CN105168258A - 一种蚯蚓抗损伤制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蚯蚓抗损伤制剂及其制备方法，属于蛋白质生物技术领域，包含蚯蚓有效成分85%、1-2丙二醇10%、吐温-80？3～4%、0.3mol/L蔗糖和甘油以及NaCl1～2%，其中蚯蚓有效成分的制备工艺为：1）取鲜蚯蚓洗净、隔夜吐沙，加PBS缓冲液进行组织研磨；2）组织液进行超声波细胞破碎并离心，取上清液；3）超滤管截取蛋白质。本发明中的蚯蚓抗损伤制剂经科学方法制取，保证了动物和人体复杂生命系统以及复杂疾病防治的客观要求，属于蛋白类药物制剂，药效高，副作用低,不蓄积中毒，是一种疗效可靠、毒副作用小且无环境污染的制剂。

Description

一种蚯蚓抗损伤制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及蛋白质生物技术领域，特别是涉及一种蛋白质药物制剂。

背景技术

蚯蚓俗称地龙，作为一种中药材，具有很高的药用价值，在我国的应用已经有几千年历史。据《本草纲目》记载:蚯蚓能治疗瘰疬溃烂、口舌糜疮，临床上常用来治疗骨折、创伤、下肢溃烂等疾病。蚯蚓中含高度不饱和脂肪酸、核苷酸、酶类、蛋白质、蚯蚓解热碱等多种物质，具有清热定惊、止咳平喘、活血通络、降压、抗溃疡、抗肝纤维化、利尿等功能。此外，现代分离技术发现，蚯蚓中还含有纤溶酶、抗菌肽、多种抗氧化酶等活性成分，因此具有止血镇痛、促进创伤愈合、抗氧化、抗血栓、调节免疫、抗心律失常、抗癌等作用。近几年蚯蚓药用价值越来越受到重视，临床研究和应用也日益广泛。蚯蚓不仅在临床中用于药物治疗，而且在动物营养饲料、土壤改良、环境治污、保护生态环境、物质循环以及维持自然界生态平衡等方面发挥着特殊作用。

目前，治疗创伤的药物主要以化学合成药和中药内服和中药外敷为主。化学合成药对用药者易产生药物的依赖性和耐药性，存在长期残留在动物和人体内的弊端，人们经常食用药物残留的动物肉质，都会带来对身体潜在的伤害，从而引发不可逆转的后果。中药一般由多种药物组成，成分复杂，内服或外敷使用均存在药理作用不明、药效欠佳、药效存在不可控性、煎煮麻烦以及携带不便等问题。

发明内容

为解决上述存在的问题，本发明的目的在于提供一种药效明显、使用方便、安全可靠、无毒副作用的蚯蚓抗损伤制剂及其制备方法。

为实现上述发明目的，本发明提供一种蚯蚓抗损伤制剂，该制剂的配方按体积比为：蚯蚓有效成分85%，1-2丙二醇10%，吐温-803～4%，0.3mol/L蔗糖和甘油以及NaCl1～2%。

优选地，所述蚯蚓有效成分按照以下步骤制备：（1）取鲜蚯蚓进行清洗，隔夜吐净泥沙，次日清水反复清洗干净；（2）取等体积缓冲液与蚯蚓进行组织研磨，研磨时保证操作处于4℃环境；（3）研磨后组织液在冰浴中进行细胞的超声破碎；（4）冷冻离心三次，弃沉淀得到蚯蚓粗提物；（5）使用30kD和100kD的超滤管进行超滤处理。

优选地，所述的鲜蚯蚓为太平二号蚯蚓。

优选地，该制剂按配方混合后进行过滤除菌再投入使用。

优选地，所述蚯蚓有效成分的分子量为30-100kD。

优选地，该制剂为液状，给药方式为喷涂。

优选地，所述组织研磨在冰水环境下进行，蚯蚓有效成分的整个制备过程在4℃环境下进行，从而防止酶变性。

优选地，所述组织研磨的具体操作为：将4℃、0.2mol/L、pH=7.2的现配PBS缓冲液与蚯蚓等体积混合置于组织研磨器中研磨。

优选地，所述离心条件为4℃、12000r/min离心10min，且重复离心三次。

优选地，该制剂具有创伤愈合作用，用于制备抗损伤药物。

优选地，该制剂具有抑菌作用。

本发明还提供一种蚯蚓抗损伤制剂的制备方法，包括以下步骤：

取鲜蚯蚓进行清洗，隔夜吐净泥沙，次日清水反复清洗干净；

取等体积缓冲液与蚯蚓进行组织研磨，研磨时保证操作处于4℃环境；

研磨后组织液在冰浴中进行细胞的超声破碎；

冷冻离心三次，弃沉淀得到蚯蚓粗提物；

使用30kD和100kD的超滤管进行超滤处理得到蚯蚓有效成分；

按配方蚯蚓有效成分85%，1-2丙二醇10%，吐温-803～4%，0.3mol/L蔗糖和甘油以及NaCl1～2%混合。

优选地，所述的鲜蚯蚓为太平二号蚯蚓。

本发明提供的一种蚯蚓抗损伤制剂所产生的有益效果如下：（1）该制剂经科学方法制取，保证了动物和人体复杂生命系统以及复杂疾病防治的客观要求，具有多肽类药物的优点，如具有明显的创伤愈合作用，是一种疗效可靠、毒副作用小、无环境污染的制剂；（2）该制剂属于蛋白类药物制剂，药效高，副作用低,不蓄积中毒，因为蛋白质类药物本身是人体内源性物质或针对生物体内调控因子研发而得，通过参与、介入、促进或抑制人体内或细菌病毒中生理生化过程而发挥作用，副作用低，药效高，针对性强，不会蓄积于体内而引起中毒；（3）本发明可以带动蚯蚓养殖业及其附属产业的发展，改善日益恶化的环境，为社会提供大量的就业岗位，缓解当下的就业压力，增加当地政府的税收收入。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

首先，通过查阅大量文献可知，目前被学者探明的蚯蚓蛋白有多种，包括：抗菌肽、蚓激酶、纤溶酶、过氧化物酶系、镇痛成分、促进创伤愈合成分等，对于提取蚯蚓蛋白方法很多，检测到的目的蛋白分子量也较为明确，范围存在于1KD-600KD之间。因此选择合适的蚯蚓蛋白进行提纯显得尤为重要。蚯蚓纤溶酶的分子量范围大致为16KD-50KD之间，但分子量在29KD-34KD之间的体内纤溶、体外止血的溶栓凝血效果较强；蚯蚓抗菌肽分子量主要范围为1KD-1.6KD、5.5KD-45KD、510KD-536KD之间；蚯蚓过氧化物酶系分子量在30KD-98KD以及230KD-340KD之间；镇痛、促进创伤愈合作用的蛋白分子量在90KD以下。

因此，结合以上蛋白范围，根据实际可行性分析，筛除一部分较小的和分子量较大的蛋白，实验最终确定提取蚯蚓抗损伤蛋白有效成分分子量范围为：3KD-100KD之间，本范围内的蚯蚓蛋白既保证了纯度、疗效，同时兼顾了提取工艺的方便、快捷、可控性。

其次，制备蚯蚓抗损伤制剂。

具体步骤如下：

（1）取太平二号蚯蚓，清水洗净，隔夜吐净泥沙，次日清水反复清洗干净，将太平二号蚯蚓至于滤纸上吸除残余水分。

（2）将4℃、0.2mol/L、pH=7.2的现配PBS缓冲液与蚯蚓等体积混合置于组织研磨器中研磨，组织研磨器中应加入冰水混合物，保证在4℃环境下进行，以防止酶变性。充分研磨好的蚯蚓研磨液及皮渣液利用超声波破碎仪充分破碎细胞，所得液体倒入普通EP管置于4℃超低温冷冻离心机12000r/min，离心10min，取上清液，重复离心三次，再取上清液，4℃保存蚯蚓粗提物。

（3）取30kD和100kD超滤管，将蚯蚓粗提物分别放入超滤管超滤，截取蚯蚓有效成分。

（4）将蚯蚓有效成分、1-2丙二醇、吐温-80、0.3mol/L蔗糖和甘油以及NaCl按比例混合。

（5）混合液用0.22微米滤菌筛过滤保存即可。

通过以上步骤得到抗损伤制剂。

取第（3）步所得的蚯蚓有效成分进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）及蛋白质双向电泳的图谱扫描、ImageMaster相关软件进行图谱差异分析，最终得出实验中蚯蚓提取物的蛋白分子量主要集中在15-35KD之间、45-55KD之间以及60-70KD之间。15-35KD之间的条带表现为不连续性，60-70KD之间的条带最为明亮、且具有连续性。由于提取过程始终保持pH=7.2、4℃，确保了提取蛋白的活性，结果与之前确定的目的蛋白范围相一致。

其次，通过实验观察蚯蚓蛋白复合物在治疗创伤愈合和抗菌方面的应用

实验例1：创面愈合实验观察蚯蚓抗损伤药物的创伤愈合作用效果

具体操作如下：

（1）实验动物准备和分组

60只雌雄各半、大小相似、健康的KM小鼠实验前一周放入饲养笼中给予充足的食物和水进行饲养，使之适应环境，减少应激反应对实验的影响。其中饲养室内温度控制在22±2℃，湿度为65%-75%，12h明暗交替进行。

实验小鼠被随机分成三组，每组20只，A代表空白对照组，不用任何药物进行治疗；B代表蚯蚓抗损伤组，给予蚯蚓提取物进行治疗；C组代表京万红组，给予京万红烫伤膏(主要中药成分：地黄、当归、乳香、黄连、木鳖子、血竭等)进行治疗。

（2）对小鼠进行机械组织损伤

用8%硫化钠脱去小鼠背部区域的毛发，温水清洗擦干，小鼠用1%戊巴比妥钠(1g/l00ml)按公斤体重35mg/kg腹腔内注射麻醉，5%的碘酒及75%的酒精局部消毒术区，于小鼠后背距脊柱两侧1cm处用自制打孔器切割直径为1cm的圆形创伤口各1个，深度从皮肤到肌层，肌层伤口的厚度约为0.3cm，用生理盐水冲洗伤口、消毒。开放创面，充分止血，待清醒后单笼饲养，分别做好组间标记。

（3）对创伤后小鼠进行给药处理

空白对照组小鼠创面直接暴露空气中，不做任何处理；京万红组创面外涂0.1g京万红；蚯蚓抗损伤组创面喷涂0.1ml蚯蚓提取物；三组早晚八点各换一次药物。垫料及鼠笼前期进行杀菌消毒。

（4）对实验中小鼠进行临床观察和创面愈合计算

每次观察记录小鼠毛色，进食，活动、精神状态，创面色泽、质地、有无渗液、是否感染，创周红肿变化，肉芽组织的生长情况、有无分泌物、周围组织水肿等情况。

创面愈合率：采用透明纸片描记加称重法计算。小鼠于伤后3、7、11、15d记录创面愈合率。首先将创面面积描绘在透明薄膜上，再以此为模板，将质地均匀的硬纸片剪成同样大小，然后用分析天平称质量。以硬纸片质量间接地表示创面面积大小。按下列公式计算创面愈合率：创面愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积x100%。

愈后瘢痕面积：造模后第30d，用薄膜覆盖于创面，记录创面大小，并在计算纸上计算出创面面积，作为愈后瘢痕面积。

创面愈合时间：以肉芽完全覆盖创面为治愈标准，达到创面愈合标准的时间为创面愈合时间。

（5）临床观察的实验结果表明蚯蚓蛋白复合物具有治疗创伤，增强创伤愈合的效果，具体表现如下：

造模和临床试验期间，无麻醉过量、创伤感染等原因造成小鼠死亡情况的发生。所有小鼠无休克、腹泻、拒食、绝饮等病理性应激反应的发生。造模后第1d：所有小鼠创面均有出血、周围组织水肿、炎性组织液渗出，蚯蚓抗损伤组凝血时间与空白对照组、京万红组比较均有较显著差异，喷涂有蚯蚓抗损伤组伤口凝血时间最长，京万红组凝血时间最短。空白对照组小鼠在创伤后1d精神沉郁，出现尾冷、嗜睡、活动减少等阳虚症状；蚯蚓抗损伤组和京万红组小鼠情况相似，创伤后出现易受惊吓、警觉等生理性应激反应，1d后慢慢恢复正常，小鼠运动、进食、饮水正常。第3d：蚯蚓抗损伤组和京万红组小鼠创面表面仍为血凝块，创面较为红润，周围组织水肿情况有所减轻，创缘周围可见部分新鲜肉芽形成；空白对照组小鼠阳虚症状消失，创面组织水肿较为明显，有轻微红肿现象的出现，创面干燥，颗粒状肉芽较少。第7d：对照组小鼠创面较为干燥，分泌物少，少见增生的肉芽组织；蚯蚓抗损伤组和京万红组小鼠创面都较为湿润，分泌物较多，创面有较多的肉芽组织填充，其中蚯蚓抗损伤组肉芽填充最为明显可达创面45%以上，创面边缘可见部分薄层上皮组织生长，伤口收缩明显。第11d：三组均出现不同程度的创口结痂现象，且蚯蚓抗损伤组优于京万红组好于空白对照组，蚯蚓抗损伤组小鼠伤口表面不同程度长出毛发。第15d：三组创面几乎完全被肉芽组织填充并伴有皮肤长出，可见较多毛发长出，蚯蚓抗损伤组小鼠创面基本痊愈，脊柱两侧仅留下较小的瘢痕区未长出毛发。

（6）创面愈合实验结果表明使用蚯蚓蛋白复合物能够缩短创伤的愈合时间，且治疗效果优于京万红，具体表现如下：

实验过程中各组创伤小鼠的创面愈合率和愈合时间时间见表1。

表1各组创伤小鼠的创面愈合率和愈合时间比较

由表1结果可以看出，与空白对照组相比，蚯蚓抗损伤组和京万红组在第7d、11d、15d创面愈合率均优于空白对照组，具有统计学意义(p<0.05)，第3d三组之间愈合率差异不显著，不具有统计学意义(p>0.05)。其中，与京万红组比较，蚯蚓抗损伤组第7d、11d创面愈合率优于京万红组，具有统计学意义(p<0.05或p<0.01)。第15d蚯蚓抗损伤组与京万红组相比，不具有统计学意义(p>0.05)。

在愈合时间方面比较中，蚯蚓提取组和京万红组创面时间均优于空白对照组，差异显著(p<0.01)，具有统计学意义，表明蚯蚓提取物和京万红具有缩短创伤愈合时间的作用。其中，蚯蚓抗损伤组创面愈合时间与空白对照组比较，表现差异极显著(p<0.01)，具有统计学意义；蚯蚓抗损伤组创面愈合时间与京万红组比较，也表现差异显著(p<0.05)，具有统计学意义，表明蚯蚓抗损伤有效成分在治疗创伤愈合时间方面好于京万红。

实验例2：创面新生肉芽组织中成纤维细胞实验观察制剂的创伤愈合效果

具体步骤如下：

实验步骤（1）、（2）、（3）与实验例1的步骤（1）、（2）、（3）相同。

（4）采用GTVision^TMIII抗鼠/兔通用型免疫组化检测试剂盒检测创面新生肉芽组织中成纤维细胞数变化情况。

结果判断：400×光镜下，每张切片随机取5个视野。细胞核或细胞质被染成棕色或棕黄色者为阳性细胞。按阳性细胞所占百分比分为4级：阴性(-)，无阳性细胞；弱阳性(+)，阳性细胞数<10%；中度阳性(++)，阳性细胞数10%-60%；强阳性(+++)，阳性细胞数>60%。

（5）观察实验结果可知，蚯蚓抗损伤剂对小鼠具有良好的创伤愈合能力，且愈合效果强于京万红，具体表现如下：

机械性损伤3d后：HE染色光镜下，空白对照组小鼠创面表皮还未形成，有大量的坏死组织，结痂跟真皮结缔组织紧密结合，结缔组织中有大量的炎性细胞，细胞间质疏松，未见明显的新生毛细血管生成和成纤维细胞增生。京万红组小鼠创面表皮未形成，但结痂与真皮界限已形成，结缔组织中有炎性细胞存在。蚯蚓抗损伤组小鼠创面表皮也未形成，皮下组织可见炎性细胞浸润带，细胞间质疏松水肿，可见小血管扩张，有新的毛细血管芽和成纤维细胞。蚯蚓抗损伤组与京万红组和空白对照组比，结缔组织中有较多的炎性细胞。

机械性损伤7d后：空白对照组第7d可见多量着色较深的成纤维细胞且细胞体明显增大并成星状放射性的成纤维细胞开始增多，但大部分成纤维细胞的细胞体仍呈圆形或椭圆形，细胞间质染色较浅、间质疏松。京万红组炎性细胞减少，成纤维细胞分布弥散，但整体排列较为规律，出现少量新生毛细血管，毛细血管管径较细。蚯蚓抗损伤组镜下炎性细胞数量减少，同时有大量呈星状或梭型的成纤维细胞，成纤维细胞排列较整齐，细胞体较大，细胞质丰富，有较多突起，细胞核膨大呈椭圆形，染色加深，毛细血管成分增多，出现少量的肉芽样结构。

机械性损伤11d后：空白对照组小鼠创面形成一层薄薄的肉芽组织，初步形成的创面表面较为粗糙，可见胶原纤维数量较少、排列疏松，胶原纤维中间夹杂少量成纤维细胞和管径较小的毛细血管。京万红组小鼠创面形成一层较厚的上皮组织，形成表皮细胞层，可见一定量的结缔组织和成纤维细胞，大量成纤维细胞呈放射状，胶原纤维层厚度和排列紧密度增加。蚯蚓抗损伤组小鼠创面形成一层比京万红组更厚的上皮组织，肉芽组织机化增生，填补创口，部分增生的肉芽组织转变为结缔组织，可见大量成熟的胶原纤维，胶原纤维排列紧密，毛细血管显著增加。

机械性损伤15d后：空白对照组镜下炎性细胞基本消失，毛细血管数量减少、管径变粗，成纤维细胞数量增多、胞体变大、胞核染色加深，细胞排列成束状，束与束之间排列较为杂乱无章。京万红组大量胶原纤维填充细胞间质中，成纤维细胞排列紧密，毛细血管管径变粗，皮下组织中脂肪细胞增多。蚯蚓抗损伤组可见大量梭型、排列整齐呈束状分布的成熟成纤维细胞，细胞间由大量有序的胶原纤维填充，细胞外基质成分均匀，皮下组织中的脂肪细胞明显增多，可见新生毛囊。

因此，创面新生肉芽组织中成纤维细胞实验可知，蚯蚓抗损伤剂对小鼠具有良好的创伤愈合能力，且愈合效果强于京万红。

实验例3：抗损伤制剂的抑菌效果实验

具体步骤如下：

将制备好的抗损伤制剂分别测量其对麦康凯培养基培养的大肠杆菌(G^-)、伊红美兰培养的沙门氏菌(G^-)、小牛血清培养的链球菌(G⁺)、营养琼脂培养的枯草芽孢杆菌(G⁺)四种细菌的抑菌圈大小，以此来判断其抑菌效果。实验中以无菌水作为空白对照。

抑菌实验结果如下：

抗损伤制剂的抑菌效果如表2所示，蚯蚓抗损伤制剂对大肠杆菌、沙门氏菌、链球菌以及枯草芽孢杆菌均有抑菌效果，其中对大肠杆菌和链球菌的抑菌效果较为显著，沙门氏菌效果最弱。实验表明蚯蚓抗损伤制剂对革兰氏阳性菌有较好的抑菌效果，对革兰氏阴性菌也具有抑菌效果，因此可用于抗菌药物。

表2蚯蚓抗损伤制剂对常见细菌的抑菌圈大小(mm)

	大肠杆菌	沙门氏菌	链球菌	枯草芽孢杆菌
					抗损伤制剂	8.25±0.29	5.74±0.38	9.73±1.37	6.53±1.43

本文中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，由于文字表达的有限性，而客观上存在无限的具体结构，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进、润饰或变化，也可以将上述技术特征以适当的方式进行组合；这些改进润饰、变化或组合，或未经改进将发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种蚯蚓抗损伤制剂，其特征在于，该制剂的配方按体积比为：蚯蚓有效成分85%，1-2丙二醇10%，吐温-803～4%，0.3mol/L蔗糖和甘油以及NaCl1～2%。

2.根据权利要求1所述的一种蚯蚓抗损伤制剂，其特征在于，所述蚯蚓有效成分按照以下步骤制备：（1）取鲜蚯蚓进行清洗，隔夜吐净泥沙，次日清水反复清洗干净；（2）取等体积缓冲液与蚯蚓进行组织研磨，研磨时保证操作处于4℃环境；（3）研磨后组织液在冰浴中进行细胞的超声破碎；（4）冷冻离心三次，弃沉淀得到蚯蚓粗提物；（5）使用30kD和100kD的超滤管进行超滤处理。

3.根据权利要求2中的一种蚯蚓抗损伤制剂，其特征在于，所述的鲜蚯蚓为太平二号蚯蚓。

4.根据权利要求1或2中的一种蚯蚓抗损伤制剂，其特征在于，所述蚯蚓有效成分的分子量为30-100kD。

5.根据权利要求1或2中的一种蚯蚓抗损伤制剂，其特征在于，该制剂为液状，给药方式为喷涂。

6.根据权利要求1或2中的一种蚯蚓抗损伤制剂，其特征在于，该制剂经0.22μm过滤除菌后再使用。

7.根据权利要求1或2中的一种蚯蚓抗损伤制剂，其特征在于，该制剂应用于制备抗损伤药物。

8.根据权利要求1或2中的一种蚯蚓抗损伤制剂，其特征在于，该制剂具有抑菌作用。

9.一种蚯蚓抗损伤制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

取鲜蚯蚓进行清洗，隔夜吐净泥沙，次日清水反复清洗干净；

取等体积缓冲液与蚯蚓进行组织研磨，研磨时保证操作处于4℃环境；

研磨后组织液在冰浴中进行细胞的超声破碎；

冷冻离心三次，弃沉淀得到蚯蚓粗提物；

使用30kD和100kD的超滤管进行超滤处理得到蚯蚓有效成分；

按配方蚯蚓有效成分85%，1-2丙二醇10%，吐温-803～4%，0.3mol/L蔗糖和甘油以及NaCl1～2%混合。

10.根据权利要求9中的一种蚯蚓抗损伤制剂，其特征在于，所述的鲜蚯蚓为太平二号蚯蚓。