CN105154320A - 透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置，包括透在所述皿体(2)内部底部一体制成有小凹槽(21)，小凹槽(21)中包被有可结合成熟精子的透明质酸及其盐或衍生物，小凹槽(21)的高度高于所述包被的透明质酸及其盐或衍生物的高度；皿体(2)的外面分布有若干个方便拿取皿体(2)且能避免接触皿体(2)皿口的小耳(22)；所述皿体(2)的外底部设有避免皿体(2)外底部磨损的凸台阶(23)；培养皿体(2)的边缘最高处与小凹槽(21)的底部形成的夹角为5～23度；同时还公布了本发明的使用方法。使用简单、操作方便，既能方便选择出成熟的单精子又不破坏精子的形态、结构与活力。
Description
技术领域
本发明涉及体外精子挑选领域，是一种透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置及应用。
背景技术
现在用于挑选精子的培养皿多为普通细胞培养皿(Petridish)，将处理后的精液放入普通细胞培养皿中，在显微镜下观察精子的活动性能，操作者需要在众多的精子中根据个人经验判断并挑选出被认为高质量的成熟精子，众所周知，活动性较强的精子不一定是成熟的精子，此挑选过程受操作者个人经验与主观性影响较大，具有明显的随机性，不能确保挑选出的活跃精子即为成熟的活力精子。
透明质酸是卵子和透明带黏液基质的主要成分，精子顶体和胞质膜中含有透明质酸酶。当精子穿透卵冠丘复合体时，胞质膜中透明质酸酶水解卵冠丘复合体中的黏液透明质酸，从而穿过黏液；在透明带诱发顶体反应时精子释放透明质酸酶水解透明质酸，在整个过程中，精子与透明质酸结合起到了重要作用。有研究表明只有成熟的活动精子可以与透明质酸结合。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种节约时间、既能准确选择出成熟的精子又不破坏精子的形态、结构与活力的透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置及应用。
为了解决以上所述的技术问题，本发明采取以下技术方案：一种透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置，包括皿体和适配的皿盖，在所述皿体内底部一体制成有小凹槽，小凹槽中包被有可结合成熟精子的透明质酸及其盐或衍生物，小凹槽的高度高于所述包被的透明质酸及其盐或衍生物的高度；皿体的外壁分布有若干个方便拿取皿体且能避免接触皿体皿口的小耳；所述皿体的底部下表面设有避免皿体底部磨损的凸台阶；培养皿体的边缘最高处与小凹槽的底部形成的夹角为5～23度。
优选地，所述小凹槽由自所述培养皿体底部向上一体形成的一个环形突起形成。
优选地，所述小凹槽设置在所述培养皿体底部的中心位置。
进一步地，所述小凹槽的尺寸为：直径9mm，高度0.6mm。
更进一步地，所述培养皿体的尺寸为：直径50mm，高度8mm。
所述皿盖和皿体由透明硬质塑料制成。
一种所述的透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置的使用方法，
1)将所述单精子选择装置从2-8℃环境中取出，平衡至室温；
2)分离并洗涤精子，以含有3～5mg/ml人白蛋白的培养液调节得到精子数量为0.2～1×06个/ml的精子悬液，提高精子被透明质酸及其盐或衍生物特异性结合的识别准确性；
3)揭下所述培养皿盖，在所述单精子选择装置的皿体内准备若干个培养液液滴用于接收挑选后的成熟精子；
4)吸取20～30ul经所述2)处理后的精子悬液至该单精子选择装置的小凹槽中，使精子悬液布满小凹槽；
5)盖上所述培养皿盖，22～30℃反应1～10min；
6)揭下所述培养皿盖，在显微镜下确定精子头部被小凹槽内透明质酸及其盐或衍生物包被的物质结合至固相表面难以运动，但尾部鞭打剧烈的精子；
7)用精子注射用穿刺针或其他中空细管，紧靠培养皿体的侧壁或以与小凹槽底部小于或等于23度的角度将所述步骤6)中确定的精子挑选出并放置于所述培养液滴中。
一种所述的透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置的使用方法，
1)将所述单精子选择装置从2-8℃环境中取出，平衡至室温；
2)分离并洗涤精子，以含有3～5mg/ml人白蛋白的培养液调节得到精子数量为0.2～1×06个/ml的精子悬液，提高精子被透明质酸及其盐或衍生物特异性结合的识别准确性；
3)揭下所述培养皿盖，在所述单精子选择装置培养皿体内准备若干个暂存挑选出的精子的培养液液滴以及抑制挑选出的精子运动的PVP液滴；
4)吸取20～30ul经所述2)处理后的精子悬液至该单精子选择装置的小凹槽(21)中，使精子悬液布满小凹槽；
5)盖上所述培养皿盖在显微镜热台加热至33～37℃反应1～10min；
6)揭下所述培养皿盖，在显微镜下确定精子头部被小凹槽内透明质酸及其盐或衍生物包被的物质结合至固相表面难以前向运动，但尾部鞭打剧烈的精子；
7)用精子注射用穿刺针或其他中空细管，紧靠培养皿体2的侧壁或以与小凹槽底部小于或等于23度的角度将所述步骤6)中确定的精子挑选出，暂存于培养液液滴或放置于PVP液滴中制动。
与现有技术相比，能结合成熟精子的透明质酸及其盐或衍生物直接包被成固相于所述小凹槽中，省略了操作者每次包被透明质酸及其盐或衍生物的过程，操作简单快捷，极大节约操作者时间、提高工作效率；通过对大量被挑选的精子进行检测发现，当挑选精子的角度小于23度时，能确保被挑选的精子不受任何损伤且在挑起的过程中不易掉落，本发明对培养皿体深度与直径的进行最优化试验，保证操作者紧靠培养皿体2的侧壁挑选精子时，挑选工具与小凹槽底部的夹角小于23度；培养皿体的外壁分布有若干个小耳，既方便操作者拿取培养皿体，又能有效杜绝操作者接触到培养皿体的皿口，防止外来污染物落入培养皿体中，影响精子的挑选；进一步地，培养皿体的外面底部设有凸台阶，有效避免培养皿体的下表面受到磨损、刮花，干扰显微镜下精子的挑选工作，本发明同时还提供了该透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置的使用方法。使用本发明挑选成熟的单精子，既节约操作者时间，又能在不破坏精子的形态、结构与活力的状态下准确选择出成熟的单精子。
附图说明
图1是培养皿盖立体示意图
图2是培养皿体立体示意图
图3是培养皿体底部立体示意图
具体实施方式
实施例1
一种透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置，包括皿体2和适配的皿盖1，优选采用透明硬质塑料制成；所述培养皿体2的尺寸为：直径50mm，高度8mm，所述皿体2的内底部中心位置一体制成有一个向上的环形凸起形成所述小凹槽21，小凹槽21的高度高于所述包被的固相透明质酸的高度，小凹槽21中包被有可结合成熟精子的固相透明质酸。也可以将小凹槽21设置于皿体2内部底部的其他合适位置，小凹槽21可采用同样可以结合成熟精子头部的固相透明质酸及其盐或衍生物来包被。
所述小凹槽21的尺寸优选为：直径9mm，高度0.6mm，根据三角函数，当操作者紧靠培养皿体2的侧壁从小凹槽21中挑选精子时的角度约为18度，经过多次试验验证，当挑选成熟精子的角度大于23度时，存在以下三方面的缺陷：第一，由于角度较大，精子注射用穿刺针或其他中空细管顶端尖头的部位容易损伤被挑选的精子；第二，由于角度过大，在重力作用下，被挑选的成熟精子容易从精子注射用穿刺针或其他中空细管中掉落；第三，精子注射用穿刺针或其他中空细管顶端尖头的位置容易刮花培养皿体2，造成干扰，增加操作者在显微镜下确认及挑选成熟精子的难度。培养皿体2和小凹槽21的尺寸也可以根据需要采取其他尺寸，只要保证操作者紧靠培养皿体2的侧壁从小凹槽21中挑选精子的角度小于23度，确保被挑选精子可以完整无损伤挑出即可。充分考虑培养皿体2的高度与直径的关系，优选培养皿体2的侧壁上沿与小凹槽21底部之间的夹角为5～23度。
皿体2的外面侧壁最好均匀分布有4个方便拿取皿体2的小耳22，使用的时候，操作者可以用拇指和食指拿起小耳22，有效避免手指或手套接触皿口，杜绝外来污染物落入皿体中妨碍精子的挑选；皿体2的底部下表面优选设有3个避免皿体2底部磨损的凸台阶23，保证在显微镜下精子的挑选工作。所述小耳22和凸台阶23的个数均可根据实际设置若干个。
通常将该固相透明质酸包被的单精子选择装置优选在在4℃冰箱环境下保存，也可以将其保存在可以在2-8℃的环境下，只要能保证固相透明质酸及其盐或衍生物保持可以结合成熟精子头部的活性即可。
当操作者进行成熟单精子挑选的时候，按以下步骤进行：
1)将所述单精子选择装置从所放置的冰箱中取出，平衡至室温；
2)用密度梯度法分离并洗涤精子，也可以根据需要采取现有技术其他分离及洗涤精子的方法；以含4mg/ml人白蛋白的培养液调节至精子数量为0.5×106个/ml的精子悬液，以提高精子被透明质酸及其盐或衍生物特异性结合的识别准确性；也可以采用含有3～5mg/ml人白蛋白的培养液调节至精子数量为0.2～1×106个/ml的精子悬液，只要能达到提高精子被透明质酸及其盐或衍生物特异性结合的识别准确性的目的即可；
3)揭下所述培养皿盖1，在所述单精子选择装置的皿体2内准备2个或多个培养液液滴用于接收挑选后的成熟精子；
4)吸取20～30ul，优选的吸取25ul经所述2)处理后的精子悬液至该单精子选择装置的小凹槽21中，使精子悬液布满小凹槽21；
5)盖上所述培养皿盖1，在25℃左右反应5min；或者在22～30℃反应1～10min；
6)揭下所述培养皿盖1，在显微镜下确定精子头部被小凹槽21内透明质酸结合至固相表面难以向前运动，但尾部鞭打剧烈的精子，这类精子即为成熟精子；
7)采用中空细管，优选用精子注射用穿刺针紧靠培养皿体2或以与皿底不大于23度的角度将所述步骤6)中确定的精子以于挑选出并放置于所述培养液滴中。
实施例2
实施例2中透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置和实施例1一样，区别仅在于挑选成熟精子时的使用方法不同，当操作者进行成熟单精子挑选的时候，按以下步骤进行：
1)将所述单精子选择装置从所放置的冰箱中取出，平衡至室温；
2)用密度梯度法分离并洗涤精子，也可以根据需要采取现有技术其他分离及洗涤精子的方法；以含4mg/ml人白蛋白的培养液调节至精子数量为0.5×106个/ml的精子悬液，以提高精子被透明质酸及其盐或衍生物特异性结合的识别准确性；也可以采用含有3～5mg/ml人白蛋白的培养液调节至精子数量为0.2～1×106个/ml的精子悬液，只要能达到提高精子被透明质酸及其盐或衍生物特异性结合的识别准确性的目的即可；
3)揭下所述培养皿盖1，在所述单精子选择装置的皿体2内分别准备2个或多个暂存挑选出的精子的培养液液滴以及抑制挑选出的精子运动的PVP液滴；
4)吸取20～30ul，优选的吸取25ul经所述2)处理后的精子悬液至该单精子选择装置的小凹槽21中，使精子悬液布满小凹槽21；
5)盖上所述培养皿盖1在显微镜热台加热至35℃反应5min，也可以根据需要在显微镜热台加热至33～37℃反应1～10min；
6)揭下所述培养皿盖1，在显微镜下确定精子头部被小凹槽21内透明质酸结合至固相表面难以前向运动，但尾部鞭打剧烈的精子，即为成熟精子；
7)采用中空细管，优选用精子注射用穿刺针紧靠培养皿体2或以与小凹槽21的底部不大于23度的角度将所述步骤6)中确定的精子挑选出，暂存于培养液液滴或放置于PVP液滴中制动。
Claims (8)
1.一种透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置，包括皿体(2)和适配的皿盖(1)，其特征在于：在所述皿体(2)内底部一体制成有小凹槽(21)，小凹槽(21)中包被有可结合成熟精子的透明质酸及其盐或衍生物，小凹槽(21)的高度高于所述包被的透明质酸及其盐或衍生物的高度；皿体(2)的外壁分布有若干个方便拿取皿体(2)且能避免接触皿体(2)皿口的小耳(22)；所述皿体(2)的底部下表面设有避免皿体(2)底部磨损的凸台阶(23)；
培养皿体(2)的边缘最高处与小凹槽(21)的底部形成的夹角为5～23度。
2.如权利要求1所述的透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置，其特征在于：所述小凹槽(21)由自所述培养皿体(2)底部向上一体形成的一个环形突起形成。
3.如权利要求1或2所述的透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置，其特征在于：所述小凹槽(21)设置在所述培养皿体(2)底部的中心位置。
4.如权利要求3所述的透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置，其特征在于：所述小凹槽(21)的尺寸为：直径9mm，高度0.6mm。
5.如权利要求4所述的透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置，其特征在于：所述培养皿体(2)的尺寸为：直径50mm，高度8mm。
6.如权利要求1～5任一项所述的透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置，其特征在于：所述皿盖(1)和皿体(2)由透明硬质塑料制成。
7.一种如权利要求1～6任一项所述的透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置的使用方法，其特征在于：
1)将所述单精子选择装置从2-8℃环境中取出，平衡至室温；
2)分离并洗涤精子，以含有3～5mg/ml人白蛋白的培养液调节得到精子数量为0.2～1×06个/ml的精子悬液，提高精子被透明质酸及其盐或衍生物特异性结合的识别准确性；
3)揭下所述培养皿盖(1)，在所述单精子选择装置的皿体(2)内准备若干个培养液液滴用于接收挑选后的成熟精子；
4)吸取20～30ul经所述2)处理后的精子悬液至该单精子选择装置的小凹槽(21)中，使精子悬液布满小凹槽(21)；
5)盖上所述培养皿盖(1)，22～30℃反应1～10min；
6)揭下所述培养皿盖(1)，在显微镜下确定精子头部被小凹槽(21)内透明质酸及其盐或衍生物包被的物质结合至固相表面难以运动，但尾部鞭打剧烈的精子；
7)用精子注射用穿刺针或其他中空细管，紧靠培养皿体2的侧壁或以与小凹槽(21)底部小于或等于23度的角度将所述步骤6)中确定的精子挑选出并放置于所述培养液滴中。
8.一种如权利要求1～6任一项所述的透明质酸及其盐或衍生物包被的单精子选择装置的使用方法，其特征在于：
1)将所述单精子选择装置从2-8℃环境中取出，平衡至室温；
2)分离并洗涤精子，以含有3～5mg/ml人白蛋白的培养液调节得到精子数量为0.2～1×06个/ml的精子悬液，提高精子被透明质酸及其盐或衍生物特异性结合的识别准确性；
3)揭下所述培养皿盖(1)，在所述单精子选择装置培养皿体(2)内准备若干个暂存挑选出的精子的培养液液滴以及抑制挑选出的精子运动的PVP液滴；
4)吸取20～30ul经所述2)处理后的精子悬液至该单精子选择装置的小凹槽(21)中，使精子悬液布满小凹槽(21)；
5)盖上所述培养皿盖(1)在显微镜热台加热至33～37℃反应1～10min；
6)揭下所述培养皿盖(1)，在显微镜下确定精子头部被小凹槽(21)内透明质酸及其盐或衍生物包被的物质结合至固相表面难以前向运动，但尾部鞭打剧烈的精子；
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20151216 |