CN105175506A

CN105175506A - 一种聚氨酯材料强力亲和多肽及其应用

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Publication number: CN105175506A
Application number: CN201510593158.9A
Authority: CN
Inventors: 杨柳; 王宜冰; 王平; 张立挺
Original assignee: SHAANXI TIANRUI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHAANXI TIANRUI BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2015-09-18
Filing date: 2015-09-18
Publication date: 2015-12-23

Abstract

本发明公开了一组聚氨酯材料特异性结合多肽结构序列及其应用方法，属于生物材料技术领域。所申请的一组短肽氨基酸序列具有XHWXFRXWWXPX（X表示可选择氨基酸）的共同序列结构特点。吸附检测证明，此类短肽能高效地结合在聚氨酯材料表面；将此特异性亲和肽序列单独或与其它功能性化学或生物基团，或纳米结构结合，形成复合功能基团或纳米级材料，可使其自身或整个功能基团或颗粒吸附在聚氨酯材料表面；也可将多肽本身或整个功能基团或颗粒与聚氨酯材料共混，从而获得具有特殊功能性的聚氨酯界面或聚氨酯复合材料，为开发具有生物活性的聚氨酯材料提供了更好的方法。

Description

一种聚氨酯材料强力亲和多肽及其应用

技术领域

本发明提供了一组聚氨酯材料强力结合多肽的氨基酸序列及其在生物材料科学领域中的应用，属于生物材料技术领域。该肽分子自身不仅能高效地结合在水基聚氨酯材料表面，而且也能稳定地结合在溶剂基聚氨酯材料表面，形成特殊多肽分子覆盖的聚氨酯界面；也可利用该亲和多肽介导各种活性化合物分子、生物活性蛋白质分子，和各种纳微结构功能性材料在聚氨酯材料表面的结合；也可通过直接或间接与聚氨酯材料复合，改性传统聚氨酯材料，为开发具有生物活性的聚氨酯生物材料提供了良好的方法选择。

背景技术

聚氨酯全称为聚氨基甲酸酯，是主链上含有重复氨基甲酸酯基团的大分子化合物的统称，它是由有机二异氰酸酯或多异氰酸酯与二羟基或多羟基化合物加聚而成。聚氨酯材料一般具有高强度、高稳定性和耐溶剂等特点，也可与各种有机物和无机物产生良好的附着结合作用，因此，目前已经广泛应用于涂层材料领域。然而当聚氨酯材料应用于生物医药或生物医疗器械材料领域时，其生物相容性差的特点逐渐显示，它容易粘附蛋白质或细菌细胞反应和引起炎症。聚氨酯骨架的高稳定性也使其分子本身显示较高的化学反应惰性，因而很难直接在其表面进行改性修饰然而，聚氨酯亲和肽的出现，为实现改善聚氨酯材料的生物相容性提供了方便的解决方案。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题与缺陷，本发明的目的在于提供一种聚氨酯材料强力亲和多肽，该肽能高效地结合在聚氨酯材料表面；将此特异性亲和肽序列单独或与其它功能性化学或生物基团，或纳米结构结合，形成复合功能基团或纳米级材料，可使其自身或整个功能基团或颗粒吸附在聚氨酯材料表面；也可将多肽本身或整个功能基团或颗粒与聚氨酯材料共混，从而获得具有特殊功能性的聚氨酯界面或聚氨酯复合材料，为开发具有生物活性的聚氨酯材料提供了更好的方法。

实现上述发明目的的技术方案是一种聚氨酯材料强力亲和多肽，它是一组包含XHWXFRXWWXPX特异性氨基酸序列的多肽，X表示可选择氨基酸其中第一个X是A、L、I、V、M氨基酸中的任一种；第二个X是D、E氨基酸中的任一种；第三个X是Q、N氨基酸中的任一种；第四个X是Q、N氨基酸中的任一种；第五个X是S、T、Y氨基酸中的任一种。

本发明还有一个目的是提供上述聚氨酯材料强力亲和多肽直接在各种聚氨酯材料表面和内部的复合应用，包括聚氨酯涂层、聚氨酯颗粒、聚氨酯纤维、聚氨酯薄膜，聚氨酯泡沫等一切聚氨酯基的材料表面和内部。

本发明还有一个目的是提供上述聚氨酯材料强力亲和多肽与其它功能蛋白质分子融合表达后，在各种聚氨酯材料表面和内部的复合应用，包括聚氨酯涂层、聚氨酯颗粒、聚氨酯纤维、聚氨酯薄膜，聚氨酯泡沫等一切聚氨酯基的材料表面和内部。

本发明还有一个目的是提供上述聚氨酯材料强力亲和多肽与其它功能蛋白质分子，或与功能性化合物分子通过化学共价交联后，在各种聚氨酯材料表面和内部的复合应用，包括聚氨酯涂层、聚氨酯颗粒、聚氨酯纤维、聚氨酯薄膜，聚氨酯泡沫等一切聚氨酯基的材料表面和内部。

本发明还有一个目的是提供上述聚氨酯材料强力亲和多肽直接与各种纳微结构材料进行组装；或与其它功能蛋白质分子融合表达或化学交联后，再与各种纳微结构材料进行组装后，在各种聚氨酯材料表面和内部的复合应用，包括聚氨酯涂层、聚氨酯颗粒、聚氨酯纤维、聚氨酯薄膜，聚氨酯泡沫等一切聚氨酯基的材料表面和内部。

发掘聚氨酯强力亲和肽，并利用该亲和肽开发功能性聚氨酯界面材料或功能性聚氨酯生物复合材料。此类亲和多肽是一组包含XHWXFRXWWXPX（X表示氨基酸可变）特异性氨基酸序列的多肽。可直接将亲和肽分子通过浸润或喷洒在普通聚氨酯材料表面，或作为添加剂与聚氨酯材料复合应用；也可将亲和多肽与其它蛋白质分子融合表达，化学交联或与特定的纳微结构材料组装后，与传统聚氨酯复合使用，从而获得各种具有特殊生物活性的聚氨酯功能界面或蛋白质-聚氨酯复合功能材料。

附图说明

图1.多肽的荧光光谱及荧光强度与浓度关系；

图2为相对亲和性对浓度的关系；

图3为520pM浓度噬菌体的相对亲和性比较；

图4亲和噬菌体在PU材料表面的吸附的AFM图；

图5亲和多肽对聚氨酯界面屏蔽蛋白质吸附的影响；

图6亲和多肽对聚氨酯界面屏蔽蛋白质吸附的影响；

下面结合实施例和试验例来进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。

实施例1

一种聚氨酯材料强力亲和多肽，它是一组包含XHWXFRXWWXPX特异性氨基酸序列的多肽，其中，X表示可选择氨基酸，在此例中具体氨基酸序列为VHWDFROWWOPS。

实施例2

一种聚氨酯材料强力亲和多肽，它是一组包含AHWDFRQWWNPS特异性氨基酸序列的多肽。

实施例3

一种聚氨酯材料强力亲和多肽，它是一组包含LHWEFRNWWNPY特异性氨基酸序列的多肽。

实施例4

一种聚氨酯材料强力亲和多肽，它是一组包含IHWDFRQWWQPT特异性氨基酸序列的多肽。

实施例5

一种聚氨酯材料强力亲和多肽，它是一组包含MHWDFRNWWQPS特异性氨基酸序列的多肽。

试验例一：亲和多肽直接在聚氨酯材料表面的吸附：

1）配置1mg/ml的亲和多肽溶液，取65μL加入到PU包被的96孔板中的一个孔，室温震荡15h后用0.1%TBST清洗5次，每次的清洗液及未结合的剩余多肽溶液回收到新的96孔板中。

2）由于TBST对采用试剂盒对多肽浓度进行测定有影响，选择测定荧光强度来分析多肽的浓度。首先扫描荧光光谱（280nm激发）得到342nm发射峰，采用280nm激发，测定342nm发射的荧光强度来绘制多肽浓度标准曲线（配置0.05～1mg/ml多肽标准溶液）。

3）取上述为结合的多肽剩余液和TBST清洗液每个20μl于384黑色微标板中的孔中，测定280nm激发，342nm发射的荧光强度，再通过荧光强度计算剩余多肽的量和清洗下来的多肽的量。

如图1所示，多肽的荧光光谱及荧光强度与浓度关，亲和多肽在0.05-1mg/mL浓度范围内与荧光强度呈良好线性关系。每次清洗用100μLTBST溶液，总的被TBST洗下来的多肽的浓度0.467474mg/mL，则清洗下的多肽的总量为0.0467474mg。剩余未结合的多肽溶液为65μL，多肽的量为0.0103121mg，因此结合在材料上多肽的量为0.0076405mg，96孔板每个孔的底面积为0.32cm²，则多肽的吸附密度为23.8766μg/cm²，即14.2819nmol/cm²。该实验结果可直接证明此类亲和多肽在聚氨酯材料表面可直接地牢固吸附。

试验例二：亲和多肽介导的生物分子在聚氨酯表面的吸附：

1）将融合表达了亲和多肽VHWDFROWWOPS的噬菌斑单克隆接种一管ER2738于20mLLB培养基中，37℃培养至稍微浑浊。于每管培养液中加入5μL噬菌体单克隆（具备亲和性的及作为对照的）上清，37℃通气培养4h。

2）上述培养物转入离心管中，14,000rpm离心10min。上清移入新鲜灭菌离心管，再离心。取80%上清于另一新鲜灭菌离心管中，加1/6体积的PEG/NaCl，4℃沉淀过夜。

3）4℃14,000rpm15min离心沉淀，倾倒弃去上清，再进行短暂离心1min，吸去残余上清，沉淀为噬菌体。沉淀重悬于1mLTBS中，悬液转入新鲜灭菌离心管，4℃离心5min除去沉淀中残留的菌体细胞碎片。上清转入新鲜灭菌离心管，加1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰浴60min。4℃离心10min，倾倒弃去上清，再进行1min短暂离心，吸去残余上清。

4）沉淀重悬于50μLTBS中，此为噬菌体单克隆扩增产物，测定滴度。扩增产物4℃贮存，3天内使用。

5）制备PU包被的96孔板：将50uL水基聚氨酯PU-116加入到每个孔中。静置24h，烘箱70度烘干4h。再准备一个96孔板进行噬菌体的系列稀释，并对其进行封阻，以避免噬菌体吸附到板上，封阻板4℃封阻1-2h。

6）在单独的封阻板中每孔预先加入100μLTBS/Tween（每排第一孔加入200μL），在每排第一孔中加入10¹²个病毒子，混匀之后取100μL加入到后面一个孔中并混匀。以此稀释到第12个孔。作图计算时将病毒子个数换算成pM（pmol/L）。

7）用100μL,0.1%TBST洗PU包被板6次，每次均倒置平板在干净纸巾上拍甩去洗液。

8）用多通道移液器将每排稀释好的噬菌体加入包被有靶分子的板中。室温震荡作用1hr后用100μL,TBST洗板6次。

9）以1:5,000的比例用TBS稀释HRP标记的抗-M13抗体。每孔加入200μl稀释抗体，室温震荡作用1hr后用100μl,TBST洗板6次。

10）测定过氧化氢酶HRP的量，采用ABST方法：将22mgABTS溶于100ml50mM的柠檬酸钠溶液（pH4.0）中，过滤除菌，将36μl30%的H₂O₂加入21mlABTS贮液中。每孔加200μl底物溶液，室温作用20min之后用1%（w/v）SDS终止反应。

11）将反应液吸出于另一块96孔板中，用酶标仪测定405nm处的吸光度值。

如图2所示，相对亲和性对浓度的关系（正方形线条：亲和噬菌体，三角形线条：对照噬菌体，圆圈线条：原始肽库）噬菌体在PU包被的96孔板中复合Langmuir单层吸附（以Langmuire模型进行模拟，R2﹥0.99），亲和噬菌体的饱和吸附量和亲和常数明显高于对照噬菌体及原始肽库噬菌体。图3为520pM浓度噬菌体的相对亲和性比较图，给出已达饱和吸附量的噬菌体浓度所对应的亲和力（亲和力以肽库吸光度做对照，转化而来，定义肽库吸光度为1），明显可以看出亲和噬菌体在PU包被的96孔板中的亲和性为原始肽库的两倍以上，为对照噬菌体的三倍以上。说明含亲和多肽的噬菌体单克隆较对照噬菌体和原始肽库在PU包被的96孔板中具有很好的选择吸附性，在PU材料界面的吸附量比较大。反映出亲和多肽在PU表面的强吸附性。经计算相对亲和常数K为2.39×1010M-1（公式如下）。

利用原子力显微镜AFM直接观察了展示亲和多肽的噬菌体在PU材料界面上的吸附。将PU包被的盖玻片放入装有含亲和多肽的噬菌体液（TBS）的玻璃瓶中，恒温震荡1hr。震荡后倾去未结合的溶液，并用TBST清洗6次，再用超纯水清洗10次，最后烘箱烘干进行AFM检测。如图4所示，亲和噬菌体在PU材料表面的吸附的AFM图，左侧：清洗后的PU材料表面，右侧：亲和吸附噬菌体后的PU材料表面（白色小斑点对应噬菌体颗粒，图片尺寸：20μm×20μm）。原子力显微镜观察发现经过6次含表面活性剂的溶液和10次超纯水清洗后，可以看见大量噬菌体颗粒依旧稳定附着在聚氨酯涂层表面，由此可见本亲和肽引起的特异性吸附可使大颗粒噬菌体结合在PU材料表面上而不被洗掉。

试验例三：屏蔽蛋白质吸附

1）聚氨酯涂层的制备：聚丙烯酸树脂(Hydroxyl-bearingpolyacrylate,DesmophenA870)和聚异氰酸树脂(Hexamethylenediisocyanate,DesmodurN3600)购自Bayer。称取2.1克聚丙烯酸树脂DesmophenA870于20毫升玻璃瓶中，再加入1.5毫升乙酸正丁酯，强力搅拌(1500rpm)1分钟，加入0.8克聚异氰酸树脂DesmodurN3600，继续搅拌1分钟。将混合物转移加入至水平放置的细胞培养皿中，将预先经过乙醇清洗的盖玻片整体浸入培养皿中的聚氨酯溶液后取出，垂直挂置于通风处10分钟后放入70^oC烘箱，在该温度下放置4小时使涂层聚合完全取出待用。

2）亲和多肽的吸附：首先配置50毫摩尔的Tris盐酸缓冲液含150毫摩尔的氯化钠，并溶解质量分数0.1%的吐温20，获得TBST溶液。将聚氨酯涂层盖玻片浸泡于5毫升TBST溶液中再加入0.02毫克聚氨酯亲和肽粉末并室温保持3小时，对照组不加聚氨酯亲和多肽；取出盖玻片并用TBST溶液反复冲洗3次后再用超纯水反复清洗3次。室温晾干后待用。

3）荧光蛋白的吸附：另一组晾干后的聚氨酯涂层盖玻片直接浸入0.5微克每毫升的绿色荧光蛋白GFP溶液中保持1小时，取出后室温晾干并在倒置荧光显微镜下观察荧光强度（ISO1600，曝光时间为49.92毫秒）。

图5（a图显示明显的绿色，而b图以黑色为主）是亲和多肽对聚氨酯界面屏蔽蛋白质吸附的影响图，其中（a）是未吸附亲和肽的聚氨酯界面，（b）是已吸附亲和肽的聚氨酯界面。预先吸附亲和肽的聚氨酯界面对绿色荧光蛋白GFP存在显著的屏蔽作用。根据荧光强度的变化，我们可以估算出，经过亲和肽表面处理的聚氨酯界面，其蛋白质吸附量交对照下降77.4%。因此，该亲和肽可直接应用于聚氨酯材料的表面蛋白质吸附改性，从而显著降低杂蛋白的吸附提高聚氨酯材料的生物相容性，此改性作用将极大促进聚氨酯材料在生物医药材料领域的应用。

试验例四：亲和多肽改性的聚氨酯界面亲/疏水性

2）亲和多肽的吸附：首先配置50毫摩尔的Tris盐酸缓冲液含150毫摩尔的氯化钠，并溶解质量分数0.1%的吐温20，获得TBST溶液。将聚氨酯涂层盖玻片浸泡于5毫升TBST溶液中再加入0.02毫克聚氨酯亲和肽粉末并室温保持3小时，对照组不加聚氨酯亲和多肽；取出盖玻片并用TBST溶液反复冲洗3次后再用超纯水反复清洗3次，室温晾干后待测。

3）聚氨酯涂层表面水接触角测定：分别往对照聚氨酯涂层和已经吸附亲和多肽的聚氨酯涂层表面滴上一滴约5毫升的超纯水，其电导率小于18MΩ·cm；调节镜头聚焦后记录液滴影像，整个过程在20秒内完成。液滴影像由随机(JCY-3,ShanghaiFangruiInstrumentCo.,Ltd,shanghai,China)所带软件分析读取接触角。

图6是亲和多肽对聚氨酯界面屏蔽蛋白质吸附的影响图，其中（a）是未吸附亲和肽的聚氨酯界面，（b）是已吸附亲和肽的聚氨酯界面。聚氨酯亲和多肽吸附后，聚氨酯材料表面的亲/疏水性发生了显著变化，经多肽吸附界面接触角由66.32度下降至51.73度，使界面疏水性降低亲水性提高；由此可见，亲和肽吸附改性聚氨酯表面为简便快速改善聚氨酯界面的亲/疏水性，避免复杂的化学修饰改性提供了参考方法。

Claims

1.一种聚氨酯材料强力亲和多肽，其特征在于，它是一组包含特异性XHWXFRXWWXPX氨基酸序列的多肽，其中，X表示可选择氨基酸，即包括所有的天然氨基酸。

2.根据权利要求1所述的聚氨酯材料强力亲和多肽，其特征在于，所述含XHWXFRXWWXPX的特异性氨基酸序列，其中第一个X是A、L、I、V、M氨基酸中的任一种；第二个X是D、E氨基酸中的任一种；第三个X是Q、N氨基酸中的任一种；第四个X是Q、N氨基酸中的任一种；第五个X是S、T、Y氨基酸中的任一种。

3.根据权利要求1或2所述的聚氨酯材料强力亲和多肽，其特征在于，所述含XHWXFRXWWXPX的特异性氨基酸序列的多肽直接在各种聚氨酯材料表面和内部的复合应用，包括聚氨酯涂层、聚氨酯颗粒、聚氨酯纤维、聚氨酯薄膜，聚氨酯泡沫等一切聚氨酯基的材料表面和内部。

4.根据权利要求1或2所述的聚氨酯材料强力亲和多肽，其特征在于，所述含XHWXFRXWWXPX的特异性氨基酸序列的多肽与其它功能蛋白质分子融合表达后，在各种聚氨酯材料表面和内部的复合应用，包括聚氨酯涂层、聚氨酯颗粒、聚氨酯纤维、聚氨酯薄膜，聚氨酯泡沫等一切聚氨酯基的材料表面和内部。

5.根据权利要求1或2所述的聚氨酯材料强力亲和多肽，其特征在于，所述含XHWXFRXWWXPX的特异性氨基酸序列的多肽与其它功能蛋白质分子，或与功能性化合物分子通过化学共价交联后，在各种聚氨酯材料表面和内部的复合应用，包括聚氨酯涂层、聚氨酯颗粒、聚氨酯纤维、聚氨酯薄膜，聚氨酯泡沫等一切聚氨酯基的材料表面和内部。

6.根据权利要求1或2所述的聚氨酯材料强力亲和多肽，其特征在于，所述含XHWXFRXWWXPX的特异性氨基酸序列的多肽直接与各种纳微结构材料进行组装；或与其它功能蛋白质分子融合表达或化学交联后，再与各种纳微结构材料进行组装后，在各种聚氨酯材料表面和内部的复合应用，包括聚氨酯涂层、聚氨酯颗粒、聚氨酯纤维、聚氨酯薄膜，聚氨酯泡沫等一切聚氨酯基的材料表面和内部。