CN105148276A

CN105148276A - 抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤的保护剂

Info

Publication number: CN105148276A
Application number: CN201510609049.1A
Authority: CN
Inventors: 徐迹; 刘文兰; 李维平
Original assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Current assignee: Shenzhen Second Peoples Hospital
Priority date: 2015-09-22
Filing date: 2015-09-22
Publication date: 2015-12-16
Anticipated expiration: 2035-09-22
Also published as: CN105148276B

Abstract

本发明涉及抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤的保护剂。本发明通过采用一氧化氮清除剂、溶酶体抑制剂、自噬体抑制剂等作为抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤的保护剂，从四个不同层面来抑制缺血导致的Claudin-5的降解，减少缺血对血脑屏障造成的损伤，实现了对血脑屏障的保护。

Description

抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤的保护剂

技术领域

本发明涉及生物药物技术领域，尤其涉及抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤的保护剂。

背景技术

缺血性脑卒中严重危害人类健康，血脑屏障损伤是缺血性脑卒中的重要病理特征，它是导致血管源性脑水肿和脑出血转化的元凶。紧密连接蛋白Claudin-5丢失或降解是血脑屏障损伤的重要分子基础。

目前临床上尚没有能有效保护血脑屏障的药物，金属基质蛋白酶抑制剂是目前BBB保护剂研发的焦点。近年来，已有越来越多的研究表明紧密连接蛋白Claudin-5是血脑屏障损伤的重要原因。本发明的发明人发现一氧化氮、Caveolin-1和溶酶体参与了缺血条件下Claudin-5的降解和血脑屏障的损伤，提示抑制一氧化氮、Caveolin-1和溶酶体可阻止缺血条件下Claudin-5的降解，从而实现对血脑屏障的保护。

发明内容

为解决现有技术的上述问题，本发明提供了抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤的保护剂，并将所述保护剂应用于制备治疗血脑屏障损伤药物中。本发明通过采用抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤的保护剂，从四个不同层面来抑制缺血所引起的Claudin-5蛋白的降解，减少缺血对血脑屏障造成的损伤。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤的保护剂，所述保护剂为一氧化氮清除剂、溶酶体抑制剂或自噬体抑制剂中的任意一种或至少两种的组合。

本发明通过采用现有的一氧化氮清除剂、溶酶体抑制剂或自噬体抑制剂中的任意一种或至少两种的组合作为Claudin-5降解抑制剂，分别通过抑制缺血引起Claudin-5降解的三个不同环节：即Claudin-5细胞内转位、自噬活化、溶酶体降解，进而抑制了缺血条件下Claudin-5的降解，从而实现了对血脑屏障损伤的有效保护。

本发明中，所述保护剂为一氧化氮清除剂、溶酶体抑制剂或自噬体抑制剂中的任意一种或至少两种的组合，例如可以是一氧化氮清除剂、溶酶体抑制剂或自噬体抑制剂中的任意一种，或者是一氧化氮清除剂和溶酶体抑制剂的组合，或者是一氧化氮和自噬体抑制剂的组合，再或者是溶酶体抑制剂和自噬体抑制剂的组合，或者是一氧化氮清除剂、溶酶体抑制剂以及自噬体抑制剂的组合。

作为本发明进一步的改进，所述保护剂为一氧化氮清除剂，所述一氧化氮清除剂为2-4-羧苯基四甲基咪唑烷-1-氧-3-氧化物(Carboxy-PTIO)。

本发明中，所述一氧化氮清除剂为羧基-PTIO(Carboxy-PTIO)；其中，所述的Carboxy-PTIO分子量为315.39，分子式为C₁₄H₁₆KN₂O₄，CAS号为148819-94-7。

本发明中的一氧化氮清除剂优选为Carboxy-PTIO但不限于此，例如还可以选自含有非血红素铁的肽或蛋白质、卟啉、金属卟啉、二硫代氨基甲酸酯、二巯基琥珀酸、邻二氮杂菲、去铁敏、吡哆醛异烟酰腙(PIH)、1,2-二甲基-3-羟基嘧啶-4-酮(L1)、[+]1,2-双(3,5-二氧代哌嗪-1-基)丙烷(ICRF-187)、2-巯基烟酸、硝酸灵基氨基氧、2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧基-3-氧化物(PTIO)、苯基-n-叔-丁基亚硝酮以及上述两种或多种的组合。

本发明中，所述一氧化氮清除剂通过抑制缺血条件下Caveolin1所介导的Claudin-5向细胞内转位从而抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤(此为Claudin-5降解的第一步)。具体过程为：在氧糖剥夺的环境下，胞浆成分(Cytosolicfraction，CF)的Caveolin-1(Cav-1)蛋白含量增加，同时伴有细胞骨架成分(Actincytoskeletonfraction，ACF)的Cav-1蛋白水平的降低。使用一氧化氮清除剂或一氧化氮合成酶抑制剂后发现，细胞上述变化被完全阻止抑制。

作为本发明进一步的改进，所述溶酶体抑制剂为氯喹(chloroquine)。

本发明中的溶酶体抑制剂优选为氯喹(chloroquine)但不限于此，例如还可以为反式-环氧琥珀酰-L-亮氨酰胺-(4-胍基)丁烷(trans-epoxysaccinyl-L-leucylamide-(4-guanidino)butane)、L-蛋氨酸甲酯、氯化铵、甲胺及其盐或类似物所组成的群组。

本发明中，所述溶酶体抑制剂作用于Claudin-5的降解，其具体过程为：细胞经氧糖剥夺处理4小时后，Claudin-5蛋白水平明显降低，加入溶酶体抑制剂后，Claudin-5减少可完全被抑制，说明溶酶体在缺血所引起的Claudin-5蛋白降解中发挥重要作用。

作为本发明进一步的改进，所述自噬体抑制剂为3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine3-MA)。

本发明中的自噬体抑制剂优选为3-MA但不限于此，例如还可以选自3-甲基腺苷、腺苷、冈田酸、N6-巯基嘌呤核糖核苷N6-MPR)、5-氨基-4-咪唑甲酰胺核糖核苷(AICAR)、巴佛洛霉素A1及其盐或类似物所组成的群组。

本发明中，所述自噬体抑制剂作用于Claudin-5的降解，其具体过程为：溶酶体和自噬体参与了Claudin-5最终的降解，使用自噬抑制剂(3-MA)，氧糖剥夺所引起的Claudin-5的降解被完全抑制。

第二方面，本发明还提供了一种如第一方面所述的保护剂在制备用于治疗血脑屏障损伤药物中的应用。

本发明中的一氧化氮清除剂在制备用于治疗血脑屏障损伤药物中的应用，其中，所述一氧化氮清除剂通过抑制缺血条件下Caveolin1所介导的Claudin-5向细胞内转位从而抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤。

本发明中的溶酶体抑制剂在制备用于治疗血脑屏障损伤药物中的应用，其中，所述溶酶体抑制剂用于抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤。

本发明中的自噬体抑制剂在制备用于治疗血脑屏障损伤药物中的应用，其中，所述自噬体抑制剂用于抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤。

作为本发明进一步的改进，本发明的保护剂和药物赋形剂或辅料形成药物组合物。

本发明的药物组合物可包含在药学上可接受的赋形剂。所述的赋形剂优选地含有少量的添加剂，例如增强等张性和化学稳定性的物质。前述物质在使用的剂量和浓度下，对接受者不具有毒性，并且包括如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐、乳酸盐、酒石酸盐和其他有机酸或其盐类的缓冲溶液；三羟基甲基氨基甲烷(TRIS)、二碳酸盐、碳酸盐和其他有机碱及其盐类；如抗坏血酸的抗氧化剂；如多精氨酸、多赖氨酸、多谷氨酸或多门冬氨酸的低分子量(例如少于约10个残基)多肽；如血清蛋白、明胶或免疫球蛋白的蛋白质；如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚丙二醇(PPG)和聚乙二醇(PEG)的亲水聚合体；如甘氨酸、谷氨酸、门冬氨酸、组氨酸、赖氨酸或精氨酸的氨基酸；单糖、双糖和其他包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖、蔗糖、糊精或如肝磷脂、硫酸软骨素或硫酸右旋糖酐的硫酸化碳水化合物衍生物的碳水化合物；如包括钙离子、镁离子和锰离子二价金属离子的多价金属离子；如乙二胺四乙酸(EDTA)的螯合剂；如甘露醇或山梨糖醇的糖醇；如钠或铵的抗衡离子；及/或如聚山梨醇酯或泊洛沙姆的非离子表面活性剂。其他添加剂可包括以常规量存在的稳定剂、抗菌剂、惰性气体、液体和营养补充剂(例如Ringer右旋糖)、电解质补充剂及其类似者等。

作为本发明进一步的改进，所述保护剂通过静脉内或皮下给药。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

本发明通过采用一氧化氮清除剂、溶酶体抑制剂、自噬体抑制剂等作为抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤的保护剂，从四个不同层面抑制缺血所引起的Claudin-5的降解，实现了对血脑屏障的保护。

附图说明

图1是氧糖剥夺诱导Claudin-5转位至细胞内的示意图；

图2是本发明通过从四个不同层面抑制氧糖剥夺所引起的Claudin-5的降解；

其中，图2-a是直接通过干预Caveolin-1来抑制Claudin-5的转位；图2-b是通过干预一氧化氮来抑制Caveolin-1，从而间接抑制Claudin-5的转位；图2-c是通过干预溶酶体来抑制Claudin-5的降解；图2-d是通过干预细胞自噬来抑制Claudin-5的降解。

具体实施方式

以下将结合附图，通过具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1

图1显示氧糖剥夺诱导Claudin-5转位至细胞内的示意图，图2是本发明从四个不同层面抑制氧糖剥夺所引起的Claudin-5的降解。

其中，图2-a是通过直接干预Caveolin-1抑制氧糖剥夺所引起的Claudin-5的转位，通过图2-a可以看出，敲低Cav-1基因表达后，细胞总Claudin-5的水平不发生变化，但氧糖剥夺所引起的胞浆内Claudin-5水平的增加以及细胞骨架上Claudin-5蛋白含量的减少被完全阻止，说明抑制Cav-1可阻止氧糖剥夺引起Claudin-5从细胞骨架向胞浆内转移。

实施例2

图2-b显示通过干预一氧化氮进而抑制Caveolin-1介导Claudin-5向胞内转位的过程。

从图2-b可以看出，在氧糖剥夺环境下，胞浆(CF)内的Cav-1水平增加，而细胞骨架(ACF)的Cav-1水平降低，在一氧化氮清除剂羧基-PTIO(C-PTIO)或一氧化氮诱导合酶抑制剂1400W干预下，Cav-1的上述变化被完全抑制。

实施例3

图2-c显示通过干预溶酶体抑制Claudin-5降解的过程。

从图2-c可以看出，使用溶酶体抑制剂氯喹(chloroquine)，但不是蛋白酶体抑制剂MG132，能阻止氧糖剥夺所引起的Claudin-5的降解，说明溶酶体在Claudin-5降解中发挥重要作用。

实施例4

图2-d显示通过干预细胞自噬抑制Claudin-5降解的过程。

从图2-d可以看出，使用自噬抑制剂(3-MA)或溶酶体-自噬体融合的抑制剂(BFA1)，可完全阻止氧糖剥夺条件下Claudin-5的降解，表明氧糖剥夺条件下Claudin-5的降解是通过自噬体-溶酶体蛋白降解途径来实现的。

通过上述实例1-4可以看出，本发明从缺血引起Claudin-5蛋白降解的分子机制入手，针对Claudin-5蛋白降解过程的不同分子节点，设计相对应的抑制药物或它们的组合，有效抑制缺血条件下Claudin-5的降解，保护血脑屏障，减少缺血性脑损伤。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims

1.一种抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤的保护剂，其特征在于，所述保护剂为一氧化氮清除剂、溶酶体抑制剂或自噬体抑制剂中的任意一种或至少两种的组合。

2.根据权利要求1所述的保护剂，其特征在于，所述一氧化氮清除剂为2-4-羧苯基四甲基咪唑烷-1-氧-3-氧化物。

3.根据权利要求1或2所述的保护剂，其特征在于，所述溶酶体抑制剂为氯喹。

4.根据权利要求1-3任一项所述的保护剂，其特征在于，所述自噬体抑制剂为3-甲基腺嘌呤。

5.根据权利要求1-4任一项所述的保护剂在制备用于治疗血脑屏障损伤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述一氧化氮清除剂通过抑制缺血条件下Caveolin1所介导的Claudin-5向细胞内转位从而抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述溶酶体抑制剂用于抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤。

8.根据权利要求5-7任一项所述的应用，其特征在于，所述自噬体抑制剂用于抑制Claudin-5降解阻止缺血性血脑屏障损伤。

9.根据权利要求5-8任一项所述的应用，其特征在于，所述保护剂和药物赋形剂或辅料形成药物组合物。

10.根据权利要求5-9任一项所述的应用，其特征在于，所述保护剂通过静脉内或皮下给药。