CN110294792B - 一种共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯的特异性结合肽及其应用 - Google Patents

一种共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯的特异性结合肽及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种共聚物甲基丙烯酸甲酯‑丙烯酸丁酯的特异性结合肽，其氨基酸序列为SWFPTQKPVADW、SDAKHEIRIQKS或DRGLTILTDDLR。本发明优点在于，利用噬菌体筛选技术对MMA‑BA涂膜进行筛选，得到了该材料的三条特异性结合肽。此类短肽能高效地结合在共聚物表面，将此特异性结合肽序列单独或与其它功能性的化学或生物分子融合后形成的复合功能基团，或纳米结构材料结合，使其自身或整个复合功能基团吸附在甲基丙烯酸甲酯‑丙烯酸丁酯材料材料表面。该特异性结合肽为MMA‑BA的生物偶联提供了有力的实验基础，为开发具有生物活性的MMA‑BA材料提供了新方法，为其在生物传感领域的拓展提供了可能。

Description

一种共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯的特异性结合肽及 其应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，更具体地说，涉及一种共聚物甲基丙烯酸 甲酯-丙烯酸丁酯的特异性结合肽及其应用。
背景技术
荧光纳米光极一直是分析化学研究的重要领域，在生物化学，临床医学和 环境监测等方面有重要的应用前景。与离子指示剂相比，离子选择性纳米光极 无需螯合剂与光学报告物(如发色基团)之间进行直接的化学连接，而是通过 离子载体选择性地识别待检测离子，并用亲脂性pH指示剂(生色离子载体) 用作光学报告物。这种简化使传感器具有优异的选择性、可调节的光学性质和 响应范围。塑化的聚氯乙烯(PVC)或增塑剂(例如癸二酸二异辛酯DOS)是 离子选择性纳米光极常用的膜基质材料。然而，在实际应用中，增塑剂渗析会 导致传感组分的遗失，影响纳米传感器的灵敏度和寿命等响应性能，而且在体 内会引起严重的炎症反应。因而开发生物兼容性好、经久耐用的传感膜基质具 有重要的意义。
甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯，简称MMA-BA，是一种稳定的具有自增塑 能力的共聚物，可以通过简单的自由基聚合的方法制得，具有良好的粘附性和 生物相容性。通过组合单体MMA和BA的数量合成不同单体比例的聚合物， 以此改变该共聚物的玻璃转化温度(Tg)，从而获得不同物理和机械性质的聚 合物材料。根据已有的研究报道，该共聚物不仅具有一定的抗菌作用，而且在 电化学等分析传感领域也有重要的应用，可有效减少反应成分的损失，提高传 感器的寿命。文献报道基于MMA-BA的离子选择性传感膜不但具有与传统的 PVC和DOS制备的传感膜相似的物理和机械性能，而且传感器的寿命大大提 高了。并且其它传感组分，例如离子选择性载体或生色离子载体，经过价健修 饰以后，易共价固定于共聚物中。
鉴于MMA-BA诸多的优点，为进一步拓宽其在生物传感等方面的应用， 本发明以合成的MMA-BA为靶分子，采用噬菌体展示技术筛选其特异性结合 的多肽序列，以期得到对MMA-BA具有一定结合能力的多肽序列，为开发具 有生物活性的MMA-BA材料提供了温和、高效的方法，并为拓展MMA-BA 在生物传感领域提供了可能。
发明内容
本发明的第一个目的在于，提供一种能高效地结合在甲基丙烯酸甲酯-丙 烯酸丁酯材料表面的共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯的特异性结合肽。
本发明的第二个目的在于，提供共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯的特 异性结合肽的应用，将上述特异性结合肽序列单独或与其它功能性化学或生物 基团，或纳微结构的材料结合，形成复合功能基团或纳米级材料，可使其自身 或整个基团或颗粒吸附在甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯材料表面。
为了实现上述目的，本发明提供了一种共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁 酯的特异性结合肽，其特征在于，其氨基酸序列为SWFPTQKPVADW(SEQ ID NO.1)、SDAKHEIRIQKS(SEQ ID NO.2)或者DRGLTILTDDLR(SEQ ID NO.3)。
为了实现本发明第二个目的，本发明提供了共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯 酸丁酯的特异性结合肽在与共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯材料结合中的 应用。
作为一个优选方案，所述共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯材料包括但 不限于共聚物颗粒、共聚物纤维、共聚物薄膜和共聚物泡沫。
以及，共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯的特异性结合肽在制备荧光纳 米光极中的应用。
本发明的优点在于，利用噬菌体筛选技术对MMA-BA涂膜进行筛选，得 到了该材料的三条特异性结合肽。该短肽分子自身不仅能高效地结合在共聚物 材料表面，形成特殊多肽分子覆盖的共聚物材料界面；也可以利用该结合肽介 导各种活性的化合物分子、生物活性分子和各种纳微结构的功能性材料在甲基 丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯材料表面的结合。该特异性结合肽为MMA-BA的生物 偶联提供了有力的实验基础，为开发具有生物活性的MMA-BA材料提供了新 方法，为其在生物传感领域的拓展提供了可能。
附图说明
图1.共聚物MMA-BA的玻璃转化温度(Tg)。
图2.特异性结合肽序列中出现的多种氨基酸的频率比较。
图3.筛选获得三种不同噬菌体的吸附曲线。
图4. 1600pM时，三种噬菌体分别对共聚物MMA-BA涂层的结合力比较。
图5.共聚物MMA-BA的特异性结合肽中各氨基酸残基的亲疏水性比较。
图6.共聚物MMA-BA的物理性质。
图7.三次筛选过程中共聚物MMA-BA结合噬菌体克隆的富集情况比较。
图8.共聚物MMA-BA特异性结合肽的氨基酸序列。
图9.共聚物MMA-BA特异性结合肽的等电点及亲疏水性分析。
具体实施方式
以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是， 以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限 制。
实施例1.MMA-BA的特异性结合肽的筛选
实验材料、试剂及主要仪器
1.实验试剂
MMA-BA合成过程中用到的甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸丁酯以及制备纳米 颗粒的生色离子载体(ETH 5234)和四氢呋喃(THF)均购自Sigma-Aldrich (德国)，无水硫酸钠、乙酸乙酯、偶氮二异丁腈(AIBN)、环二氧己烷和二 氯甲烷购自麦克林生化科技有限公司(上海)。
噬菌体筛选过程使用的噬菌体十二肽试剂盒购自NEB有限公司(美国)， M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒购自昊鑫生物科技有限公司(杭 州)，配制过程中所用的溶剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯 -3-吲哚-β-D-吡喃半乳糖苷(X-gal)、四环素均购自翊圣生物科技有限公司(上 海)，柠檬酸钠、三羟基甲基氨基甲烷(Tris)、聚乙二醇8000、氯化钠、氯化 钾、30％过氧化氢、盐酸、甘氨酸均购自凌峰化学试剂有限公司(上海)，吐 温-20(Tween-20)购自生工生物工程有限公司(上海)。
2.实验仪器
差示扫描量热分析仪DIAMOND DSC(上海铂金埃尔默)测定合成的 MMA-BA的玻璃转化温度；凝胶渗透色谱Waters 1515(美国Waters)测定其 分子量；酶联免疫吸附(ELISA)过程使用Synergy 2多功能酶标仪(美国Biotek) 测定96孔板的吸光值。
3.实验步骤
3.1 MMA-BA材料的合成与表征
MMA-BA根据已报道的文献进行合成(Qin,Y.；Peper,S.；Bakker,E.,Plasticizer-free polymer membrane ion-selective electrodes containing amethacrylic copolymer matrix.Electroanal 2002,14(19-20),1375-1381.)。通过热 引发自由基溶液聚合合成甲基丙烯酸共聚物。MMA与BA的合成比例为1:3， 每种单体单元加入5mL无水乙酸乙酯。用N2鼓吹溶液10min后，加入3.4mg AIBN。溶液搅拌均匀后升温至85℃，保持16h。反应完成后，蒸发溶剂，将 聚合物再溶于10mL环二氧己烷中。在剧烈搅拌下，将聚合物溶液逐滴加入 800mL去离子水中。收集白色沉淀并溶于25mL二氯甲烷中，然后用无水Na2SO4除去水并过滤。蒸发溶剂，得到透明的聚合物。最后确定合成后的材料 进行玻璃转化温度及分子量。
3.2 MMA-BA涂层的制备
在5mL的玻璃瓶配置20mg/mL的MMA-BA溶液，溶剂为四氢呋喃，溶 解备用。吸取250μL上述溶液加到25mm的细胞培养板中，置于通风处干燥， 使溶剂挥发干。
3.3 MMA-BA的特异性结合肽的筛选
(1)在MMA-BA的平板中加满封阻液，4℃封阻2h后用TBST(0.1％) 快速洗板6次。
(2)用400μL的相同浓度的TBST缓冲液稀释10μL的原始肽库，加到 封阻后的平板中，30℃温和摇动60min后弃去未结合的噬菌体后再次用相同 浓度的TBST缓冲液洗板10次。
(3)采用非特异性缓冲液Gly-HCl(0.2M,pH 2.2,1mg/mL BSA)分离平板 上结合的噬菌体，温和摇动20min后，收集洗脱液后加入60μL 1M的Tris-HCl 中和缓冲液(pH 9.1)。
(4)测定噬菌体滴度：取10μL的噬菌体加入到200μL对数中期的 ER2738培养物中混匀静置2min，然后再加到3mL上层琼脂中，每个噬菌体 稀释度对应一管，10倍梯度稀释4管。然后将上层琼脂加入37℃预温的 LB/IPTG/Xgal平板上均匀铺开，倒置于37℃培养箱中培养过夜。18小时内取 出平板，计数有约100个噬菌斑上的平板上的蓝斑数，此数目乘以稀释因子得 到10μL噬菌体对应的噬菌体滴度(pfu)。
(5)洗脱噬菌体的扩增：取洗脱下来的噬菌体10μL加入对数前期的 ER2738培养液中，继续培养5h，然后将培养物离心两次后取上清80％加入 1/6体积的20％PEG/NaCl，4℃过夜后离心，将沉淀重悬后加入20％PEG/NaCl 进行再沉淀，冰上作用60min后，沉淀重悬于200μL TBS中，测定扩增后的 噬菌体滴度(范围10-8-10-11)。
(6)接下来进行第二、三轮筛选：用第一轮扩增得到的噬菌体计算2×1011 pfu的加入量重复步骤(1)-(5)，将Tween浓度调整到0.3％(w/v)。
(7)噬菌斑的扩增：挑取第三轮洗脱物测定滴度的平板上的蓝色噬菌斑 于1mL的生长前期的含菌培养基中，培养5h后，4℃，14000rpm离心30s， 取上清的80％转至无菌EP管中，置于4℃冰箱中备用。
(8)按照M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒的说明书方法提 取纯化筛选噬菌斑的DNA，然后送至上海擎科生物技术有限公司测序。
3.4噬菌体的DNA测序
(1)采用-96通用引物进行自动测序；
(2)按照NEB噬菌体肽库的说明书对测序结果进行分析，找到随机12 肽的基因编码区，并转化为相应的氨基酸序列。
3.5特异性多肽的结合能力的ELISA验证
按照之前的方法取待鉴定的噬菌体10μL加入对数前期的ER2738培养液 中进行扩增并纯化，最后重悬于50μL TBS中再测滴度，之后进行ELISA鉴 定。按照筛选过程中的方法对96孔板进行MMA-BA涂膜包被，包被浓度20 mg/mL，体积50μL。然后用0.5％的脱脂奶粉进行封阻2h后，洗板6次(0.3％ TBST)后加入待鉴定的噬菌体贮液并进行4倍系列稀释，室温震荡作用2h 后再次洗板6次，每孔加入200μL辣根过氧化物酶标记的抗M13抗体，室温 作用1h后洗板6次加入显色底物200μL/孔，室温作用40min。用酶标仪测 定96孔板405nm处每孔的吸光值。计算每条序列对应的结合力。
4.结果与讨论
4.1共聚物MMA-BA的物理性质的表征
玻璃转化温度是指高聚物无定形部分从冻结状态到解冻状态的一种松弛 现象。有研究表明玻璃转化温度是关系基质材料成膜的重要性质8。如图1所 示，通过DSC测定表明，该材料的玻璃转化温度大致在-26.8℃。凝胶渗透色 谱实验结果表明合成MMA-BA的平均分子量为15487(图6)。
4.2 MMA-BA的特异性多肽的筛选结果分析
筛选过程使用噬菌体十二肽库，共进行三轮，每轮加入相同量的噬菌体病 毒:1.5×1011pfu，TBST中Tween-20的浓度逐渐由0.1％提高到0.3％，回收的 洗脱噬菌体滴度由第一轮的2.5×10-7逐渐提高到6.1×10-6，回收率也得到明显 提高(图7)。筛选过程表明，随着筛选压力不断增加，结合性噬菌体不断在 MMA-BA表面得到了大量的富集。
经过三轮筛选，挑取第三轮平板上的蓝色噬菌斑扩增后进行测序，分析测 序结果可见，得到三条特异性结合MMA-BA的多肽序列，如图8，分别为 SWFPTQKPVADW(B1 SEQ IDNO.1)，SDAKHEIRIQKS(B2 SEQ ID NO.2)， DRGLTILTDDLR(B3 SEQ ID NO.3)。
如图2所示，通过分析三条特异性结合肽中含有的氨基酸残基，得出天冬 氨酸(D)出现的频次最高，表明天冬氨酸与MMA-BA具有较大的结合作用。 天冬氨酸可以提供质子，可能和含有大量羰基的共聚物MMA-BA的形成氢键， 这与之前报道的氢键能够影响多肽与蛋白之间的相互作用一致(Baniukevic,J.； Kirlyte,J.；Ramanavicius,A.；Ramanaviciene,A.,Application of oriented and random antibody immobilizationmethods in immunosensor design.Sens.Actuator B-Chem.2013,189,217-223.)。我们猜测筛选得到的三条多肽可能主要是通过 氢键作用和靶分子MMA-BA结合在一起。
4.3酶联免疫吸附实验(ELISA)验证结合力
酶联免疫吸附实验是用来测定多肽分子和靶分子之间结合力的常用方法。 筛选得到的M13噬菌体扩增后首先与靶分子表面进行相互作用，然后经过辣 根过氧化物酶(HRP)标记的抗M13抗体与作用后的M13噬菌体表达的筛选 多肽进行结合，通过加入显色底物测定其在405nm处的吸光值，同时以原始 肽库作为对照。如图3所示，随着噬菌体浓度的提高，显色底物在405nm处 的吸光度逐渐提高，表明噬菌体展示的多肽在MMA-BA涂层表面吸附量也越 来越高。以达到稳定后的原始肽库的吸光值(设为1)为基准，计算筛选的三 条多肽对MMA-BA涂层的相对结合力。如图4所示，在三条多肽中，序列B3 对MMA-BA的结合能力最强，B1的结合能力最小。他们的相对结合力大小顺 序为：B3>B2>B1。图5为经过强耀生物多肽计算器分析了三条特异性结合肽 中各氨基酸残基的亲疏水性，并得到了各条多肽的平均亲水性和等电点，平均 亲水性数值越大，表示亲水性越强，如图9所示，三条序列的亲水能力的强弱 顺序为：B2>B3>B1，等电点高低顺序为：B2>B1>B3。
5.结论
综上来说，我们成功制备了具有自增塑能力的共聚物MMA-BA，并通过 差示扫描量热仪和分子量凝胶色谱表征了该材料的玻璃转化温度和平均分子 量。同时利用噬菌体筛选技术对MMA-BA涂膜进行筛选，得到了该材料的三 条特异性结合肽。通过酶联免疫吸附实验验证了这三条多肽对共聚物的结合力 如下：DRGLTILTDDLR>SDAKHEIRIQKS>SWFPTQKPVADW。此外，三条序 列中的SDAKHEIRIQKS的亲水性最强，等电点最高。该特异性结合肽为 MMA-BA的生物偶联提供了有力的实验基础，为其在生物传感领域的拓展提 供了可能。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通 技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些 改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东理工大学
<120> 一种共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯的特异性结合肽及其应用
<130> /
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Ser Trp Phe Pro Thr Gln Lys Pro Val Ala Asp Trp
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Ser Asp Ala Lys His Glu Ile Arg Ile Gln Lys Ser
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Asp Arg Gly Leu Thr Ile Leu Thr Asp Asp Leu Arg
1 5 10

Claims (4)

1.一种共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯的特异性结合肽，其特征在于，其氨基酸序列为SWFPTQKPVADW、SDAKHEIRIQKS或DRGLTILTDDLR。
2.权利要求1所述的共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯的特异性结合肽在与共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯材料结合中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯材料包括但不限于共聚物颗粒、共聚物纤维、共聚物薄膜和共聚物泡沫。
4.权利要求1所述的共聚物甲基丙烯酸甲酯-丙烯酸丁酯的特异性结合肽在制备荧光纳米光极中的应用。
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