CN105136916A - 促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法及胡桃醌与胡桃酮的含量测定方法 - Google Patents

Abstract

促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法及胡桃醌与胡桃酮的含量测定方法，它涉及一种胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法及胡桃醌与胡桃酮的含量测定方法。解决了目前因产地不同北青龙衣中胡桃醌差异性大，导致利用北青龙衣制备的抗癌药物质量难以掌控的问题。水解方法：将青龙衣粉末加入甲醇溶液进行超声处理，冷却后滤过，取滤液加入酸性溶液回流水解，即实现北青龙衣中结合型胡桃酮苷水解为游离型胡桃酮。测定方法：采用高效液相梯度检测。本发明方法促使北青龙衣中结合型胡桃酮苷水解为游离型胡桃酮，使不同产地北青龙衣的抗肿瘤活性主要成分含量达到稳定，从而保证了北青龙衣抗癌药物的质量和稳定性。

Description

促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法及胡桃醌与胡桃酮的含量测定方法

技术领域

本发明涉及一种胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法及胡桃醌与胡桃酮的含量测定方法。

背景技术

癌症是威胁人类生命的严重疾病，抗癌药物的研究与开发一直是世界医药学界关注的热点。癌症的复发和转移是癌症患者两大主要死因，标志着治疗失败。中医药通过多途径综合治疗及调动机体整体防御体系，在癌症的治疗领域展现出越来越重要的作用。

北青龙衣又称核桃青皮，为胡桃科植物核桃揪(juglansmandshuricaMaxim)的未成熟外果皮。主要分布在我国黑龙江省东部，小兴安岭、完达山、老爷岭及张广才岭等山区。作为一种民间药在我国的应用由来己久，最初记载于《开宝本草》，称之为胡桃青龙，《救急方》中称之为青胡桃皮，自《山东中草药手册》称之为“青龙衣”后，现多延用此名。其药性苦、涩，古代医家多以其清热解毒、祛风疗癣、止痛止痢功效入药，近年来因其抗肿瘤效果突出而备受国内外学者的广泛关注。青龙衣含有萘醌及其苷类、黄酮及其苷类、鞣质、二芳基庚烷类、萜类、有机酸类等化学成分，具有显著的抗肿瘤活性，对胃癌、肝癌、淋巴癌、乳腺癌、白血病的肿瘤细胞均具有较好的体内外抑瘤作用。

2001年，北青龙衣药材收载于《黑龙江省中药材标准》，2004年黑龙江省中医药科学院以其为主要原料开发了医院制剂复方青龙衣胶囊(药制字(2004)Z第0061)，并且经大量临床病例证明其抗肿瘤疗效确切。该药物具有抗肿瘤、调节免疫、止癌痛、抗转移与化药协同增效五种疗效。

萘醌类成分是北青龙衣中公认的最有效的抗肿瘤成分，胡桃醌为其代表性化合物。由于北青龙衣中胡桃醌的含量产地差异性大，所以目前利用北青龙衣制备的抗癌药物质量难以掌控，严重的影响了北青龙衣在临床的使用和治疗效果。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前因产地不同北青龙衣中胡桃醌差异性大，导致利用北青龙衣制备的抗癌药物质量难以掌控的问题，而提供的一种促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法及胡桃醌与胡桃酮的含量测定方法。

本发明促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法按以下步骤进行：

将青龙衣粉末加入甲醇溶液进行超声处理，冷却后滤过，取滤液加入酸性溶液回流水解，即实现北青龙衣中结合型胡桃酮苷水解为游离型胡桃酮。

胡桃醌与胡桃酮的含量测定方法，采用高效液相梯度检测，检测波长为265nm，进样量为10μl，流速为1ml/min；梯度洗脱条件为初始流动相中甲醇与水的浓度配比为45ml：55ml，第30～35min流动相中甲醇与水的浓度配比为75ml：25ml，第35min之后流动相中甲醇与水的浓度配比为45ml：55ml。

胡桃酮苷是北青龙衣中另外一种含量较高的萘醌类衍生物，胡桃酮苷在北青龙衣中以苷和苷元的形式同时存在，胡桃醌与胡桃酮苷水解产物胡桃酮的含量之和在各产地北青龙衣之间相对稳定，约为2mg/g～2.5mg/g。因此，本发明方法促使北青龙衣中结合型胡桃酮苷水解为游离型胡桃酮，使不同产地北青龙衣的抗肿瘤活性主要成分含量达到稳定，从而保证了北青龙衣抗癌药物的质量和稳定性，使北青龙衣临床使用的安全性和可靠性大幅提升。

由于胡桃醌与胡桃酮的分子式极为接近，分子量也相近，所以其他方法难以将胡桃醌与胡桃酮加以区分。本发明胡桃醌与胡桃酮的含量测定方法，不仅能够将胡桃醌与胡桃酮明确的区别分开，而且可以准确的测定其含量，并具有准确性高的特点。

附图说明

图1是实施例11中对照品高效液相梯度检测结果图。

图2是实施例11中水解液高效液相梯度检测结果图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法按以下步骤进行：

将青龙衣粉末加入甲醇溶液进行超声处理，自然冷却至室温后滤过，取滤液加入酸性溶液回流水解，即实现北青龙衣中结合型胡桃酮苷水解为游离型胡桃酮。

其中，青龙衣粉末与甲醇溶液的比例为0.5g～3g：25ml；超声处理时间为40min，超处理频率为30～70kHZ；回流温度为70±5℃，回流时间为1±0.2h。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一的不同点是：甲醇溶液的浓度为20％～100％。其它步骤及参数与实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二的不同点是：滤液与酸性溶液的体积比为15：1.5～14。其它步骤及参数与实施方式一或二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一的不同点是：酸性溶液的体积浓度为25％。其它步骤及参数与实施方式一至三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一的不同点是：酸性溶液为盐酸或硫酸。其它步骤及参数与实施方式一至四相同。

具体实施方式六：本实施方式按以下步骤测定胡桃醌与胡桃酮的含量：采用高效液相梯度检测，检测波长为265nm，进样量为10μl，流速为1ml/min；梯度洗脱条件为初始流动相中甲醇与水的浓度配比为45ml：55ml，第30～35min流动相中甲醇与水的浓度配比为75ml：25ml，第35min之后流动相中甲醇与水的浓度配比为45ml：55ml。

实施例1

促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法按以下步骤进行：

将青龙衣粉末加入甲醇溶液进行超声处理，自然冷却至室温后滤过，取滤液加入体积浓度为25％的HCl中回流水解，即实现北青龙衣中结合型胡桃酮苷水解为游离型胡桃酮。

其中，青龙衣粉末与甲醇溶液的比例为2g：25ml；甲醇溶液的体积浓度为30％；超声处理时间为40min，超处理频率为50kHZ；回流温度为60℃，回流时间为1h；滤液与盐酸溶液的体积比为15：7。

实施例2

本实施例与实施例1的区别点在于甲醇溶液的体积浓度为60％。

实施例3

本实施例与实施例1的区别点在于甲醇溶液的体积浓度为100％。

实施例1～3北青龙衣水解前后胡桃酮、胡桃醌的含量如表1所示。

表1

实施例4

促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法按以下步骤进行：

将青龙衣粉末加入甲醇溶液进行超声处理，自然冷却至室温后滤过，取滤液加入体积浓度为25％的HCl中回流水解，即实现北青龙衣中结合型胡桃酮苷水解为游离型胡桃酮。

其中，北青龙衣粉末与甲醇溶液的比例为2g：25ml；甲醇溶液的体积浓度为60％；超声处理时间为40min，超处理频率为40kHZ；回流温度为60℃，回流时间为1h；滤液与盐酸溶液的体积比为15：7。

实施例5

本实施例与实施例4的区别点在于取滤液加入0.2mol/LNaOH溶液中回流水解；滤液与NaOH溶液的体积比为15：7。

实施例6

本实施例与实施例4的区别点在于滤液挥干后加入酶液中60℃水解30min，之后沸水灭活；1gα-淀粉酶加入50mlpH值6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中配置成本实施例酶液；滤液与酶液的体积比为15：7。

实施例4～6北青龙衣水解前后胡桃酮、胡桃醌的含量如表2所示。

表2

酸性条件下水解能够增加胡桃酮的含量，碱性条件下水解胡桃醌、胡桃酮含量均显著降低，而酶水解对二者含量均无影响。

实施例7

本实施例与实施例4的区别点在于取滤液加入体积浓度为25％的H2SO4溶液中回流水解；滤液与H2SO4溶液的体积比为15：7。

实施例4和7北青龙衣水解前后胡桃酮、胡桃醌的含量如表3所示。

表3

实施例8

本实施例与实施例4的区别点在于滤液与盐酸溶液的体积比为15：1.75。

实施例9

本实施例与实施例4的区别点在于滤液与盐酸溶液的体积比为15：3.5。

实施例10

本实施例与实施例4的区别点在于滤液与盐酸溶液的体积比为15：14。

实施例4和8～10北青龙衣水解前后胡桃酮、胡桃醌的含量如表4所示。

表4

实施例11

实施例4获得的盐酸水解液采用以下步骤测定胡桃醌与胡桃酮的含量：采用高效液相梯度检测，检测波长为265nm，进样量为10μl，流速为1ml/min；梯度洗脱条件为初始流动相中甲醇与水的浓度配比为45ml：55ml，第30～35min流动相中甲醇与水的浓度配比为75ml：25ml，第35min之后流动相中甲醇与水的浓度配比为45ml：55ml。

对照品：精密称取胡桃酮对照品1.5mg、胡桃醌对照品1mg，置25ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml含胡桃酮0.06mg、胡桃醌0.04mg的溶液。

对照品高效液相梯度检测结果如图1所示(峰1为胡桃酮对照品；峰2为胡桃醌对照品)。本实施例水解液高效液相梯度检测结果如图2所示。

本发明方法胡桃醌与胡桃酮的分离度均大于1.5，理论塔板数不低于3000。

实施例12

精密称取胡桃酮、胡桃醌，置25ml容量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成含胡桃酮、胡桃醌的混合对照溶液，再依次稀释为5个不同梯度。分别采用具体实施方式六的方法进行高效液相梯度检测。

胡桃酮的质量浓度分别为7.9μg/ml、15.8μg/ml、31.6μg/ml、63.2μg/ml和126.4μg/ml，胡桃酮峰面积为238351.6、466703.3、973406.5、1845863.1和3713626.4。以胡桃酮峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程：y＝29242x+15298，r＝0.9994。结果表明，胡桃酮在7.9μg/ml～126.4μg/ml范围内线性关系良好。

胡桃醌的质量浓度分别为10.3μg/ml、20.6μg/ml、41.2μg/ml、82.4μg/ml和164.8μg/ml，胡桃酮峰面积为97.9、205.9、415.7、821.4和1631.8。以胡桃醌峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程：y＝9.905x+1.966，r＝0.9995。结果表明，胡桃醌在10.3μg/ml～164.8μg/ml范围内线性关系良好。

在上述色谱条件下，分别取胡桃酮、胡桃醌混合对照溶液连续进样5次，5次的检测结果如表5所示。

表5

连续进样5次的检测结果说明本发明胡桃醌与胡桃酮的含量测定方法日内精密度高。

实施例13

将实施例4获得的盐酸水解液放置在室温环境中，分别选取放置0、0.5、1、2、3、6、12、24和48h的水解液采用具体实施方式六中的方法进行检测。放置不同时间的水解液中胡桃酮、胡桃醌的含量如表6所示。

表6

实验证明实施例4获得的盐酸水解液在48h内稳定性好。

实施例14

同一批次的北青龙衣粉末，分成5份，按照实施例4的方法进行水解，然后采用具体实施方式六中的方法进行检测，检测结果如表7所示。

表7

实验结果说明本发明胡桃醌与胡桃酮的含量测定方法重复性好。

实施例15

按照实施例4的方法进行北青龙衣水解，不同点在于在北青龙衣粉末加入甲醇溶液的同时，向甲醇溶液中加入纯胡桃酮对照品和纯胡桃醌对照品，甲醇溶液中纯胡桃酮的加入量为5.6mg/100ml，甲醇溶液中纯胡桃醌的加入量为2.0mg/100ml。

分别检测胡桃酮、胡桃醌含量，检测结果如表8和表9所示。

表8胡桃酮加样回收率结果

表9胡桃醌加样回收率结果

回收率计算公式：回收率％＝(C－A)/B×100％

回收率计算公式中A为北青龙衣水解样品中被测成分含量；B为对照品加入量；C为实测值。

实施例16

采用具体实施方式六的方法对同年采集的不同产地北青龙衣水解(水解方法采用实施例4的方法)前后胡桃酮、胡桃醌含量进行检测。

表10水解前(n＝3)

表11水解后(n＝3)

通过表10与表11的对比发现，未经过水解的北青龙衣，因产地的不同，胡桃酮与胡桃醌的含量总和相差较大；经过本发明方法水解后，不同产地的北青龙衣，其胡桃酮与胡桃醌的含量总和均在2～2.5mg/g之间，含量相对稳定。因此，利用本发明方法水解后的北青龙衣制备抗癌药物，其产品种抗癌活性成分含量稳定，疗效得以保证。

分析认为胡桃酮苷、胡桃酮和胡桃醌之间存在某种转化关系，因此，胡桃酮与胡桃醌含量之和相对稳定。

Claims (7)

1.一种促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法，其特征在于促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法按以下步骤进行：

将青龙衣粉末加入甲醇溶液进行超声处理，冷却后滤过，取滤液加入酸性溶液回流水解，即实现北青龙衣中结合型胡桃酮苷水解为游离型胡桃酮。

2.根据权利要求1所述的一种促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法，其特征在于甲醇溶液的浓度为20%～100%。

3.根据权利要求1所述的一种促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法，其特征在于甲醇溶液的浓度为60%。

4.根据权利要求1所述的一种促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法，其特征在于滤液与酸性溶液的体积比为15：1.5～14。

5.根据权利要求4所述的一种促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法，其特征在于酸性溶液的体积浓度为25%。

6.根据权利要求4所述的一种促使北青龙衣中胡桃酮苷水解为胡桃酮的方法，其特征在于酸性溶液为盐酸或硫酸。

7.胡桃醌与胡桃酮的含量测定方法，其特征在于按以下步骤测定胡桃醌与胡桃酮的含量：采用高效液相梯度检测，检测波长为265nm，进样量为10μl，流速为1ml/min；梯度洗脱条件为初始流动相中甲醇与水的浓度配比为45ml：55ml，第30～35min流动相中甲醇与水的浓度配比为75ml：25ml，第35min之后流动相中甲醇与水的浓度配比为45ml：55ml。