CN105175491B - 一种含有羟脯氨酸骨架的多肽类ns3丝氨酸蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有羟脯氨酸骨架的多肽类组NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用。该系列化合物具有通式(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的结构，本发明还提供了该化合物的制备方法，以及化合物在制备预防或治疗与HCV感染相关疾病的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种衍生物及其制备方法与应用，具体涉及一种含有羟脯氨酸骨架的多肽类NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂及其制备方法和应用,属于有机化合物合成与医药应用技术领域。
背景技术
丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的严重的肝脏疾病，主要通过血液传播。HCV可以引发肝炎，从而导致严重的肝脏疾病，如急性肝炎，肝硬化，肝癌，也是造成肝移植的主要原因。据世界卫生组织统计，全球估计约1.8亿人感染了HCV，感染率约为3％，已经成为严重的社会和公共卫生问题。
丙型肝炎病毒(HCV)是一种单股、正链RNA病毒，属于黄病毒科(Flaviviridae)肝炎病毒属。HCV－RNA大约由9500－10000bp组成，能编码一个长3014个氨基酸的多聚蛋白前体，经宿主细胞和病毒自身蛋白作用裂解为多个结构蛋白和非结构蛋白(NS)。其中NS3在此过程中发挥了重要作用，主要参与四个区域的切割：NS3/4A、NS34A/NS4B、NS4B/NS5A、NS5A/NS5B。而NS4A是一个小分子蛋白，它与NS3相互作用，是其发挥丝氨酸蛋白酶功能所必须的。此外，NS3可以抑制细胞内抗病毒因子的IRF-3的活性，从而帮助病毒减弱或逃避宿主细胞的天然免疫作用。大量科学研究表明，阻断NS3丝氨酸蛋白酶功能将有效抑制HCV的增殖与复制。
在此之前，对慢性丙型肝炎病毒感染的标准治疗方案是聚乙二醇-干扰素α(PEG-IFN)和利巴韦林联合治疗48周，但此方案对基因Ⅰ型慢性丙型肝炎的持续病毒应答率(SVR)仅为40％-50％，对基因Ⅱ型和Ⅲ型慢性丙型肝炎患者的SVR率稍高，均接近80％。此外，该治疗方案会引起严重的副作用且治疗周期较长。
2011年5月，博赛匹韦(boceprevir)或特拉匹韦(telaprevir)与干扰素联合利巴韦林的三联治疗在美国被批准应用于临床，推荐用于基因型为Ⅰ型的HCV感染者，可提高治愈率。自此，HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂已经成为HCV治疗的重要组成部分，也成为抗HCV药物领域的研究热点。截至目前，已经有大量的强效的NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂被报道，部分已经进入临床研究阶段。但这些抑制剂大都毒副作用较强且耐受性差，所以开发特异有效、副作用小的抗NS3蛋白酶抑制剂势在必行。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种含羟脯氨酸骨架的多肽类NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂，本发明还提供了上述化合物的制备方法和用途。
本发明的技术方案为：
一、含羟脯氨酸骨架的多肽类NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂
本发明的含羟脯氨酸骨架的多肽类NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂，以及其光学异构体、非对映异构体和消旋体混合物，其药学上可接受的盐，溶剂合物或前药，具有如下通式I或Ⅱ所示的结构：
其中：
R1是氢、各种氨基酸侧链烷基、芳基、杂芳基；
R2是氢、C1-4烷基、环丙基、各种取代的芳基；
R3是氢、各种氨基酸侧链烷基、芳基、杂芳基；
R4是叔丁氧基、苄氧基、异丙基、芳基、杂芳基；
R5是各种邻位、对位取代的芳基、萘基；
*是立体构型为S或R光学纯度或其消旋体。
优选的，R1是C1-C6烷基、氨基酸侧链烷基；R2是环丙基、取代的苯基；R3是C1-C6烷基、苄基；R4是叔丁氧基、苄氧基、异丙基杂芳基；R5是邻位取代的苯基。
更为优选的，上述化合物是下列之一：
(2S,4S)-1-((S)-2-环己基-2-(噻吩-2-甲酰胺基)乙酰基)-N-((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺(A1)、
(2S,4S)-1-((S)-2-(呋喃-2-甲酰胺基)-3,3-二甲基丁基)-N-((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺(A2)、
(2S,4S)-1-((S)-2-苯甲酰基-2-环己基)-N-((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺(A3)、
叔丁基((S)-1-((2S,4S)-2-(((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲酸酯(A4)、
(2S,4S)-1-((S)-2-异丁酰胺基-3-苯丙酰基)-N-((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺(A5)、
叔丁基((S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-((2S,4S)-2-(((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-1-氧丙-2-基)氨基甲酸酯(A6)、
叔丁基((S)-3,3-二甲基-1-((2S,4S)-2-(((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-1-氧代丁基-2-基)氨基甲酸酯(A7)、
苄基((S)-1-环己基-2-((2S,4S)-2-(((R)-1-(环丙磺酰胺基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)氨基甲酸酯(B1)、
叔丁基((S)-1-环己基-2-((2S,4S)-2-(((R)-1-(环丙磺酰胺基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)氨基甲酸酯(B2)、
(2S,4S)-1-((S)-2-苯甲酰基-2-环己基乙酰基)-N-((R)-1-(环丙甲酰胺基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺(B3)、
(2S,4S)-1-((S)-2-环丙基-2-异丁酰胺基乙酰基)-N-((R)-1-(环丙磺酰胺基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺(B4)、
叔丁基((S)-1-((2S,4S)-2-(((R)-1-(环丙磺酰胺基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-4-甲基-1-氧戊烷-2-基)氨基甲酸酯(B5)、
叔丁基((S)-1-((2S,4S)-2-(((R)-1-(环丙磺酰胺基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基吡咯烷-1-基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲酸酯(B6)、
叔丁基((S)-1-((2S,4S)-2-(((R)-1-(环丙磺酰胺基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-3,3-d二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(B7)、
叔丁基((S)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(环丙磺酰胺基)-4-甲基-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(4-甲氧基苯甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(C1)、
叔丁基((S)-1-((2S,4S)-4-(2-萘甲酰胺基)-2-(((S)-1-(环丙磺酰胺基)-4-甲基-1-氧丙烷-2-基)氨基甲基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(C2)、
叔丁基((S)-1-((2S,4S)-2-(((S)-1-(环丙磺酰胺基)-4-甲基-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(2-((2,3-二甲基苯基)氨基)本甲酰胺基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(C3)、
叔丁基((2S)-1-((4S)-4-((7H-嘌呤-6-基)氨基)-2-(((R)-2-(环丙磺酰胺基)-3-苯丙酰基)氨基甲基)吡咯烷-1-基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲酸酯(D1)。
二、含羟脯氨酸骨架的多肽类NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法
本发明的含羟脯氨酸骨架的多肽类NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，步骤如下：
以N-Boc-L-羟脯氨酸甲酯为起始原料，经甲磺酰化、叠氮钠取代生成中间体2，按“点击化学”方法，用硫酸铜为催化剂得到1,4位取代的三氮唑中间体3，中间体4是通过N-Boc保护的氨基酸与取代的磺酰胺用氯甲酸异丁酯与NaH反应生成；将中间体3与中间体4缩合生成中间体5，继而与其他取代的氨基酸缩合后生成终产物A1-A7、B1-B7；中间体2用钯碳/氢气还原后得到含氨基的中间体6，与Boc保护的氨基酸或羧酸缩合为酰胺，继而得到终产物C1-C3；或者将氨基与6-氯嘌呤反应得到中间体9继而得到终产物D1；
反应式如下：
其中，R1-R5，如上述通式I或Ⅱ中所述；
上述反应式中的试剂和条件：(a)ⅰ)二氯甲烷，甲磺酰氯，三乙胺室温；ⅱ)叠氮钠，N，N-二甲基甲酰胺，80℃；(b)苯乙炔，硫酸铜，抗坏血酸，乙醇/水，室温；(c)钯碳，氢气；(d)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯丙三唑，N-甲基吗啉，二氯甲烷，室温；(e)乙酸乙酯的饱和氯化氢溶液；(f)氢氧化钠，甲醇/水；(g)6-氯嘌呤，三乙胺，正丁醇，回流。
以化合物A1和C3为例，具体制备步骤如下：
(2S,4S)-1-((S)-2-环己基-2-(噻吩-2-甲酰胺基)乙酰基)-N-((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺(A1)的制备方法，步骤如下：
(1)(2S，4S)-1-叔丁基-2-甲基4-叠氮基吡咯烷-1,2-二羧酸酯的制备
将N-Boc-L-羟脯氨酸甲酯2.45g和三乙胺2.02g溶于二氯甲烷50mL中，滴加甲磺酰氯1.72g后室温搅拌过夜，TLC检测反应完全；减压蒸除二氯甲烷后，残留物用乙酸乙酯溶解，反应液用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液100mL洗涤三次，饱和氯化钠溶液洗涤100mL洗涤三次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂，得到粗产物；将此粗产物溶于20mLN,N-二甲基甲酰胺后，加入叠氮钠3.3g，反应液于80℃加热过夜，反应完全；将反应液冷却至室温，加水稀释后用乙酸乙酯萃取50mL萃取3次，合并有机相，无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂后得到产物为黄色油状物1.92g,产率:70.3％；
(2)(2S,4S)-1-(叔丁氧羰基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-羧酸的制备
将化合物22.72g溶于乙醇：水1:150mL溶液中，加入抗坏血酸0.18g和催化量硫酸铜后，滴加苯乙炔1.53g,反应液在室温条件下搅拌过夜后，TLC检测反应完全；将反应液用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液100ml洗3次，饱和氯化钠溶液100ml洗涤3次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂；将得到的产物溶于甲醇：水1:150mL溶液中，加入氢氧化钠0.8g，室温反应半小时，将反应液用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂后，通过柱纯化乙酸乙酯/石油醚2:1得到化合物3，为白色固体2.63g,产率:73.5％；
(3)(S)-2-氨基-4-甲基-N-甲苯磺酰基戊酰胺的制备
将N-Boc-L-环己基甘氨酸0.69g,N-甲基吗啉0.61g溶于无水四氢呋喃20mL，搅拌15分钟后缓慢滴加氯甲酸异丁酯0.45g，反应液于-20℃反应一小时得反应液A；将对甲苯磺酰胺0.62g和氢化钠0.36g于无水四氢呋喃中搅拌4小时得反应液B，将反应液A冰浴条件下滴进B中，室温反应过夜；蒸除溶剂后，将残余物溶于乙酸乙酯中，用1摩尔/升稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液各100mL洗涤3次；有机相用无水无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂；将所得产物溶于乙酸乙酯的饱和氯化氢溶液中，搅拌4小时，将反应液过滤即得化合物4a，为白色固体0.69g,产率：82.1％；
(4)(2S,4S)-叔丁基-2-(((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-羧酸酯的制备
将化合物30.72g与N-甲基吗啉0.61g溶于二氯甲烷50mL,加入1-羟基苯并三唑0.32g和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.49g后室温搅拌半小时，然后加入化合物4a搅拌过夜；蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液各100mL洗涤3次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂；粗品经柱纯化乙酸乙酯/石油醚1:1后得到化合物5a，为白色固体0.58g,产率:46.2％；
(5)叔丁基((S)-1-环己基-2-((2S,4S)-2-(((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)氨基甲酸酯的制备
将N-Boc-环己基甘氨酸0.26g与N-甲基吗啉0.15g溶于二氯甲烷20mL，加入1-羟基苯并三唑0.16g和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.23g后室温搅拌半小时；将化合物5a溶于乙酸乙酯的饱和氯化氢10mL溶液中，搅拌4小时，将反应液过滤即得白色固体，然后将此固体0.56g加入反应液中搅拌过夜；蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液各100mL洗涤3次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂；粗品经柱纯化石油醚/乙酸乙酯1:1后得到化合物，为白色固体0.41g,产率:53.1％；
(6)(2S,4S)-1-((S)-2-环己基-2-(噻吩-2-甲酰胺基)乙酰基)-N-((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺的制备(A1)
将噻吩甲酸0.13g与N-甲基吗啉0.15g溶于二氯甲烷20mL,加入1-羟基苯并三唑0.16g和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.23g后室温搅拌半小时；将上步所得化合物溶于乙酸乙酯的饱和氯化氢10mL溶液中，搅拌4小时，将反应液过滤即得白色固体，然后将此固体0.66g加入反应液中搅拌过夜；蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液各100mL洗涤3次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂；粗品经柱纯化石油醚/乙酸乙酯1:1后得到化合物，为白色固体0.36g,产率:46.4％。
叔丁基((S)-1-((2S,4S)-2-(((S)-1-(环丙磺酰胺基)-4-甲基-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(2-((2,3-二甲基苯基)氨基)本甲酰胺基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(C3)的制备方法，步骤如下：
(1)(2S,4S)-1-叔丁基-2-甲基-4-氨基吡咯烷-1,2-二羧酸酯的制备
将化合物22.72g溶于甲醇100ml，缓慢加入10％钯碳，室温下氢气还原过夜反应完全，过滤，蒸除溶剂后得到化合物6，为黄色油状物2.1g,产率：87.5％；
(2)(2S,4S)-1-叔丁氧羰基-4-(2-((2,3-二甲基苯基)氨基)苯甲酰基)吡咯烷-2-羧酸的制备
将甲灭酸0.48g与N-甲基吗啉0.31g溶于二氯甲烷40mL,加入1-羟基苯并三唑0.32g和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.49g后室温搅拌半小时；将化合物60.48g加入反应液中搅拌过夜；蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液各100ml洗涤3次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂；粗品经柱纯化石油醚/乙酸乙酯2:1后得到化合物7c，为白色固体0.53g,产率:56.8％；
(3)(2S,4S)-叔丁基-2-(((S)-1-(环丙磺酰胺基)-4-甲基-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(2-((2,3-二甲基苯基)氨基)苯甲酰基)吡咯烷-1-羧酸酯的制备
将化合物7c溶于甲醇：水1:150mL中，加入氢氧化钠固体，室温反应半小时，将反应液用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂后得到白色固体；将此白色固体0.45g与N-甲基吗啉0.15g溶于二氯甲烷20mL,加入1-羟基苯并三唑0.16g和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.23g后室温搅拌半小时；将(S)-2-氨基-N-(环丙磺酰胺基)-4-甲基戊酰胺盐酸盐0.27g加入反应液后搅拌过夜；蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液各100ml洗涤3次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂后得到化合物8c，为白色固体0.37g,产率:55.6％；
(4)叔丁基((S)-1-((2S,4S)-2-(((S)-1-(环丙磺酰胺基)-4-甲基-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(2-((2,3-二甲基苯基)氨基)本甲酰胺基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯的制备
将N-Boc-叔亮氨酸0.12g与N-甲基吗啉0.08g溶于二氯甲烷10mL,加入1-羟基苯并三唑0.08g和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.12g后室温搅拌半小时；将化合物8c溶于乙酸乙酯的饱和氯化氢10mL溶液中，搅拌4小时，将反应液过滤即得白色固体，然后将此固体0.29g)加入反应液中搅拌过夜；蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液各100ml洗涤3次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂；粗品经柱纯化石油醚/乙酸乙酯1:1后得到化合物C3，为白色固体0.19g,产率：46.6％。
目标化合物的结构式如下所示：
所述化合物的具体制备步骤在实施例中将加以详细说明。
本领域技术人员可以对上述步骤进行变动以提高收率，他们可据本领域的基本知识确定合成的路线，如选择反应物，溶剂和温度，可以通过使用各种常规保护基以避免副反应的发生从而提高收率。这些常规的保护方法可参见例如T.Greene,Protecting Groupsin Organic Synthesis.
发明详述
本文中所用的术语和定义含义如下：
“各种氨基酸侧链烷基”是指将各种氨基酸本身所代的基团，优选疏水性氨基酸，如环己基甘氨酸，叔亮氨酸，亮氨酸，苯丙氨酸，异亮氨酸，羟脯氨酸，色氨酸。
“芳基”是指含有芳香族碳环的基团，优选的芳环含有6-10个碳原子。
“杂芳基”指含有芳族杂环的基团，可以是单环或双环基团。较佳的杂芳基包括噻吩基，呋喃基，吡咯基，吡啶基，吡嗪基，噻唑基，嘧啶基，喹啉基以及四氮唑基，苯并噻唑基，苯并呋喃基，吲哚基等。
对化合物的抑酶活性的评价，我们采用文献报道的经典方法，HCV NS3/NS4A 1b的酶反应体系由HCV NS3/NS4A 1b酶、牛血清蛋白(BSA)、HCV NS3/NS4A 1b特异性荧光底物、反应缓冲液等组成，然后在多功能酶标仪下检测荧光信号。
三、含羟脯氨酸骨架的多肽类NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂的应用
活性筛选实验显示本发明化合物具有良好的体外NS3丝氨酸蛋白酶抑制活性，因此，本发明还提供化合物在制备预防或治疗与HCV感染相关疾病的药物中的应用；所述的与HCV感染相关疾病包括：急、慢性丙型肝炎，肝硬化，肝癌。
一种预防或治疗与HCV感染相关疾病的药物组合物，包含本发明所述的含羟脯氨酸骨架的多肽类NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但不限于此。
实施例1：化合物A1-B7的合成，以A1为例。
1)(2S，4S)-1-叔丁基-2-甲基4-叠氮基吡咯烷-1,2-二羧酸酯的制备(2)
将N-Boc-L-羟脯氨酸甲酯(2.45g,10.0mmol)和三乙胺(2.02g,20.0mmol)溶于二氯甲烷(50mL)中，缓慢滴加甲磺酰氯(1.72g,15.0mmol)后室温搅拌过夜，TLC检测反应完全。减压蒸除二氯甲烷后，残留物用乙酸乙酯溶解，反应液用1M稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液(3×100ml)，饱和氯化钠溶液(3×100ml)洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂，得到粗产物。将此粗产物溶于20mL N,N-二甲基甲酰胺后,加入叠氮钠(3.3g,50.0mmol)，反应液于80℃加热过夜，反应完全。将反应液冷却至室温，加水稀释后用乙酸乙酯萃取(50mL×3)，合并有机相，无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂后得到产物为黄色油状物(1.92g,产率:70.3％)。
2)(2S,4S)-1-(叔丁氧羰基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-羧酸的制备(3)
化合物2(2.72g,10.0mmol)溶于乙醇：水(1:1)(50mL)中，加入抗坏血酸(0.18g,1.0mmol)和催化量硫酸铜后，缓慢滴加苯乙炔(1.53g,15.0mmol),反应液在室温条件下搅拌过夜后，TLC检测反应完全。将反应液用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用1M稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液(3×100ml)，饱和氯化钠溶液(3×100ml)洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂。将得到的产物溶于甲醇：水(1:1)(50mL)中，加入氢氧化钠(0.8g,20.0mmol)，室温反应半小时，将反应液用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂后，通过柱纯化乙酸乙酯/石油醚(2:1v/v)得到化合物3，为白色固体(2.63g,产率:73.5％)。1H-NMR(600MHz,DMSO):δ12.79(brs,1H),8.74(d,1H,J＝7.8),7.85(d,2H,J＝7.8),7.45(t,2H,J＝7.8),7.34(t,1H,J＝7.8),5.28–5.25(m,1H),4.32–4.29(m,1H),4.09–4.06(m,1H),3.78–3.75(m,1H),2.96–2.93(m,1H),2.57–2.50(m,1H),1.43-1.37(m,9H)。
3)(S)-2-氨基-4-甲基-N-甲苯磺酰基戊酰胺(4a)
将N-Boc-L-亮氨酸(0.69g,3.0mmol),N-甲基吗啉(0.61g,6.0mmol)溶于无水四氢呋喃(20mL)，搅拌十五分钟后缓慢滴加氯甲酸异丁酯(0.45g,3.3mmol),反应液于-20℃反应一小时得反应液A。将对甲苯磺酰胺(0.62g,3.6mmol)和氢化钠(0.36g,9.0mmol)于无水四氢呋喃中搅拌4小时得反应液B，将反应液A冰浴条件下缓慢滴进B中，室温反应过夜。蒸除溶剂后，将残余物溶于乙酸乙酯中，用1摩尔/升稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液(3×100ml)，饱和氯化钠溶液(3×100ml)洗涤。有机相用无水无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂。将所得产物溶于乙酸乙酯的饱和氯化氢(10mL)溶液中，搅拌4小时，将反应液过滤即得化合物4a，为白色固体(0.69g,产率：82.1％)。1H-NMR(400MHz,DMSO):δ8.34(s,3H),7.83(d,2H,J＝8),7.44(d,2H,J＝8),7.34(t,1H,J＝7.8),3.83(s,1H),2.40(s,3H),1.60–1.57(m,1H),1.56–1.50(m,2H),0.84-0.82(m,6H)。
4)(2S,4S)-叔丁基-2-(((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-羧酸酯的制备(5a)
将化合物3(0.72g,2.0mmol)与N-甲基吗啉(0.61g,6.0mmol)溶于二氯甲烷(50mL),加入1-羟基苯并三唑(0.32g,2.4mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.49g,2.4mmol)后室温搅拌半小时，然后加入化合物4a搅拌过夜。蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液(3×100ml)，饱和氯化钠溶液(3×100ml)洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂。粗品经柱纯化乙酸乙酯/石油醚(1:1v/v)后得到化合物5a，为白色固体(0.58g,产率:46.2％)。
1H-NMR(600MHz,DMSO):δ8.69(s,1H),7.86(d,2H,J＝7.2),7.575-7.550(m,3H),7.32(d,2H,J＝7.2),7.06-7.05(m,2H),5.21-5.20(m,1H),4.34-4.31(m,1H),4.12-4.09(m,1H),4.00(s,1H),3.67-3.64(m,1H),2.90-2.89(m,1H),2.50-2.39(m,1H),2.23(s,3H),1.57(s,1H),141–1.25(m,11H),0.80-0.78(m,6H)。
5))叔丁基((S)-1-环己基-2-((2S,4S)-2-(((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)氨基甲酸酯的制备
将N-Boc-环己基甘氨酸(0.26g，1mmol)与N-甲基吗啉(0.15g,1.5mmol)溶于二氯甲烷(20mL),加入1-羟基苯并三唑(0.16g,1.2mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.23g,1.2mmol)后室温搅拌半小时。将化合物5a溶于乙酸乙酯的饱和氯化氢(10mL)溶液中，搅拌4小时，将反应液过滤即得白色固体，然后将此固体(0.56g,1mmol)加入反应液中搅拌过夜。蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液(3×100ml)，饱和氯化钠溶液(3×100ml)洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂。粗品经柱纯化石油醚/乙酸乙酯(1:1v/v)后得到目标化合物，为白色固体(0.41g,产率:53.1％)。
6)(2S,4S)-1-((S)-2-环己基-2-(噻吩-2-甲酰胺基)乙酰基)-N-((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺的制备(A1)
将噻吩甲酸(0.13g，1mmol)与N-甲基吗啉(0.15g,1.5mmol)溶于二氯甲烷(20mL),加入1-羟基苯并三唑(0.16g,1.2mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.23g,1.2mmol)后室温搅拌半小时。将化合物5a溶于乙酸乙酯的饱和氯化氢(10mL)溶液中，搅拌4小时，将反应液过滤即得白色固体，然后将此固体(0.66g,1mmol)加入反应液中搅拌过夜。蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液(3×100ml)，饱和氯化钠溶液(3×100ml)洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂。粗品经柱纯化石油醚/乙酸乙酯(1:1v/v)后得到目标化合物，为白色固体(0.36g,产率:46.4％)。mp＝153-154℃,1H-NMR(300MHz,DMSO):δ11.90(s,1H),8.843(d,1H,J＝7.2),8.761(s,1H),8.01(dd,1H,J＝3.6,J＝0.9),7.90-7.87(m,3H),7.84-7.73(m,2H),7.63(d,2H,J＝8.1),7.46(t,2H,J＝1.5),7.36-7.27(m,4H),7.18-7.13(m,1H),5.33-5.30(m,1H),4.56-4.50(m,2H),4.45-43.35(m,2H),3.98-3.93(m,1H),2.89-2.80(m,1H),2.45-2.39(m,1H),2.32-2.27(m,4H),1.96-1.92(m,2H),1.72-1.66(m,4H),1.21-1.15(m,9H),0.88-0.84(m,1H),0.61(d,3H,J＝6.3),0.54(d,3H,J＝6.3).HRMS calcd for C39H48N7O6S2 +[M+H]+774.3102；found:774.3121。
A2-A7，B1-B7的制备方法同A1，只是氨基酸侧链和取代的烷基不同。
实施例2：化合物C1-C3的合成，以C3为例。
1)(2S,4S)-1-叔丁基-2-甲基-4-氨基吡咯烷-1,2-二羧酸酯的制备(6)
将化合物2(2.72g,10mmol)溶于甲醇(100ml)，缓慢加入10％钯碳，室温下氢气还原过夜反应完全，过滤，蒸除溶剂后得到化合物6，为黄色油状物(2.1g,产率：87.5％)。
2)(2S,4S)-1-叔丁氧羰基-4-(2-((2,3-二甲基苯基)氨基)苯甲酰基)吡咯烷-2-羧酸的制备(7c)
将甲灭酸(0.48g，2mmol)与N-甲基吗啉(0.31g,3mmol)溶于二氯甲烷(40mL),加入1-羟基苯并三唑(0.32g,2.4mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.49g,2.4mmol)后室温搅拌半小时。将化合物6(0.48g,1mmol)加入反应液中搅拌过夜。蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液(3×100ml)，饱和氯化钠溶液(3×100ml)洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂。粗品经柱纯化石油醚/乙酸乙酯(2:1v/v)后得到化合物7c，为白色固体(0.53g,产率:56.8％)。
3)(2S,4S)-叔丁基-2-(((S)-1-(环丙磺酰胺基)-4-甲基-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(2-((2,3-二甲基苯基)氨基)苯甲酰基)吡咯烷-1-羧酸酯的制备(8c)
将化合物7c溶于甲醇：水(1:1)(50mL)中，加入氢氧化钠固体，室温反应半小时，将反应液用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂后得到白色固体。将此白色固体(0.45g,1mmol)与N-甲基吗啉(0.15g,1.5mmol)溶于二氯甲烷(20mL),加入1-羟基苯并三唑(0.16g,1.2mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.23g,1.2mmol)后室温搅拌半小时。将(S)-2-氨基-N-(环丙磺酰胺基)-4-甲基戊酰胺盐酸盐(0.27g,1mmol)加入反应液后搅拌过夜。蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液(3×100ml)，饱和氯化钠溶液(3×100ml)洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂后得到化合物8c，为白色固体(0.37g,产率:55.6％)。
4)叔丁基((S)-1-((2S,4S)-2-(((S)-1-(环丙磺酰胺基)-4-甲基-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(2-((2,3-二甲基苯基)氨基)本甲酰胺基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯的制备(C3)
将N-Boc-叔亮氨酸(0.12g，0.5mmol)与N-甲基吗啉(0.08g,0.8mmol)溶于二氯甲烷(10mL),加入1-羟基苯并三唑(0.08g,0.6mmol)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.12g,0.6mmol)后室温搅拌半小时。将化合物8c溶于乙酸乙酯的饱和氯化氢(10mL)溶液中，搅拌4小时，将反应液过滤即得白色固体，然后将此固体(0.29g,0.5mmol)加入反应液中搅拌过夜。蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液(3×100ml)，饱和氯化钠溶液(3×100ml)洗涤。有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂。粗品经柱纯化石油醚/乙酸乙酯(1:1v/v)后得到化合物C3，为白色固体(0.19g,产率:46.6％)。mp＝131-132℃,1H-NMR(400MHz,DMSO):δ11.85(s,1H),9.44(s,1H),8.43(d,1H,J＝8),8.23(s,1H),7.65(d,1H,J＝8),7.25(t,1H,J＝8)7.08-7.04(m,2H),6.93(d,1H,J＝8),6.84(d,1H,J＝8),6.73-6.70(m,1H),6.65(d,1H,J＝8),4.64-4.58(m,2H),4.35(m,1H),4.09(d,1H,J＝8),3.90(m,1H),3.74-3.73(m,1H),2.94-2.89(m,1H),2.27-2.22(m,4H),2.11(s,4H),1.75-1.73(m,1H),1.51-1.43(m,2H),1.36(s,9H),1.05-1.04(m,4H),0.95(s,9H),0.90(d,3H,J＝4),0.84(d,3H,J＝8).13C NMR(100MHz,DMSO):δ171.93,156.20,146.69,139.67,138.15,132.60,129.89,129.35,126.30,125.61,120.22,117.17,114.40,78.61,59.07,51.92,49.04,34.98,31.09,28.64,26.72,24.50,23.57,21.69,20.75,14.00,5.89,5.83.HRMS calcd for C36H52N5O8S2 +[M+H]+783.4110；found:783.4125。
C1-C2的制备方法同C3，只是R5位置苯环上的取代基不同。
实施例3：化合物D1的合成。
1)(2S,4S)-4-((7H-嘌呤-6-基)氨基)-1-叔丁氧羰基吡咯烷-2-羧酸的制备(9)
将6-氯嘌呤(0.77g,5mmol)，化合物6(2.4g,10.0mmol)，Et3N(2.02g,20.0mmol)溶于正丁醇(50mL)。加热回流5小时后，TLC检测反应完全。蒸除溶剂后，柱纯化石油醚/乙酸乙酯(3:1v/v)得到化合物9as白色固体(1.1g,产率:39.7％)。
2)(2S,4S)-叔丁基-4-((7H-嘌呤-6-基)氨基)-2-(((R)-2-(环丙磺酰胺基)-3-苯丙酰基)氨基甲基)吡咯烷-1-羧酸酯的制备(10)
同实施例2中化合物8c的合成。
3)叔丁基((2S)-1-((4S)-4-((7H-嘌呤-6-基)氨基)-2-(((R)-2-(环丙磺酰胺基)-3-苯丙酰基)氨基甲基)吡咯烷-1-基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲酸酯(D1)
同实施例2中化合物C3的合成。
实施例4：化合物的体外抑酶活性的测试实验
所有的化合物均用二甲基亚枫溶解，化合物梯度稀释，加到最终的反应体系中，保证二甲基亚枫的浓度应当比1％更低。丙型肝炎病毒NS3丝氨酸蛋白酶(HCV NS3/NS4A)1b的酶反应体系由HCV NS3/NS4A 1b酶、牛血清蛋白(BSA)、HCV NS3/NS4A 1b特异性荧光底物、反应缓冲液等组成，当所有成分混合在一起后，于室温孵育30分钟，然后在多功能酶标仪下检测荧光信号，激发波长为355nm，发射波长为485nm。
将数值代入如下公式，计算活性百分率：％活性＝{(药物荧光值–本底荧光值)/(酶荧光值–本底荧光值)}×100％。
然后用计算软件处理，计算出化合物的IC50值。
表1化合物和阳性对照药特拉匹韦对NS3丝氨酸蛋白酶的抑制活性结果
| 编号 | IC<sub>50</sub>(μM) | 编号 | IC<sub>50</sub>(μM) |
| A1 | 1.9 | B2 | 72 |
| A2 | 34 | B3 | 7.4 |
| A3 | 2.5 | B4 | >100 |
| A4 | 5.9 | B5 | >100 |
| A5 | >100 | B6 | 7.1 |
| A6 | 5.6 | B7 | >100 |
| A7 | >100 | C1 | >100 |
| B1 | 4.5 | C2 | >100 |
| 特拉匹韦 | 0.45 | C3 | 2.1 |
| D1 | >100 |
实验结论：化合物对NS3丝氨酸蛋白酶均有一定的抑制作用，IC50值在微摩尔范围，最好的是化合物A1和C3，IC50值分别为1.9微摩尔和2.1微摩尔。
Claims (7)
1.含羟脯氨酸骨架的多肽类NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂，以及其药学上可接受的盐，具有如下通式I或Ⅱ所示的结构：
其中：
R1是氢、C1-C6烷基、苄基；
R2是氢、C1-C4烷基、环丙基、对甲基苯基；
R3是氢、C1-C6烷基、苄基；
R4是叔丁氧基、苄氧基、异丙基、呋喃基、噻吩基；
R5是对甲氧基苯基、萘基、(2,3-二甲基苯基)氨基苯甲基；
*是立体构型为S或R光学纯度或其消旋体。
2.如权利要求1所述的含羟脯氨酸骨架的多肽类NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂，其特征在于为下列化合物之一：
(2S,4S)-1-((S)-2-环己基-2-(噻吩-2-甲酰胺基)乙酰基)-N-((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺(A1)、
(2S,4S)-1-((S)-2-(呋喃-2-甲酰胺基)-3,3-二甲基丁基)-N-((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺(A2)、
(2S,4S)-1-((S)-2-苯甲酰基-2-环己基)-N-((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺(A3)、
叔丁基((S)-1-((2S,4S)-2-(((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲酸酯(A4)、
(2S,4S)-1-((S)-2-异丁酰胺基-3-苯丙酰基)-N-((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺(A5)、
叔丁基((S)-3-(1H-吲哚-3-基)-1-((2S,4S)-2-(((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-1-氧丙-2-基)氨基甲酸酯(A6)、
叔丁基((S)-3,3-二甲基-1-((2S,4S)-2-(((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-1-氧代丁基-2-基)氨基甲酸酯(A7)、
苄基((S)-1-环己基-2-((2S,4S)-2-(((R)-1-(环丙磺酰胺基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)氨基甲酸酯(B1)、
叔丁基((S)-1-环己基-2-((2S,4S)-2-(((R)-1-(环丙磺酰胺基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)氨基甲酸酯(B2)、
(2S,4S)-1-((S)-2-苯甲酰基-2-环己基乙酰基)-N-((R)-1-(环丙甲酰胺基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺(B3)、
(2S,4S)-1-((S)-2-环丙基-2-异丁酰胺基乙酰基)-N-((R)-1-(环丙磺酰胺基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺(B4)、
叔丁基((S)-1-((2S,4S)-2-(((R)-1-(环丙磺酰胺基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-4-甲基-1-氧戊烷-2-基)氨基甲酸酯(B5)、
叔丁基((S)-1-((2S,4S)-2-(((R)-1-(环丙磺酰胺基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基吡咯烷-1-基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲酸酯(B6)、
叔丁基((S)-1-((2S,4S)-2-(((R)-1-(环丙磺酰胺基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-3,3-d二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(B7)、
叔丁基((S)-1-((2S,4R)-2-(((S)-1-(环丙磺酰胺基)-4-甲基-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(4-甲氧基苯甲酰基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(C1)、
叔丁基((S)-1-((2S,4S)-4-(2-萘甲酰胺基)-2-(((S)-1-(环丙磺酰胺基)-4-甲基-1-氧丙烷-2-基)氨基甲基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(C2)、
叔丁基((S)-1-((2S,4S)-2-(((S)-1-(环丙磺酰胺基)-4-甲基-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(2-((2,3-二甲基苯基)氨基)苯甲酰胺基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(C3)、
叔丁基((2S)-1-((4S)-4-((7H-嘌呤-6-基)氨基)-2-(((R)-2-(环丙磺酰胺基)-3-苯丙酰基)氨基甲基)吡咯烷-1-基)-1-氧-3-苯丙基-2-基)氨基甲酸酯(D1)。
3.如权利要求1所述的含羟脯氨酸骨架的多肽类NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征在于，步骤如下：
以N-Boc-L-羟脯氨酸甲酯为起始原料，经甲磺酰化、叠氮钠取代生成中间体2，用“点击化学”方法，用硫酸铜为催化剂得到1,4位取代的三氮唑取代物，再用氢氧化钠水解后得到中间体3，中间体4是通过N-Boc保护的氨基酸与取代的磺酰胺在氯甲酸异丁酯、NaH的参与下反应生成；将中间体3与中间体4缩合生成中间体5，去除Boc取代基后继而与其他取代的氨基酸缩合后生成终产物A1-A7、B1-B7；中间体2用钯碳/氢气还原后得到含氨基的中间体6，与Boc保护的氨基酸或羧酸缩合为酰胺并水解甲酯基，得到中间体7，采用同样的方法与中间体4及中间体5缩合后继而得到终产物C1-C3；或者将氨基与6-氯嘌呤反应得到中间体9继而得到终产物D1；
反应式如下：
其中，R1-R5，如上述通式I或Ⅱ中所述；
上述反应式中的试剂和条件：(a)ⅰ)二氯甲烷，甲磺酰氯，三乙胺，室温；ⅱ)叠氮钠，N，N-二甲基甲酰胺，80℃；(b)ⅰ)苯乙炔，硫酸铜，抗坏血酸，乙醇/水，室温；ⅱ)氢氧化钠，甲醇/水；(c)钯碳，氢气；(d)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯丙三唑，N-甲基吗啉，二氯甲烷，室温；(e)乙酸乙酯的饱和氯化氢溶液；(f)ⅰ)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-羟基苯丙三唑，N-甲基吗啉，二氯甲烷，室温；ⅱ)氢氧化钠，甲醇/水；(i)ⅰ)6-氯嘌呤，三乙胺，正丁醇，回流；ⅱ)氢氧化钠，甲醇/水。
4.(2S,4S)-1-((S)-2-环己基-2-(噻吩-2-甲酰胺基)乙酰基)-N-((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺(A1)的制备方法，步骤如下：
(1)(2S，4S)-1-叔丁基-2-甲基4-叠氮基吡咯烷-1,2-二羧酸酯的制备
将N-Boc-L-羟脯氨酸甲酯2.45g和三乙胺2.02g溶于二氯甲烷50mL中，滴加甲磺酰氯1.72g后室温搅拌过夜，TLC检测反应完全；减压蒸除二氯甲烷后，残留物用乙酸乙酯溶解，反应液用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液100mL洗涤三次，饱和氯化钠溶液洗涤100mL洗涤三次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂，得到粗产物；将此粗产物溶于20mLN,N-二甲基甲酰胺后，加入叠氮钠3.3g，反应液于80℃加热过夜，反应完全；将反应液冷却至室温，加水稀释后用乙酸乙酯萃取50mL萃取3次，合并有机相，无水硫酸镁干燥，蒸除溶剂后得到产物为黄色油状物1.92g,产率:70.3％；
(2)(2S,4S)-1-(叔丁氧羰基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-羧酸的制备
将化合物2 2.72g溶于乙醇：水1:1 50mL溶液中，加入抗坏血酸0.18g和催化量硫酸铜后，滴加苯乙炔1.53g,反应液在室温条件下搅拌过夜后，TLC检测反应完全；将反应液用乙酸乙酯萃取，合并有机相，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液100ml洗3次，饱和氯化钠溶液100ml洗涤3次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂；将得到的产物溶于甲醇：水1:1 50mL溶液中，加入氢氧化钠0.8g，室温反应半小时，将反应液用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂后，通过柱纯化乙酸乙酯/石油醚2:1得到化合物3，为白色固体2.63g,产率:73.5％；
(3)(S)-2-氨基-4-甲基-N-甲苯磺酰基戊酰胺的制备
将N-Boc-L-环己基甘氨酸0.69g,N-甲基吗啉0.61g溶于无水四氢呋喃20mL，搅拌15分钟后缓慢滴加氯甲酸异丁酯0.45g，反应液于-20℃反应一小时得反应液A；将对甲苯磺酰胺0.62g和氢化钠0.36g于无水四氢呋喃中搅拌4小时得反应液B，将反应液A冰浴条件下滴进B中，室温反应过夜；蒸除溶剂后，将残余物溶于乙酸乙酯中，用1摩尔/升稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液各100mL洗涤3次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂；将所得产物溶于乙酸乙酯的饱和氯化氢溶液中，搅拌4小时，将反应液过滤即得化合物4a，为白色固体0.69g,产率：82.1％；
(4)(2S,4S)-叔丁基-2-(((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-羧酸酯的制备
将化合物3 0.72g与N-甲基吗啉0.61g溶于二氯甲烷50mL,加入1-羟基苯并三唑0.32g和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.49g后室温搅拌半小时，然后加入化合物4a搅拌过夜；蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液各100mL洗涤3次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂；粗品经柱纯化乙酸乙酯/石油醚1:1后得到化合物5a，为白色固体0.58g,产率:46.2％；
(5)叔丁基((S)-1-环己基-2-((2S,4S)-2-(((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-1-基)-2-氧乙基)氨基甲酸酯的制备
将N-Boc-环己基甘氨酸0.26g与N-甲基吗啉0.15g溶于二氯甲烷20mL，加入1-羟基苯并三唑0.16g和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.23g后室温搅拌半小时；将化合物5a溶于乙酸乙酯的饱和氯化氢10mL溶液中，搅拌4小时，将反应液过滤即得白色固体，然后将此固体0.56g加入反应液中搅拌过夜；蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液各100mL洗涤3次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂；粗品经柱纯化石油醚/乙酸乙酯1:1后得到化合物，为白色固体0.41g,产率:53.1％；
(6)(2S,4S)-1-((S)-2-环己基-2-(噻吩-2-甲酰胺基)乙酰基)-N-((S)-4-甲基-1-(4-甲基苯基磺酰胺基)-1-氧戊烷-2-基)-4-(4-苯基-1H-1,2,3-三氮唑-1-基)吡咯烷-2-甲酰胺的制备(A1)
将噻吩甲酸0.13g与N-甲基吗啉0.15g溶于二氯甲烷20mL,加入1-羟基苯并三唑0.16g和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.23g后室温搅拌半小时；将上步所得化合物溶于乙酸乙酯的饱和氯化氢10mL溶液中，搅拌4小时，将反应液过滤即得白色固体，然后将此固体0.66g加入反应液中搅拌过夜；蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液各100mL洗涤3次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂；粗品经柱纯化石油醚/乙酸乙酯1:1后得到化合物，为白色固体0.36g,产率:46.4％。
5.叔丁基((S)-1-((2S,4S)-2-(((S)-1-(环丙磺酰胺基)-4-甲基-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(2-((2,3-二甲基苯基)氨基)苯甲酰胺基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯(C3)的制备方法，步骤如下：
(1)(2S,4S)-1-叔丁基-2-甲基-4-氨基吡咯烷-1,2-二羧酸酯的制备
将化合物2 2.72g溶于甲醇100ml，缓慢加入10％钯碳，室温下氢气还原过夜反应完全，过滤，蒸除溶剂后得到化合物6，为黄色油状物2.1g,产率：87.5％；
(2)(2S,4S)-1-叔丁氧羰基-4-(2-((2,3-二甲基苯基)氨基)苯甲酰基)吡咯烷-2-羧酸的制备
将甲灭酸0.48g与N-甲基吗啉0.31g溶于二氯甲烷40mL,加入1-羟基苯并三唑0.32g和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.49g后室温搅拌半小时；将化合物6 0.48g加入反应液中搅拌过夜；蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液各100ml洗涤3次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂；粗品经柱纯化石油醚/乙酸乙酯2:1后得到化合物7c，为白色固体0.53g,产率:56.8％；
(3)(2S,4S)-叔丁基-2-(((S)-1-(环丙磺酰胺基)-4-甲基-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(2-((2,3-二甲基苯基)氨基)苯甲酰基)吡咯烷-1-羧酸酯的制备
将化合物7c溶于甲醇：水1:1 50mL中，加入氢氧化钠固体，室温反应半小时，将反应液用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂后得到白色固体；将此白色固体0.45g与N-甲基吗啉0.15g溶于二氯甲烷20mL,加入1-羟基苯并三唑0.16g和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.23g后室温搅拌半小时；将(S)-2-氨基-N-(环丙磺酰胺基)-4-甲基戊酰胺盐酸盐0.27g加入反应液后搅拌过夜；蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液各100ml洗涤3次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂后得到化合物8c，为白色固体0.37g,产率:55.6％；
(4)叔丁基((S)-1-((2S,4S)-2-(((S)-1-(环丙磺酰胺基)-4-甲基-1-氧戊烷-2-基)氨基甲基)-4-(2-((2,3-二甲基苯基)氨基)苯甲酰胺基)吡咯烷-1-基)-3,3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基甲酸酯的制备
将N-Boc-叔亮氨酸0.12g与N-甲基吗啉0.08g溶于二氯甲烷10mL,加入1-羟基苯并三唑0.08g和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐0.12g后室温搅拌半小时；将化合物8c溶于乙酸乙酯的饱和氯化氢10mL溶液中，搅拌4小时，将反应液过滤即得白色固体，然后将此固体0.29g)加入反应液中搅拌过夜；蒸除溶剂后用乙酸乙酯溶解，用稀盐酸，饱和碳酸氢钠溶液，饱和氯化钠溶液各100ml洗涤3次；有机相用无水硫酸镁干燥过夜，抽滤，减压蒸除溶剂；粗品经柱纯化石油醚/乙酸乙酯1:1后得到化合物C3，为白色固体0.19g,产率：46.6％。
6.权利要求1或2所述的含羟脯氨酸骨架的多肽类NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂在制备预防或治疗与HCV感染相关疾病的药物中的应用；所述的与HCV感染相关疾病包括：急、慢性丙型肝炎，肝硬化，肝癌。
7.一种预防或治疗与HCV感染相关疾病的药物组合物，包含权利要求1或2所述的含羟脯氨酸骨架的多肽类NS3丝氨酸蛋白酶抑制剂或其药学上可接受的盐以及一种或多种药学上可接受载体或赋形剂。
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