞留于血管导管中，如同在其天然微环境中。在另一实施方案中，将两种或更多种细胞群体组合并一起灌注。在另一实施方案中，通过灌注、直接注射或两者的组合，连续引入两种或更多种不同的细胞群体。向离体的再内皮化的脉管系统引入本发明的颗粒以维持毛细血管腔直径，降低毛细血管腔直径的减少或增加毛细血管腔直径。

可以向介质中引入细胞，所述介质支持细胞增殖、代谢和/或分化。可选地，在细胞已经定居于ECM之后，将培养基换为支持细胞增殖、代谢和分化的培养基。培养的细胞可以以生理细胞密度存在于ECM中，并且在支持细胞增殖、代谢和/或分化的培养基和/或ECM中合适的微环境存在的情况下，允许细胞的维持和/或功能分化。

细胞和ECM可以是异种的或同种异体的。在一个实施方案中，可将部分或完全分化的人细胞与来自小动物(例如非人类哺乳动物)的灌注脱细胞化的器官或组织进行组合。在一个实例中，将内皮细胞以及部分分化的人ES衍生的肝细胞接种于来自人的灌注脱细胞化的肝脏基质中，从而分别提供同种异体或异种细胞接种的基质。

灌注脱细胞化的ECM

研究显示，与2D培养相比，在3D培养中的结缔组织细胞表现极其不同(Cukiermanetal.,Science,294:1708(2001))。例如，在平基板上培养成纤维细胞诱导了极性，这在体内不会发生。进一步，当将成纤维细胞和其它细胞类型在3D组织来源的基质中培养时，它们在数分钟内产生成熟的含有整合素的粘合斑复合物，其类似于体内发现的复合物，然而在2D培养或者甚至简单的3DI型胶原凝胶或基质胶中，仅产生原始的粘附复合物。这些粘附复合物是合适的生长因子激活受体信号和快速(5分钟内)引发合成其自身ECM组分以及改变ECM的因子所需的(Cukiermanetal.,2001；Abbott,Nature,424:870(2003))。此外，ECM培养物中的细胞将自分泌的生长因子沉积于组织来源的基质中，这是向靶细胞适当地呈递生长因子所需的过程。在2D培养中，此类因子主要分泌到培养基中。

如上文所提到的，除化学物质、分子(例如可溶性介质)或遗传(细胞类型)因子之外，与ECM的物理相互作用可调节细胞命运。例如，基于ECM的细胞控制可通过多种物理机制而发生，如微米级和纳米级的ECM几何结构、ECM弹性或从ECM向细胞传输的机械信号。

本发明包括工程化的灌注脱细胞化的ECM的用途，所述ECM允许通过物理以及分子相互作用来更好地控制细胞行为，例如来自成体干细胞或胚胎干细胞。本发明的灌注脱细胞化的基质模拟天然ECM的复杂以及高度有序的性质，以及细胞与ECM之间可能的交互作用。特别地，ECM可向干细胞或祖细胞提供组织特异的诱因。特别地，不同的基质蛋白由于其对ECM结构的贡献或者由于其与生长因子和/或驻留细胞自身相互作用的能力，对于ECM的特异性可能很重要。

组织或器官ECM的灌注脱细胞化提供完整的ECM，所述ECM具有提供结构特性、生物化学特性以及机械特性以使功能性细胞能够分化和维持。因此，器官的灌注脱细胞化允许器官作为干细胞或祖细胞分化的组织/器官特异的生物反应器发挥作用。此外，在保存具有结构和生物化学诱因的完整基质方面(包括完整的脉管系统)，器官或组织ECM的灌注脱细胞化优于浸入脱细胞化。此外，当组织或器官厚度超过约2mm时，相对于浸入脱细胞化，灌注脱细胞化提供了优势。

器官或组织的脱细胞化

脱细胞化通常包括下述步骤：稳定实体器官(例如其血管化结构)或组织，使实体器官或组织脱细胞化，将实体器官或组织复性和/或中和，洗涤实体器官，降解器官中剩余的任何DNA，将器官或组织灭菌以及使器官达到内稳态。

将器官的血管化结构或组织脱细胞化的初始步骤是向器官或组织中插入插管。可使用本领域已知的方法和材料，向器官或组织的血管、导管和/或腔中插入插管。接着，用细胞破碎介质灌注插有插管的器官血管化结构或组织。通过器官的灌注可以是多方向的(例如顺行和逆行)。

在本领域，心脏的Langendorff灌注是常规的生理灌注(也被称作四室工作模式灌注)。参见，例如，Dehnert,TheIsolatedPerfusedWarm-BloodedHeartAccordingtoLangendorff,InMethodsinExperimentalPhysiologyandPharmacology:BiologicalMeasurementTechniquesV.Biomesstechnik-VerlagMarchGmbH,WestGermany,1988。

简言之，对于Langendorff灌注，将主动脉插入插管并将其与含有生理溶液的储器连接，以使心脏体外运行指定的持续时间。为了实现灌注脱细胞化，已经将方案修改为灌注主动脉下游以逆行方向递送的细胞破碎介质，以恒定流速递送，例如，通过灌输或滚压泵或者通过恒定静水压泵。在这两种情况下，主动脉瓣被迫关闭，并且灌注液体流向冠状动脉口(因而通过顺行，灌注心脏的整个心室团块)，然后通过冠状窦流入右心房。对于工作模式灌注，将第二插管与左心房相连，并且可将灌注变为逆行。

在一个实施方案中，生理溶液包括磷酸盐缓冲液(PBS)。在一个实施方案中，生理溶液是补充有例如营养补充物(例如葡萄糖)的生理相容性缓冲液。例如，对于心脏，生理溶液可以是改良的克雷布斯-亨斯雷特缓冲液(ModifiedKrebs-Henseleitbuffer)，其含有118mMNaCl、4.7mMKCl、1.2mMMgSO₄、1.2mMKH₂PO₄、25mMNaHCO₃、11mM葡萄糖、1.75mMCaCl₂、2.0mM丙酮酸盐以及5U/L胰岛素；或者是克雷布斯缓冲液(Krebsbuffer)，其含有118mMNaCl、4.7mMKCl、25mMNaHCO₃、1.2mMMgSO₄、1.2mMKH₂PO₄、2mMCaCl₂，充有95％O₂、5％CO₂。可将葡萄糖(例如，约11mM)作为唯一的底物或者与约1或1.2mM棕榈酸盐组合来灌注心脏。对于肾脏，生理溶液可以是肾脏灌注溶液。对于肝脏，生理溶液可以是克雷布斯-亨斯雷特缓冲液，其含有118mMNaCl、4.7mMKCl、1.2mMMgSO₄、1.2mMKH₂PO₄、26mMNaHCO₃、8mM葡萄糖以及1.25mMCaCl₂，补充有2％的BSA。

灌注其它器官或组织的方法在本领域是已知的。例如，下述参考文献描述肺、肝脏、肾脏、脑以及四肢的灌注。VanPutteetal.,Ann.Thorac. Surg.,74(3):893(2002)；denButteretal.,Transpl.Int.,8:466(1995)；Firthetal.,Clin.Sci.(Lond.),77(6):657(1989)；Mazzettietal.,BrainRes.,999(1):81(2004)；Wagneretal.,J.Artif.Organs,6(3):183(2003)。

可将一种或多种细胞破碎介质用于脱细胞化器官或组织。细胞破碎介质通常包含至少一种去垢剂，例如但不限于SDS、PEG、CHAPS或TritonX。细胞破碎介质可包含水，以使介质与细胞在渗透上不相容。可选地，细胞破碎介质可包含与细胞渗透相容的缓冲液(例如PBS)。细胞破碎介质还可包含酶，例如不限于一种或多种胶原酶、一种或多种分散酶、一种或多种DNA酶或蛋白酶如胰蛋白酶。在某些情况下，细胞破碎介质还可包含或者可选地包含一种或多种酶的抑制剂(例如蛋白酶抑制剂、核酸酶抑制剂和/或胶原酶抑制剂)。

在某些实施方案中，可用两种不同的细胞破碎介质顺序灌注插有插管的器官或组织。例如，第一细胞破碎介质可包含阴离子去垢剂如SDS，第二细胞破碎介质可包含离子去垢剂如TritonX。在用至少一种细胞破碎介质灌注之后，可用例如洗涤溶液和/或含有一种或多种酶(如本文公开的那些酶)的溶液来灌注插有插管的器官或组织。

交替灌注方向(例如顺行和逆行)可有助于将整个器官或组织脱细胞化。脱细胞化通常将器官由内而外脱细胞化，从而导致对ECM的损伤较小。可在4-40℃之间的合适温度将器官或组织脱细胞化。根据器官或组织的大小和重量以及具体的去垢剂和细胞破碎介质中去垢剂的浓度，通常用细胞破碎介质灌注器官或组织约0.05小时至约5小时/克实体器官或组织(通常>50克)，或者约2小时至约12小时/克实体器官或组织(通常<50克)。包括洗涤，可灌注器官高达约0.75小时至约10小时/克实体器官或组织(通常>50克)，或者约12小时至约72小时/克组织(通常<50克)。脱细胞化时间取决于器官或组织的血管和细胞密度，其对于总质量具有有限的缩放比例。因此，提供上述时间范围和质量作为通用指南。通常将灌注调整以适应生理条件，包括脉动流、速度和压力。

脱细胞化的器官或组织具有器官或组织的全部或大部分区域的细胞外基质(ECM)组分，包括血管树的ECM组分。ECM组分可以包括任何或全部下述组分：纤连蛋白、原纤蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、胶原家族成员(例如胶原I、III和IV)、ECM相关生长蛋白(包括生长因子和细胞因子)、葡糖氨基葡聚糖、基质、网状纤维以及血小板反应蛋白，其可以保持组织安排为明确的结构，如基板。将成功的脱细胞化定义为利用标准的组织学染色程序，在组织切片中不存在可检测的肌丝、内皮细胞、平滑肌细胞和核，或者如通过荧光分析测量的，去除超过97％的可检测DNA。可将剩余的细胞碎片从脱细胞化的器官或组织中去除。

在脱细胞化期间和之后，维持ECM的形态和结构。本文使用的“形态”指器官、组织或ECM的整体形状，而本文使用的“结构”指外表面、内表面以及其间的ECM。

可目测和/或在组织学上检测ECM的形态和结构。例如，实体器官外表面或器官或组织脉管系统内的基板，应当不会由于灌注脱细胞化而被去除或显著受损。此外，ECM的原纤维应与未脱细胞化的器官或组织的原纤维相似或未显著改变。

可将一种或多种化合物应用于脱细胞化的器官或组织，从而例如保存脱细胞化的器官，或者制备脱细胞化的器官或组织用于再细胞化，和/或在再细胞化过程期间辅助或刺激细胞。此类化合物包括但不限于：一种或多种生长因子(例如VEGF、DKK-1、FGF、BMP-1、BMP-4、SDF-1、IGF和HGF)、免疫调节剂(例如细胞因子、糖皮质激素、IL2R拮抗剂、白细胞三烯拮抗剂)和/或调节凝血级联反应的因子(例如阿司匹林、肝素结合蛋白和肝素)。此外，可用例如辐射(例如UV、γ)进一步处理脱细胞化的器官或组织，以降低或消除脱细胞化的器官或组织残存的任何类型的微生物。

心脏的示例性灌注脱细胞化

PEG脱细胞化方案

在含有100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B、1000U糖原以及2mg腺苷的200mlPBS中洗涤心脏，而无再循环。然后利用手动再循环，用35ml聚乙二醇(PEG；1g/mL)将心脏脱细胞化，持续直至30分钟。然后利用再循环的泵，用500mLPBS洗涤器官直至24小时。重复洗涤步骤至少两次，每次至少24小时。利用手动再循环使心脏接触35mlDNA酶I(70U/mL)至少1小时。用500mlPBS再次洗涤器官持续至少24小时。

TritonX和胰蛋白酶脱细胞化方案

在含有100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B、1000U糖原以及2mg腺苷的200mlPBS中将心脏洗涤至少约20分钟而无再循环。然后用0.05％胰蛋白酶将心脏脱细胞化，持续30分钟，随后用含有5％Triton-X和0.1％氢氧化铵的500mLPBS进行灌注，持续约6小时。用去离子水灌注心脏，持续约1小时，然后用PBS灌注12小时。随后利用再循环的泵，用500mLPBS将心脏洗涤3次，每次持续24小时。利用手动再循环，用35mlDNA酶I(70U/mL)灌注心脏1小时，并利用再循环的泵在500mLPBS中将心脏洗涤两次，每次至少约24小时。

1％SDS脱细胞化方案

在含有100U/mL青霉素、0.1mg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B、1000U糖原以及2mg腺苷的200mLPBS中将心脏洗涤至少约20分钟而无再循环。利用再循环的泵，用含有1％SDS的500mL水将心脏脱细胞化，持续至少约6小时。然后用去离子水洗涤心脏约1小时，并用PBS洗涤约12小时。利用再循环的泵，用500mLPBS将心脏洗涤三次，每次持续至少约24小时。然后利用手动再循环，用35mlDNA酶I(70U/mL)灌注心脏约1小时，并利用再循环的泵，用500mLPBS将心脏洗涤三次，每次持续至少约24小时。

TritonX脱细胞化方案

用含有100U/mL青霉素、0.1mg/ml链霉素、0.25μg/mL两性霉素B、1000U糖原以及2mg腺苷(腺苷(adenosine))的200mLPBS将心脏洗涤至少约20分钟而无再循环。然后利用再循环的泵，用含有5％TritonX和0.1％氢氧化铵的500mL水将心脏脱细胞化，持续至少6小时。然后用去离子水灌注心脏约1小时，随后用PBS灌注约12小时。利用再循环的泵，通过用500mLPBS灌注心脏来洗涤心脏，灌注三次，每次持续至少24小时。然后利用手动再循环，用35mlDNA酶I(70U/mL)灌注心脏约1小时，并将其在500mlPBS中洗涤三次，每次持续约24小时。

可以以60cmH₂O的冠状动脉灌注压来灌注心脏。尽管不是必需的，可将心脏置于脱细胞化室中，完全浸没，并且以再循环模式，以5mL/分钟的连续流动，用含有抗生素的PBS灌注72小时，从而尽可能多的洗净细胞组分和去垢剂。

心脏脱细胞化的检测

可通过组织切片中没有肌丝和核来估量成功的脱细胞化。可通过在包埋组织切片之前，用2％尹文思蓝灌注来评估血管结构的成功保存。当首先以恒定的冠状动脉灌注压，用溶解于去离子H₂O的离子去垢剂(1％十二烷基硫酸钠(SDS)，约0.03M)顺行灌注心脏，然后用非离子去垢剂(1％TritonX-100)顺行灌注来去除SDS并可能使细胞外基质(ECM)蛋白复性时，可观察到高效的脱细胞化。间歇地，可用磷酸盐缓冲溶液逆行灌注心脏，以清除阻塞的毛细血管和小血管。

为了显示脱细胞化后的完整血管结构，可经由Langendorff灌注，用伊文思蓝将脱细胞化的心脏染色，从而将血管基膜染色并定量大血管和微血管密度。进一步，可将聚苯乙烯颗粒灌注入并穿过心脏，从而定量冠状动脉体积、血管渗漏的水平，并通过分析冠脉流出液和组织切片来评估灌注的分布。对三项标准的组合进行评估，并与分离的非脱细胞化的心脏进行比较：1)聚苯乙烯颗粒的平均分布，2)在某一水平渗漏的显著变化，3)微血管密度。

可通过Tower等(AnnBiomedEng.,30(10):1221(2002)的偏振光显微镜技术来评估纤维取向，可将其实时应用于经受单轴应力或双轴应力的样本。在Langendorff灌注期间，记录了脱细胞化的ECM的基本机械特性(依从性、弹性、爆破压力)，并与新鲜分离的心脏进行了比较。

肝脏的示例性灌注脱细胞化

对于肝脏分离，通过中部剖腹手术暴露腔静脉，利用小鼠主动脉套管(RadnotiGlass,Monrovia,Calif.)将其切开并插上插管。将肝动脉和肝静脉以及胆管横切，将肝脏从腹部小心地取出，并浸没于无菌PBS中(Hyclone,Logan,Utah)以使门静脉上的牵引力最小化。肝素化的PBS灌注15分钟之后，用含有1％SDS(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)的去离子水灌注2-12小时，并用含有1％Triton-X(Sigma,St.Louis,Mo.)的去离子水灌注15分钟。然后用含有抗生素的PBS(100U/ml青霉素-G(Gibco,Carlsbad,Calif.)、100U/ml链霉素(Gibco,Carlsbad,Calif.)、0.25μg/ml两性霉素B(Sigma,St.Louis,Mo.))连续灌注肝脏124小时。

SDS灌注120分钟之后，用Triton-X100灌注，这足够生成完全脱细胞化的肝脏。脱细胞化的肝脏的Movat五色套染染色证实保留了典型的的肝组织，其具有中央静脉和含有肝动脉、胆管以及门静脉的门管区。

器官或组织的再细胞化

将脱细胞化的器官或组织与细胞群体接触，所述细胞群体为分化的细胞(成熟细胞或原代细胞)、干细胞或者部分分化的细胞，其包括不同的细胞类型。因此，所述细胞可以是全能细胞、多能细胞或专能细胞，并且可以是未定型细胞或定型细胞，并且可以是单一谱系细胞。细胞可以是未分化的细胞、部分分化的细胞或完全分化的细胞，包括胎儿来源的细胞。细胞可包含祖细胞、前体细胞或“成体”来源的干细胞，包括脐带细胞和胎儿干细胞。用于本发明的基质中的细胞包括胚胎干细胞(如美国国立卫生研究院(NIH)所定义的；参见，例如万维网址stemcells.nih.gov的术语表)和iPS细胞。

可用于将器官或组织再细胞化的细胞的实例包括而不限于：胚胎干细胞、脐带血细胞、组织来源的干细胞或祖细胞、骨髓来源的干细胞或祖细胞、血液来源的干细胞或祖细胞、间充质干细胞(MSC)、骨骼肌来源的细胞、专能成体祖细胞(MAPC)或iPS细胞。可使用的另外的细胞包括心脏干细胞(CSC)、专能成体心脏来源的干细胞、心脏成纤维细胞、心脏微脉管系统内皮细胞、主动脉内皮细胞、冠状动脉内皮细胞、微脉管内皮细胞、静脉内皮细胞、动脉内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、肝细胞、β细胞、角质细胞、蒲肯野(purkinji)纤维、神经元、胆管上皮细胞、胰岛细胞、肺泡细胞、克拉拉细胞(claracells)、刷状缘细胞或足细胞。也可使用骨髓来源的干细胞如骨髓单核细胞(BM-MNC)、内皮或血管干细胞或祖细胞，以及外周血来源的干细胞如内皮祖细胞(EPC)。

灌注脱细胞化支架引入的细胞的数量可取决于器官(例如何种器官，器官的尺寸和重量)或组织以及再生细胞的类型和发育阶段。关于那些细胞将达到的群体密度，不同类型的细胞可能具有不同的趋向性。类似地，不同的器官或组织可以以不同的密度被细胞化。例如，脱细胞化的器官或组织可以“接种”至少约1,000(例如至少10,000、100,000、1,000,000、10,000,000或100,000,000)个细胞；或者可以有约1,000个细胞/mg组织(湿重，例如脱细胞化之前)至约10,000,000个细胞/mg组织(湿重)附在其上。

可通过在一处或多处部位注射细胞，将其引入(“接种于”)脱细胞化的器官或组织。此外，可向脱细胞化的器官或组织引入多种类型的细胞。例如，可在脱细胞化的器官或组织的多个部位注射一群分化的细胞类型，或者可将不同细胞类型注射至脱细胞化的器官或组织的不同部分。可选地，或者除注射之外，可通过灌注将细胞或细胞混合物引入插有插管的脱细胞化的器官或组织。例如，可使用灌注介质将细胞灌注至脱细胞化的器官，然后可将灌注介质更换为扩增培养基和/或分化培养基以诱导细胞的生长和/或分化。可通过将细胞置于器官内的不同部位来实现位置特异的分化，例如置于心脏区域，如心房、心室或结节。

在再细胞化期间，在一定条件下维持器官或组织，在该条件下脱细胞化的器官或组织内的或者其上至少一些细胞可以增殖和/或分化。那些条件包括而不限于：合适的温度和/或压力、电学活性和/或力学活性、力、合适的O₂和/或CO₂量、合适的湿度量以及无菌或者近似无菌条件。在再细胞化期间，在合适的环境中维持脱细胞化的器官或组织以及其上所附的再生细胞。例如，所述细胞可能需要营养补充物(例如，营养素和/或碳源如葡萄糖)、外源激素或生长因子和/或特定的pH。

细胞与脱细胞化的器官或组织可以是同种异体的(例如接种有人细胞的人脱细胞化的器官或组织)，或者细胞与脱细胞化的器官或组织可以是异种的(例如接种有人细胞的猪脱细胞化的器官或组织)。本文使用的“同种异体的”指从与器官或组织来源相同的物种获得的细胞(例如相关或不相关的个体)，而本文使用的“异种的”指从与器官或组织来源不同的物种获得的细胞。

干细胞或祖细胞培养基可以含有多种组分，包括，例如，KODMEM培养基(敲除达尔伯克氏改良伊格尔培养基(KnockoutDulbecco'sModifiedEagle'sMedium))、DMEM、Ham'sF12培养基、FBS(胎牛血清)、FGF2(成纤维细胞生长因子2)、KSR或hLIF(人白血病抑制因子)。细胞分化培养基还可以含有补充物，如L-谷氨酰胺、NEAA(非必需氨基酸)、P/S(青霉素/链霉素)、N2、B27以及β-巯基乙醇。预期可以向细胞分化培养基添加另外的因子，包括，但不限于：纤连蛋白、层粘连蛋白、肝素、硫酸肝素、视黄酸、表皮生长因子家族(EGF)的成员、成纤维细胞生长因子家族(FGF)的成员(包括FGF2、FGF7、FGF8和/或FGF10)、血小板衍生的生长因子家族(PDGF)的成员、转化生长因子(TGF)/骨形态发生蛋白(BMP)/生长分化因子(GDF)因子家族拮抗剂，其包括但不限于头蛋白、卵泡抑素、腱蛋白、gremlin、cerberus/DAN家族蛋白、ventropin、高剂量激活素以及无羊膜蛋白或它们的变体或功能片段。也可以添加TGF/BMP/GDF受体-Fc嵌合体形式的TGF/BMP/GDF拮抗剂。可以添加的其它因子包括可以通过Notch受体家族激活或失活信号的分子，其包括但不限于δ样蛋白和Jagged家族蛋白以及Notch加工或剪切抑制剂，或它们的变体或功能片段。其它生长因子可包括胰岛素样生长因子家族成员(IGF)、胰岛素、无翅基因相关(WNT)因子家族以及刺猬因子(hedgehog)家族或它们的变体或功能片段。可添加另外的因子以促进中内胚层干细胞/祖细胞、内胚层干细胞/祖细胞、中胚层干细胞/祖细胞或者定型内胚层干细胞或祖细胞增殖和存活，以及这些祖细胞衍生物的存活和分化。

在一个实施方案中，将灌注脱细胞化的基质与利用拟胚体(EB)方法分化的iPS或ES细胞组合。例如，使用通过转导重编程的人iPS细胞系，所述转导为例如慢病毒介导的转录因子的转导(OCT4、SOX2、NANOG和LIN28；Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc；或Oct3/4、Sox2和Klf4)。可使用胎儿来源的或新生儿来源的iPS克隆。也可使用人ES细胞系。可以在含DMEM/F12培养基的6孔培养板(Nunc)中以19,500个细胞/cm²的密度于中，将iPS细胞和ES细胞维持于受辐射的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中，所述DMEM/F12培养基补充有20％敲除血清替代物(KnockOutserumreplacer)(Invitrogen)、0.1mmol/L非必需氨基酸、1mmol/LL-谷氨酰胺以及0.1mmol/Lβ-巯基乙醇(Sigma)。此外，对于iPS细胞，可以向培养基中补充100ng/mL斑马鱼碱性成纤维细胞生长因子，对于hES细胞，可以补充4ng/mL人重组碱性成纤维细胞生长因子(Invitrogen)。也可在DMEM(Sigma-Aldrich)中，将iPS和ES细胞系维持于凝胶化的100-mm培养皿中，所述DMEM含有15％胎牛血清(FCS；Sigma-Aldrich)、0.1μmol/L2-巯基乙醇(2ME)以及1,000单位/mlLIF(ChemiconInternational)。为了分化，可用0.25％胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(GIBCO)处理这些细胞，并以3×10⁴个细胞/孔的浓度将其转移至凝胶化的含补充有10％FCS和0.05μmol/L2ME的α-最低必需培养基(GIBCO)的6孔板中。

可通过下述方法将克隆从培养板中分离：在37℃将克隆与1mg/mL分散酶(Gibco)溶液孵育8至15分钟，并将其置于悬浮培养的超低吸附板中，例如持续4天。在悬浮培养期间，可在第1天更换培养基，然后不更换培养基再培养3天。然后将EB置于0.1％明胶包被的培养板，例如以每孔50至100个EB的密度，或者置于灌注脱细胞化的ECM中，并在分化培养基中培养(例如每天更换)。

在某些情况下，将通过本文描述的方法生成的器官或组织移植到患者中。在那些情况下，用于使脱细胞化的器官或组织再细胞化的细胞可从患者获得，以使细胞与患者是“自体的”。来自患者的细胞可利用本领域已知的方法，在生命不同阶段(例如，出生前、新生期或围产期、青春期或者作为成人)，从例如血液、骨髓、组织或器官获得。可选地，用于使脱细胞化的器官或组织再细胞化的细胞可以是与患者同源的(即来自同卵双胞胎)，细胞可以是来自例如，患者的亲属或与患者无关的HLA匹配的个体的人淋巴细胞抗原(HLA)匹配的细胞，或者细胞可以是与来自例如非HLA匹配的供体的患者同种异体的。

不考虑细胞的来源(例如自体的或不是自体的)，脱细胞化的实体器官可以是患者自体的、同种异体的或是异种的。

在再细胞化期间，可以监测细胞的进程。例如，在再细胞化期间，可通过在一个或多个时间点获得的活体组织切片来评价器官或组织上或其内的细胞数量。此外，可通过测定不同的标志物是存在于细胞或细胞群体中来监测已经经历分化的细胞的量。与不同细胞类型以及那些细胞类型的不同分化阶段相关的标志物在本领域是已知的，并且可利用抗体和标准免疫分析容易地测定。参见，例如，CurrentProtocolsinImmunology,2005,Coliganetal.,Eds.,JohnWiley&Sons,Chapters3and11。可使用核酸分析以及形态学和/或组织学评价来监测再细胞化。

连续灌注再细胞化的移植物。在培养期间，维持细胞活力，并且可以进行TUNEL阳性细胞的定量，例如以测定凋亡的细胞。

用于使器官或组织脱细胞化和/或再细胞化的受控系统

用于使器官或组织脱细胞化和/或再细胞化的系统(例如生物反应器)通常包括：至少一种用于向器官或组织插入插管的插管装置、用于通过插管灌注器官或组织的灌注设备以及维持器官或组织的无菌环境的设备(例如密封系统)。插管术和灌注是本领域众所周知的技术。插管装置通常包括用于引入器官或组织的血管、导管和/或腔的尺寸合适的空心管。通常，器官中的一种或多种血管、导管和/或腔是插有插管的。灌注设备可包括液体(例如细胞破碎介质)的盛放容器以及用于使液体经由一个或多个插管流过器官的机制(例如泵、气压、重力)。可利用本领域已知的多种技术来维持脱细胞化和/或再细胞化期间器官或组织的无菌性，如控制和过滤气流和/或用例如抗生素、抗真菌剂或其它抗微生物剂来灌注，从而阻止不需要的微生物的生长。

如本文所述的使器官或组织脱细胞化和再细胞化的系统可具有监测某些灌注特征(例如压力、体积、流动模式、温度、气体、pH)、机械力(例如心室壁运动和应力)以及电刺激(例如起搏)的能力。由于冠状动脉血管床随着脱细胞化和再细胞化的过程而变化(例如血管阻力、体积)，为了避免大的波动，调节压力的灌注设备是有利的。可在流出物和组织切片中评价灌注的有效性。可使用标准方法监测灌注体积、流动模式、温度、局部O₂和CO₂压力以及pH。

可利用传感器来监测系统(例如生物反应器)和/或器官或组织。可利用声纳微测量法(sonomicromentry)、微量测压法和/或电导测量方法，来获得相对于心肌壁运动和性能的压力-体积或前负荷补充的搏出功信息。例如可将传感器用于监测流经插有插管的器官或组织的液体的压力；系统的周围温度和/或器官或组织的温度；流经插有插管的器官或组织的液体的pH和/或流动速度；和/或再细胞化的器官或组织的生物活性。除了配有传感器来监测此类特征之外，用于使器官或组织脱细胞化和/或再细胞化的系统也可包括用于维持或调节此类特征的设备。用于维持或调节此类特征的设备可包括下述组件，如：温度计、恒温器、电极、压力传感器、溢流阀、用于改变液体流动速度的阀门、用于打开或关闭与用于改变溶液pH的溶液的液体连接的阀门、球囊、体外起搏器和/或顺应腔。为了帮助确保稳定的条件(例如温度)，所述腔、储器和管可以是水套式的。

在再细胞化期间，在器官和附于其上的细胞上放置机械负载是有利的。作为实例，可将经由左心房插入左心室的球囊用于向心脏施加机械应力。可将允许调节体积和速度的活塞泵与球囊相连，从而模拟左心室壁运动和应力。为了监测壁运动和应力，可利用微量测压法和/或声纳微测量法来测量左心室壁运动和应力。在一些实施方案中，可将体外起搏器与活塞泵相连，从而提供与心室球囊的每次放气(其相当于心脏收缩)同步化的刺激。可记录来自心脏表面的外周ECG，从而允许调节起搏电压，监测去极化和复极化，并提供使心脏再细胞化或再细胞化的心脏的简化表面图。

通过将蠕动泵附接于通过左心房插入左心室的套管，也可实现机械性心室扩张。与上文描述的涉及球囊的程序类似，通过穿过套管的周期性液体流动(例如，脉动流)实现的心室扩张可以与电刺激同步。

利用本文公开的方法和材料，可将哺乳动物心脏脱细胞化及再细胞化，并且当在合适的条件下维持时，可以生成经受收缩功能以及响应于起搏刺激和/或药理剂的功能性心脏。

可通过与可编程处理器组合的计算机可读存储介质来控制生成器官或组织的系统(例如，本文使用的计算机可读存储介质在其上存储有引起可编程处理器执行具体步骤的指令)。例如，与可编程处理器组合的此类存储介质，可接收和处理来自一个或多个传感器的信息。与可编程处理器相连的此类存储介质还可将信息和指令传输回生物反应器和/或器官或组织。

可监测经受再细胞化的器官或组织的生物活性。所述生物活性可以是器官或组织自身的生物活性，如对于心脏组织，电活性、力学活性、机械压力、收缩性和/或器官或组织壁的应力。此外，可以监测附着于器官或组织的细胞的生物活性，例如，离子运输/交换活性、细胞分裂和/或细胞活力。参见，例如LaboratoryTextbookofAnatomyandPhysiology(2001,Wood,PrenticeHall)以及CurrentProtocolsinCellBiology(2001,Bonifacinoetal.,Eds,JohnWiley&Sons)。如上文所讨论的，在再细胞化期间，模拟器官的有效负载可能是有用的。可将与可编程处理器组合的本发明的计算机可读存储介质用于使监测和维持器官或组织上的有效负载协调所必需的组件。

在一个实施方案中，可将器官或组织的重量录入本文所述的计算机可读存储介质中，其与可编程处理器组合，能够计算具体器官或组织的暴露时间和灌注压力。此类存储介质可记录前负载和后负载(分别为灌注前和灌注后的压力)以及流动速度。在该实施方案中，例如，与可编程处理器组合的计算机可读存储介质经由一种或多种泵和/或阀门控制可调节灌注压力、灌注方向和/或灌注溶液类型。

将在下述实施例中进一步描述本发明，其不限制权利要求中所述的本发明的范围。

实施例1

灌注与浸入的比较

图1A显示了灌注脱细胞化的猪肝脏的照片，以及图1B和图1C分别显示了灌注脱细胞化的猪肝脏的血管和实质基质的SEM。这些照片显示了灌注脱细胞化的器官的血管导管和基质的完整性。另一方面，图2显示了浸入脱细胞化的大鼠肝脏的总视图，其中在低放大倍数(左)和高放大倍数(右)下均可以见基质的磨损。

图3显示了浸入脱细胞化的大鼠肝脏的SEM(A和B)以及灌注脱细胞化的大鼠肝脏的SEM(C和D)。这些结果明确表明浸入脱细胞化明显损坏了器官囊(格利森氏囊(Glisson'scapsule))，而灌注脱细胞化则保留了器官囊。此外，图4显示了浸入脱细胞化的肝脏的组织结构(A，H&E染色；B，三色染色)和灌注脱细胞化的肝脏的组织结构(C，H&E染色；D，三色染色)。在注射时，浸入脱细胞化的大鼠肝脏未保留细胞或染料。

图5显示了大鼠心脏的浸入脱细胞化(顶行)和灌注脱细胞化(底行)之间的比较。左列的照片显示了整个器官。从这两张照片可以看出，灌注脱细胞化的器官(左下方)比浸入脱细胞化的器官(左上方)更透明，灌注脱细胞化的器官保留了尸体肌肉组织的富铁“棕红”颜色，并且似乎仍含有细胞。中间列的照片显示了脱细胞化的组织的H&E染色模式。染色显示在浸入脱细胞化(中上方)之后，保存了实质内和脉管系统壁内的许多细胞，而在灌注脱细胞化(中下方)之后，几乎每个细胞和细胞碎片均被移除，但是血管导管很明显。此外，右列的扫描电子显微照片显示浸入脱细胞化之后(右上方)与灌注脱细胞化之后(右下方)相比，基质的超微结构存在明显差异。再次，在浸入脱细胞化的心脏的全部壁中观察到了遍及心肌横切面的细胞组分的完整保留，但是在灌注脱细胞化的心脏中，观察到了这些细胞组分的几乎完全丧失，以及完整心肌的空间和结构特征的保留，包括血管导管。例如，尽管完全失去了细胞，但是灌注脱细胞化的基质保留了基质内的结构特征，包括编织物(weaves(w))、卷曲(coils(c))和支柱(struts(s))。

图6显示了利用大鼠肾脏进行的浸入脱细胞化(顶行)与灌注脱细胞化(底行)的相同比较。不像心脏，由于浸入脱细胞化的整个肾脏(左上方)与灌注脱细胞化的整个肾脏(左下方)均相当透明，因而其看上去十分相似。然而，在灌注脱细胞化的肾脏中，与浸入脱细胞化的构造相比，灌注脱细胞化的器官内的血管导管网络更加明显，并且可观察到更高程度的分支。此外，被肠系膜包围的灌注脱细胞化的肾脏保留了完整的器官囊，并且如所示，其可以与连接的肾上腺一起脱细胞化。中间列的照片显示了两个组织的H&E染色模式。染色显示，在浸入脱细胞化之后，保留了细胞组分和/或碎片以及可能甚至是完整的核(紫色染色)(中上方)，而在灌注脱细胞化之后，几乎每个细胞和/或所有的细胞碎片被移除(中下方)。同样地，SEM照片显示浸入脱细胞化的肾脏基质(右上方)比灌注脱细胞化的肾脏基质(右下方)遭受更多的损伤。在浸入脱细胞化的肾脏中，器官囊丢失或损伤，以使基质表面的“洞”或磨损更明显，然而在灌注脱细胞化的器官中，所述囊是完整的。

图7显示了脱细胞化的肾脏的SEM照片。图7A显示了灌注脱细胞化的肾脏，而图7B显示了浸入脱细胞化的肾脏。图8A显示了灌注脱细胞化的心脏的SEM照片，而图8B显示了浸入脱细胞化的心脏的SEM照片。这些图像进一步显示了浸入脱细胞化引起的器官超微结构的损伤以及灌注脱细胞化之后基质的活力。

实施例2

用于本发明的方法的示例性颗粒

用于本发明的方法的颗粒包括纳米颗粒或微粒，例如纳米球或微球，其可由多种不同的生物相容性材料形成，所述生物相容性材料为例如可降解的或不可降解的合成材料、生物(天然)材料或修饰的生物材料。可形成纳米颗粒或微粒的材料的实例包括，但不限于：藻酸盐、多糖、胶原、右旋糖酐、透明质酸、玻璃、陶瓷、金属(包括钛)、具有铁芯的颗粒、PLA、PGA、PLA/PGA、单分散三聚氰胺树脂颗粒、聚苯乙烯、尼龙、PMMA等。以举例方式而非限制的方式，合适的聚合材料可包括下述聚合物：聚氧化物(polyoxides)，如聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)；聚酯，如聚(对苯二甲酸乙二酯)；聚氨酯；聚磺酸盐；聚硅氧烷，如聚(二甲基硅氧烷)；聚硫化物；聚乙炔；聚砜；聚磺酰胺；聚酰胺，如聚己内酰胺和聚(己二酰己二胺)；聚酰亚胺；聚脲；杂环聚合物，如聚乙烯吡啶和聚乙烯吡咯烷酮；天然存在的聚合物，如天然橡胶、明胶、纤维素；聚碳酸酯；聚酸酐；以及聚烯烃，如聚乙烯、聚丙烯和乙烯-丙烯共聚物。聚合材料还可包含功能基团如羧化物、酯、胺、醛、醇或卤化物，以提供例如用于连接化学或生物部分的位点，所述化学或生物部分期望增强化学或生物分析物中的颗粒效用。

由聚合物制备纳米颗粒或微粒的方法在本领域是众所周知的。例如，可将蛋白与非蛋白聚合物组合以形成复合纳米球或微球。在一个实施方案中，颗粒是生物溶蚀性的合成或天然聚合物。本文使用的术语“生物溶蚀性的”或“生物可降解的”指酶、热、电、离子强度、pH、机械或化学降解的或者离解成更简单的化学物质的材料。天然聚合物的实例为多糖。体内降解为无害产物的合成聚合物包括聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)以及PLA和PGA的共聚物、聚原酸酯、聚酸酐、聚磷腈、聚己酸内酯、聚羟基丁酸酯、它们的混合物以及共聚物。PLA、PGA和PLA/PGA共聚物尤其适用于形成谷醇溶蛋白复合微球。通常由乳酸的环酯来制备PLA聚合物。L(+)和D(-)型乳酸以及D(-)和L(+)乳酸混合物的非旋光性DL-乳酸混合物均可用于制备PLA聚合物。在专利文献中清楚地记录了制备聚乳酸的方法。下述美国专利详细描述了合适的聚乳酸、它们的特性及制备，在此将该专利的教导以引用的方式并入：Dorough的1,995,970；Schneider的2,703,316；Salzberg的2,758,987；Zeile的2,951,828；Higgins的2,676,945；以及2,683,136；3,531,561-Trehu。温敏性聚合物包括但不限于：聚(N-异丙基丙烯酰胺)、羟丙基纤维素、聚(乙烯基己内酰胺)、聚乙烯甲基醚(polyvinylmethylether)、聚乙烯甲基醚(polyvinylmethylether)以及聚羟乙基甲基丙烯酸甲酯。

在一个实施方案中，颗粒由可被酶(如淀粉酶)容易降解的多糖形成。这将允许在移植之前快速移除颗粒。

颗粒的直径可与红血细胞的直径类似，以使单一颗粒通过毛细血管床。颗粒可以为，例如约0.01μm至约30μm、约0.5μm至约20μm或者约5μm至约10μm。

颗粒可以为适合穿过脉管系统的任何形状，包括但不限于：球体、椭圆形、盘状、炸面圈形或者星形，颗粒具有凹陷或凸起的表面，并且可以具有光滑至不光滑的表面。

颗粒可以具有或者被修饰为具有下述特性，包括但不限于：亲水表面以确保容易通过；表面在压力下进行收缩的能力，如水凝胶或蛋白包衣；通过降解、机械(如磁聚集)或能量能够从基质移除，以使其分解成可从基质中被成功排出的更小块。

为了确保形成的毛细血管具有足够的直径，以使移植之后红血细胞不被截留，可在内皮细胞接种时或者在细胞接种后约12至96小时或高达数周添加颗粒。例如，为了增加在另外的脱细胞化的移植物或者用除内皮细胞之外的细胞再细胞化的移植物中的再内皮化的血管的直径，可通过下述方法迫使毛细血管开放：开始用小颗粒尺寸，然后随小时/天缓慢增加颗粒尺寸，直至期望的尺寸能够经基质灌注。

在一个实施方案中，颗粒由通过温度变化可容易降解或离解的温敏性聚合物形成。这将允许在移植前快速移除颗粒。

在一个实施方案中，颗粒由磁性聚合物形成，并且在循环溶液中添加磁源使得在移植之前能够移除循环颗粒。

在一个实施方案中，在移植之前将颗粒从再内皮化的组织或器官中移除。对于生物可降解颗粒，将添加特定试剂或条件以将颗粒降解、溶解或消化，然后洗涤。颗粒的移除可发生在移植前数周/天，或就在移植之前发生。

红血细胞的正常浓度为约3百万至约5百万/μL。由于脉管系统占全部组织或器官空隙体积的约10％，颗粒的浓度可以为每μL组织或器官灌注(或空隙)体积约300-500,000或高达5000万。

为了确定颗粒在维持毛细血管腔直径、增加毛细血管腔直径或降低毛细血管腔直径的减小方面的功效，测定生理压力下将颗粒灌注通过再内皮化的基质之后，回收的颗粒的百分数。例如，用于所述方法的颗粒为那些，例如在灌注通过组织或器官之后，具有近似血细胞直径的尺寸或者具有约5至8μm的平均直径的颗粒中有>50％、60％、70％或更多颗粒被回收，或者在生理压力下能够灌注通过组织或器官的血液，有>50％、60％、70％返回。在非再细胞化的器官、组织或其部分中，大部分颗粒(5至8μm)驻留于间隙中，并且不显示明显返回。在未经颗粒处理的再内皮化的器官、组织或其部分中，大部分颗粒(例如约5μm至约8μm的那些颗粒)驻留于脉管系统中，并且不通过毛细血管床。

将所有出版物、专利和专利申请以引用的方式并入本文。虽然在前述说明书中，本发明所述涉及其某些优选实施方案，且为了示例说明的目的阐述了许多细节，但是本发明易受另外的实施方案的影响且在不脱离本发明的基本原则的情况下，本文的某些细节可能会发生大的改变，这对本领域那些技术人员是显而易见的。

Claims (35)

1.在具有完整血管床的哺乳动物器官、组织或其部分的再内皮化的细胞外基质中维持毛细血管腔直径、降低毛细血管腔直径的减小或增加毛细血管腔直径的方法，其包括：

提供具有完整血管床的哺乳动物器官、组织或其部分的脱细胞化的细胞外基质，以及内皮细胞群体或能够分化成内皮细胞的干细胞或祖细胞群体；以及

向所述脱细胞化的细胞外基质引入一定量的所述细胞以及含有一定量的生物相容性微粒的第一水性溶液，其中所述细胞的量能有效地将所述脱细胞化的细胞外基质的脉管系统的再内皮化，并且其中在再内皮化期间或在其之后，相对于相应的缺少所述微粒的再内皮化的脱细胞化的细胞外基质，当所述微粒通过所述脉管系统循环时，所述微粒的量维持所述脉管系统内的毛细血管腔直径、降低所述脉管系统内的毛细血管腔直径的减小或增加所述脉管系统内的毛细血管腔直径。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述微粒维持通过所述毛细血管床的流动。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述微粒是生物可降解的。

4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述微粒不是生物可降解的。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述微粒是球形或椭圆形。

6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述微粒是可变形的。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述微粒由聚合物形成。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述聚合物是天然存在的聚合物。

9.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述微粒包括藻酸盐、多糖、胶原、右旋糖酐、透明质酸、玻璃、陶瓷、金属、聚乳酸(PLA)、聚谷氨酸(PGA)或PLA和PGA的共聚物(PLA/PGA)。

10.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述聚合物是非天然存在的聚合物。

11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述微粒经过修饰而包含羧化物、酯、胺、醛、醇或卤化物。

12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述微粒由蛋白聚合物和非蛋白聚合物形成。

13.如权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述微粒的平均直径为约0.5μm至约20μm。

14.如权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述微粒包含亲水表面。

15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述微粒是磁性的。

16.如权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述微粒包含能与配体结合的表面修饰。

17.如权利要求1或6所述的方法，其中所述微粒包含水凝胶。

18.如权利要求1至17中任一项所述的方法，其中在再内皮化之后添加所述溶液。

19.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其进一步包括引入含有生物相容性微粒的第二水性溶液，所述微粒的平均直径比所述第一溶液中微粒的平均直径大至少10％。

20.如权利要求19中任一项所述的方法，其进一步包括引入含有生物相容性微粒的第三水性溶液，所述微粒的平均直径比所述第二溶液中微粒的平均直径大至少10％。

21.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中每μL的所述第一溶液包含约300至约500,000个微粒。

22.如权利要求1至20中任一项所述的方法，其进一步包括用不含所述微粒的溶液洗涤所述脉管系统。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述不含纳米颗粒或微粒的溶液包含能降解所述微粒的试剂。

24.如权利要求22所述的方法，其中将所述不含纳米颗粒或微粒的溶液与能降解或移除所述微粒的外在因素同时应用，所述外在因素包括温度、pH、超声、光或电能。

25.如权利要求1至7、10至11、13至16或18至24中任一项所述的方法，其中所述微粒包含聚苯乙烯。

26.如权利要求1至8、10至11、13至16或18至24中任一项所述的方法，其中所述微粒包含多糖。

27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述微粒的平均直径为约5至约20微米。

28.如权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述器官为心脏、胰腺、骨、肝脏、肾脏或肺。

29.如权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述细胞从iPS细胞获得。

30.如权利要求1至29中任一项所述的方法，其中通过注射或灌注或它们的组合将所述群体引入所述基质。

31.如权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述群体包含原代细胞。

32.如权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述群体包含多种不同的细胞类型。

33.如权利要求1至32中任一项所述的方法，其中所述群体包含人胚胎干细胞。

34.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述灌注脱细胞化的器官或组织是同种异体的。

35.如权利要求1至33中任一项所述的方法，其中所述细胞与所述灌注脱细胞化的器官或组织是异种的。