CN105136541A - 一种刀鲚耳石微化学分析前处理的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种刀鲚耳石微化学分析前处理的方法，它包括以下步骤：耳石摘取后清洗晾干、将耳石固定在耳石固定模具的底板上表面、配制试剂、将试剂加入到耳石固定模具中形成圆柱状树脂、打磨圆柱状树脂、将耳石转移至载玻片上、形成耳石切片与清洗后烘干耳石切片步骤；本发明的方法作为刀鲚耳石微化学分析前处理方法，在满足了微化学分析所需样品条件的前提下，与鱼类耳石这种生物组织的本体特征相结合。经过本处理方法处理的刀鲚耳石样品，可以满足电子探针分析、激光烧蚀电感耦合等离子质谱分析、稳定同位素分析等多种分析需求，统一了各种耳石微化学分析所需要的样品前处理方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种刀鲚耳石微化学分析前处理的方法，本发明属于生物监测环境技术领域。
背景技术
刀鲚（Coilianasus）作为“长江三鲜”之一，一直以来都是重要的渔获物。但是近年来，由于受到酷渔滥捕、生境破坏、洄游通道阻隔等影响，其汛期产量已大幅度锐减，群体小型化、低龄化问题严重。然而，作为一种洄游型鱼类，刀鲚淡水产卵孵化、海水育肥成长的复杂生活史特征使得对其洄游生态学中的环境履历特征、洄游模式、群体起源和关联性等问题迟迟得不到有效地解决。进而为其资源保护、合理评估、人工繁育、增殖等工作带来困难。所幸的是，近年来随着耳石微化学研究的发展，鱼类耳石上的微化学信息已经被广泛证明适用于解决洄游型鱼类生态学上的诸多难题。
鱼类耳石是其内耳半规管中的硬组织，共有三对，分别为矢耳石、星耳石和微耳石。其中矢耳石作为体积最大的耳石常被用于各种耳石研究。由于耳石在鱼体内随着鱼的生长围绕耳石核心不断包裹积累，其上每一层积累的元素信息与鱼所栖息的环境息息相关。基于这样的情况，耳石在经过制成耳石核心暴露的薄片后，进而分析耳石径（自耳石核心至耳石边缘）上的微化学信息，可了解该鱼整个生活史过程中的环境履历情况。在耳石微化学分析中，常用的分析设备有电子探针微区分析仪（EPMA）、激光烧蚀电感耦合等离子质谱仪（LA-ICPMS）、稳定同位素分析仪（IRMS）等一系列应用于金属、矿物等领域的大型、高新、精密仪器。然而，由于以上这些分析仪器原来所涉及的样品多为金属、矿物等而并非鱼类耳石，这使得一些原有的样品前处理方法并不适用于鱼类耳石这种生物组织的微化学分析。于此同时，鱼类学中以往用于微结构研究的处理方法也并不符合以上这些分析仪器的分析要求（如样品需要抛光、镶嵌物需要较高的硬度和一定的耐热性等）。因此，尽快解决鱼类耳石微化学分析中，耳石样品前处理的技术难题，对于开展鱼类耳石微化学研究，进而深入鱼类生态学研究工作具有十分重要的意义。本发明所涉及的刀鲚耳石微化学分析前处理的方法，结合传统鱼类学耳石微结构研究和微化学分析的需要，优化相应的样品处理方法，同时满足不同的研究需要。并且为其他鱼类耳石微化学分析提供借鉴，也为利用耳石微化学技术在我国渔业科技方面做出突破性进展提供技术支持。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中存在的不足，提供一种可以更好地结合耳石轮纹分析和微化学分析结果对鱼类生态学相关问题进行研究和解析并能够同时满足于多种研究需要的一种刀鲚耳石微化学分析前处理的方法。
按照本发明提供的技术方案，所述一种刀鲚耳石微化学分析前的处理方法包括以下步骤：
a、耳石在经过摘取后，首先使用去离子水清洗以除去粘液和包膜，然后用纯酒精进一步清洗耳石表面以除去有机质，最后将耳石移入细胞培养板并在室温条件下晾干；
b、取耳石固定模具，该耳石固定模具为内径在25~30毫米、高度在30~40毫米的且一端具有底板的圆管状物体，使用AB胶水将已经晾干的耳石固定在耳石固定模具的底板上，使得耳石较为弯曲的一面与耳石固定模具的底板上表面接触，备用；
c、将环氧树脂与三乙烯四氨依次加入到器皿中并搅拌均匀配制成试剂，环氧树脂与三乙烯四氨的质量比为6~7:1；
d、将试剂加入到耳石固定模具中，每个耳石固定模具对应加入3.5~4克试剂，然后将模具型腔放入压力为0.15~0.36巴的真空镶嵌机内抽气以去除耳石固定模具中试剂内的气泡，最后将耳石固定模具放入35~38℃的烘箱内烘烤，使得耳石固定模具内的试剂凝固，形成圆柱状树脂；
e、将圆柱状树脂从耳石固定模具内取出，先使用粗砂纸粗磨具有耳石的圆柱状树脂的一端，再用细砂纸精磨耳石，使得耳石大部分暴露，但耳石核心尚未暴露；
f、将AB胶水加热融化呈水样后，取水样AB胶滴在写好样本号的载玻片上，随后将打磨至耳石暴露的圆柱状树脂以耳石暴露的一面向下黏贴在载玻片上，压紧并去除气泡，静置使得AB胶水凝固；
g、使用切割机切除载玻片另一端对应的圆柱状树脂，使用砂纸打磨耳石，使得耳石的核心暴露，使用抛光机并依次采用抛光液和自来水对耳石的核心面进行连续抛光，最后使用切割机切去除耳石及样本标签外多余的玻璃和树脂部分，得到耳石切片；
h、将耳石切片清洗干净后用35~38℃的烘箱烘干。
步骤a具体为：耳石在经过摘取后，使用去离子水清洗3~4分钟以除去粘液和包膜，再用纯酒精进一步清洗表面有机质1~2分钟，并在8~10倍的放大镜下检查是否有残留有机质，随后将耳石移入48孔细胞培养板，并在室温条件下晾干10~15小时。
步骤b中，在干净的铝箔纸上取用3~4毫升的AB胶水并搅拌1~2分钟后，在酒精灯上加热10~20秒使AB胶水呈水样后，然后取0.05~0.1毫升的AB胶水滴加在耳石固定模具的底板上表面上，将干燥好的耳石的较为弯曲的一面放置于AB胶水上，下压至与底板接触，并确认其呈水平放置后静置45~60分钟等待AB胶水充分凝固。
步骤d中，抽气时间控制在15~20分钟。
步骤e具体为：将已经凝固的圆柱状树脂从耳石固定模具内取出，先在在500目砂纸上粗磨至耳石将要暴露后，换用1200目砂纸继续精磨至耳石大部分暴露，但耳石核心尚未暴露。
步骤f具体为：在干净的铝箔纸上以每个样品取用2~3毫升的AB胶水的标准取用AB胶水并搅拌1~2分钟后，在酒精灯上加热10~20秒使其呈水样后，在一块中间写好样本号的载玻片上滴3~4毫升的混匀后的AB胶水，随后将打磨至耳石暴露的树脂块以耳石暴露的一面向下黏贴在载玻片上，压紧并去除气泡，等待45~60分钟使AB胶水充分凝固。
步骤g具体为：使用切割机切除载玻片另一端对应的圆柱状树脂，先用70微米砂轮打磨至耳石即将暴露，再用500目砂纸打磨耳石树脂片至耳石刚要暴露，最后换用1200目砂纸进行精磨至正反金相显微镜下都能看清耳石核心，使用抛光机对耳石切片进行抛光，先用抛光液进行抛光2~3分钟，随后换用自来水抛光1~2分钟，抛光后耳石切片使用金相显微镜的反射光进行检查，确定表面无明显划痕后使用切割机切去除耳石及样本标签外多余的玻璃和树脂部分。
步骤h具体为：用去离子水清洗切下的耳石切片6遍后，将耳石切片放于干净的烧杯中，并加入适量Milli-Q水超声清洗3~6分钟，将超声清洗后的耳石切片取出，并再次用Milli-Q水淋洗6遍，将清洗好的耳石切片放置于干净纸巾上并放置于培养皿内，随后放入35~38°C烘箱干燥12~24小时即完成耳石切片制作。
本发明具有以下优点：
本发明的方法作为刀鲚耳石微化学分析前处理方法，在满足了微化学分析所需样品条件的前提下，与鱼类耳石这种生物组织的本体特征相结合。经过本处理方法处理的刀鲚耳石样品，可以满足电子探针分析（EPMA）、激光烧蚀电感耦合等离子质谱分析（LA-ICPMS）、稳定同位素分析（IRMS）等多种分析需求，统一了各种耳石微化学分析所需要的样品前处理方法；
本发明的方法弥补了以往固体样品微化学分析中缺少针对鱼类耳石样品分析的专有处理方法的缺陷，结合鱼类耳石本身的特征，改进了固体样品微化学分析中有关冷镶嵌样品的加工工艺，可以根据样品分析的需要制备较薄的耳石切片，同时保证耳石核心不被处理掉。
本发明的方法也解决了传统的耳石微结构分析处理后耳石样品不适合微化学分析的情况，与传统的耳石微结构分析样品处理不同的是本方法使用的是微化学分析常用的冷镶嵌树脂，与传统的指甲油、树胶、热熔胶等镶嵌材料相比具有硬度强、透明度高、支持性好、热稳定性好等特征，从而解决了以往耳石微结构分析样品无法用于微化学分析的情况。
附图说明
图1是耳石样本14WWCE04矢状面从核心到边缘的定量线分析记录到的锶钙元素比值变化情况图。
图2是耳石样本14WWCE04矢状面二维锶元素含量的面分布情况图。
图3是耳石样本14WWCE14矢状面从核心到边缘的定量线分析记录到的锶钙元素比值变化情况图。
图4是耳石样本14WWCE14矢状面二维锶元素含量的面分布情况图。
图5是耳石样本14WWCE19矢状面从核心到边缘的定量线分析记录到的锶钙元素比值变化情况图。
图6是耳石样本14WWCE19矢状面二维锶元素含量的面分布情况图。
图7是基于耳石核心的多元素含量主成分分析图；
在图7中，横坐标F1为0.219×Na-0.056×Mn+0.240×Fe+0.241×Ni+0.182×Cu-0.154×Sr-0.181×Ba的结果；纵坐标F2为0.315×Na+0.638×Mn+0.091×Fe+0.155×Ni+0.021×Cu+0.372×Sr+0.218×Ba的结果；其中，Na、Mn、Fe、Ni、Cu、Sr与Ba表示耳石分析所测各元素与钙元素的摩尔浓度比值。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种刀鲚耳石微化学分析前处理的方法，采用以下工艺步骤：
a、刀鲚标本于2014年6月上旬采自长江安徽无为江段，取其中1尾标本测量基本生物学数据后，摘取左耳石并使用去离子水清洗3分钟以除去粘液和包膜，后再用纯酒精进一步清洗表面有机质2分钟，并在10倍的放大镜下检查是否有残留有机质，随后将耳石移入48孔细胞培养板，并在室温条件下晾干12小时，得到耳石样本14WWCE04；
b、在干净的铝箔纸上取用4毫升的AB胶水（由日本小西株式会社提供，A胶为环氧树脂，B胶为聚硫醇固化剂）并搅拌1分钟后，在酒精灯上加热15秒使其呈水样后，分别在直径为25毫米、高度在30毫米的耳石固定模具的底板上表面滴加0.08毫升的加热混匀后的AB胶水，迅速将干燥好的耳石的较为弯曲的一面放置于AB胶水上，下压至于模具底部接触，并确认其呈水平放置后静置45分钟等待AB胶水充分凝固；
c、称取环氧树脂35克与三乙烯四氨5克，在同一个一次性纸杯内先后倒入，随后使用木棒作缓速、圆周搅拌5分钟，搅拌过程中注意去除气泡，配制成试剂；
d、以每个模具添加4克试剂的标准将搅拌好的试剂依次加入模具中，然后将其放入压力为0.15巴的真空镶嵌机内进行20分钟的抽气以进一步去处试剂内的气泡，去除完气泡后将模具放入烘箱内以35℃凝固12小时；
e、将已经凝固的树脂从模具中取出，并在500目砂纸上粗磨至耳石将要暴露后，换用1200目砂纸继续精磨至耳石大部分暴露，但耳石核心尚未暴露；
f、在干净的铝箔纸上取用20毫升的AB胶水（日本小西株式会社）并搅拌1分钟后，在酒精灯上加热15秒使其呈水样后，在一块中间写好样本号的载玻片上滴2毫升的混匀后的AB胶水，随后将打磨至耳石暴露的树脂块以耳石暴露的一面向下黏贴在载玻片上，注意压紧并去除气泡，等待45分钟使AB胶水充分凝固；
g、使用切割机切除除耳石部分的树脂后，换用70微米砂轮打磨至耳石即将暴露，用500目砂纸打磨耳石树脂片至耳石刚要暴露，换用1200目砂纸进行精磨至正反金相显微镜下都能看清耳石核心，使用抛光机对耳石切片进行抛光，先用抛光液进行抛光2分钟，随后换用自来水抛光1分钟，抛光后耳石切片使用金相显微镜的反射光进行检查，确定表面无明显划痕后使用切割机切去除耳石及样本标签外多余的玻璃和树脂部分，得到耳石切片；
h、用去离子水清洗切下的耳石切片6遍后，将耳石切片放于干净的烧杯中，并加入适量Milli-Q水超声清洗6分钟，将超声清洗后的耳石切片取出，并再次用Milli-Q水淋洗6遍，将清洗好的耳石切片放置于干净纸巾上并放置于培养皿内，随后放入35~38°C烘箱干燥12小时。
将以上制备好的样品镀碳膜后（25秒，36安培，JEE420，日本电子株式会社）进行电子探针微区分析仪分析（日本电子株式会社，简称EPMA），具体参数设定为：定量线分析使用碳酸钙（CaCO3）和钛酸锶（SrTiO3）作为标准物质，电压参数为15千伏，电子束电流为2.0×10-8安培，束斑直径为5微米，每点驻留时间为15秒，每间隔10微米测量下一点；面分布分析电压参数为15千伏，电子束电流为5.0×10-8安培，束斑直径为5微米，每点驻留时间为30毫秒。
将上述分析所获定量线分析整理并绘制成图1，可完整、清晰地了解个体从孵化（耳石核心）至被捕获（耳石边缘）整个生活史过程中的锶钙元素比情况。具体特征为早期生活史阶段锶钙元素比较低（平均值在3以下）反映了其淡水生活史，而中后期生活史阶段锶钙元素比较高（平均值在3-7）反映了其离开淡水并进入河口半咸水生活的情况。
锶元素的面分布（图2）分析结果尤为直观地反映这个变化过程，耳石核心及周边的区域均表现为低锶浓度的蓝色，而靠外的耳石区域均表现为较高锶浓度的绿色乃至黄绿色。因此利用本发明所获得的耳石标本能够很好的用于电子探针微区分析，进而较客观、清晰、完整地了解标本的生境履历信息。
实施例2
一种刀鲚耳石微化学分析前处理的方法，采用以下工艺步骤：
a、刀鲚标本于2014年6月中旬采自长江安徽无为江段，取其中1尾标本测量基本生物学数据后，摘取左耳石并使用去离子水清洗3分钟以除去粘液和包膜，后再用纯酒精进一步清洗表面有机质2分钟，并在10倍的放大镜下检查是否有残留有机质，随后将耳石移入48孔细胞培养板，并在室温条件下晾干12小时，得到耳石样本14WWCE14；
b、在干净的铝箔纸上取用4毫升的AB胶水（日本小西株式会社）并搅拌1分钟后，在酒精灯上加热15秒使其呈水样后，分别在直径为30毫米、高度在40毫米的耳石固定模具的底板上表面滴加0.08毫升的加热混匀后的AB胶水，迅速将干燥好的耳石的较为弯曲的一面放置于AB胶水上，下压至于模具底部接触，并确认其呈水平放置后静置45分钟等待AB胶水充分凝固；
c、称取环氧树脂30克与三乙烯四氨5克，在同一个一次性纸杯内先后倒入，随后使用木棒作缓速、圆周搅拌5分钟，搅拌过程中注意去除气泡，配制成试剂；
d、以每个模具添加4克试剂的标准将搅拌好的试剂依次加入模具中，然后将其放入压力为0.15巴的真空镶嵌机内进行20分钟的抽气以进一步去处试剂内的气泡，去除完气泡后将模具放入烘箱内以35℃凝固12小时；
e、将已经凝固的树脂从模具中取出，并在500目砂纸上粗磨至耳石将要暴露后，换用1200目砂纸继续精磨至耳石大部分暴露，但耳石核心尚未暴露；
f、在干净的铝箔纸上取用20毫升的AB胶水（由日本小西株式会社提供）并搅拌1分钟后，在酒精灯上加热15秒使其呈水样后，在一块中间写好样本号的载玻片上滴2毫升的混匀后的AB胶水，随后将打磨至耳石暴露的树脂块以耳石暴露的一面向下黏贴在载玻片上，注意压紧并去除气泡，等待45分钟使AB胶水充分凝固；
g、使用切割机切除除耳石部分的树脂后，换用70微米砂轮打磨至耳石即将暴露，用500目砂纸打磨耳石树脂片至耳石刚要暴露，换用1200目砂纸进行精磨至正反金相显微镜下都能看清耳石核心，使用抛光机对耳石切片进行抛光，先用抛光液进行抛光2分钟，随后换用自来水抛光1分钟，抛光后耳石切片使用金相显微镜的反射光进行检查，确定表面无明显划痕后使用切割机切去除耳石及样本标签外多余的玻璃和树脂部分，得到耳石切片；
h、用去离子水清洗切下的耳石切片6遍后，将耳石切片放于干净的烧杯中，并加入适量Milli-Q水超声清洗6分钟，将超声清洗后的耳石切片取出，并再次用Milli-Q水淋洗6遍，将清洗好的耳石切片放置于干净纸巾上并放置于培养皿内，随后放入35~38°C烘箱干燥18小时。
将以上制备好的样品镀碳膜后（25秒，36安培，JEE420，日本电子株式会社）进行电子探针微区分析仪分析（日本电子株式会社,简称EPMA），具体参数设定为：定量线分析使用碳酸钙（CaCO3）和钛酸锶（SrTiO3）作为标准物质，电压参数为15千伏，电子束电流为2.0×10-8安培，束斑直径为5微米，每点驻留时间为15秒，每间隔10微米测量下一点；面分布分析电压参数为15千伏，电子束电流为5.0×10-8安培，束斑直径为5微米，每点驻留时间为30毫秒。
将上述分析所获定量线分析整理并绘制成图3，可完整、清晰地了解3尾个体从孵化（耳石核心）至被捕获（耳石边缘）整个生活史过程中的锶钙元素比情况。具体特征为早期生活史阶段锶钙元素比较低（平均值在3以下）反映了其淡水生活史，而中后期生活史阶段锶钙元素比较高（平均值在3-7）反映了其离开淡水并进入河口半咸水生活的情况。
锶元素的面分布（图4）分析结果尤为直观地反映这个变化过程，耳石核心及周边的区域均表现为低锶浓度的蓝色，而靠外的耳石区域均表现为较高锶浓度的绿色乃至黄绿色。因此利用本发明所获得的耳石标本能够很好的用于电子探针微区分析，进而较客观、清晰、完整地了解标本的生境履历信息。
实施例3
一种刀鲚耳石微化学分析前处理的方法，采用以下工艺步骤：
a、刀鲚标本于2014年6月下旬采自长江安徽无为江段，取其中1尾标本测量基本生物学数据后，摘取左耳石并使用去离子水清洗3分钟以除去粘液和包膜，后再用纯酒精进一步清洗表面有机质2分钟，并在10倍的放大镜下检查是否有残留有机质，随后将耳石移入48孔细胞培养板，并在室温条件下晾干12小时，得到耳石样本14WWCE19；
b、在干净的铝箔纸上取用4毫升的AB胶水（日本小西株式会社）并搅拌1分钟后，在酒精灯上加热15秒使其呈水样后，分别在直径为28毫米、高度在35毫米的耳石固定模具的底板上表面滴加0.08毫升的加热混匀后的AB胶水，迅速将干燥好的耳石的较为弯曲的一面放置于AB胶水上，下压至于模具底部接触，并确认其呈水平放置后静置45分钟等待AB胶水充分凝固；
c、称取环氧树脂33克与三乙烯四氨5克，在同一个一次性纸杯内先后倒入，随后使用木棒作缓速、圆周搅拌5分钟，搅拌过程中注意去除气泡，配制成试剂；
d、以每个模具添加4克试剂的标准将搅拌好的试剂依次加入模具中，然后将其放入压力为0.15巴的真空镶嵌机内进行20分钟的抽气以进一步去处试剂内的气泡，去除完气泡后将模具放入烘箱内以35℃凝固12小时；
e、将已经凝固的树脂从模具中取出，并在500目砂纸上粗磨至耳石将要暴露后，换用1200目砂纸继续精磨至耳石大部分暴露，但耳石核心尚未暴露；
f、在干净的铝箔纸上取用20毫升的AB胶水（日本小西株式会社）并搅拌1分钟后，在酒精灯上加热15秒使其呈水样后，在一块中间写好样本号的载玻片上滴2毫升的混匀后的AB胶水，随后将打磨至耳石暴露的树脂块以耳石暴露的一面向下黏贴在载玻片上，注意压紧并去除气泡，等待45分钟使AB胶水充分凝固；
g、使用切割机切除除耳石部分的树脂后，换用70微米砂轮打磨至耳石即将暴露，用500目砂纸打磨耳石树脂片至耳石刚要暴露，换用1200目砂纸进行精磨至正反金相显微镜下都能看清耳石核心，使用抛光机对耳石切片进行抛光，先用抛光液进行抛光2分钟，随后换用自来水抛光1分钟，抛光后耳石切片使用金相显微镜的反射光进行检查，确定表面无明显划痕后使用切割机切去除耳石及样本标签外多余的玻璃和树脂部分，得到耳石切片；
h、用去离子水清洗切下的耳石切片6遍后，将耳石切片放于干净的烧杯中，并加入适量Milli-Q水超声清洗6分钟，将超声清洗后的耳石切片取出，并再次用Milli-Q水淋洗6遍，将清洗好的耳石切片放置于干净纸巾上并放置于培养皿内，随后放入35~38°C烘箱干燥24小时。
将以上制备好的样品镀碳膜后（25秒，36安培，JEE420，日本电子株式会社）进行电子探针微区分析仪分析（日本电子株式会社,简称EPMA），具体参数设定为：定量线分析使用碳酸钙（CaCO3）和钛酸锶（SrTiO3）作为标准物质，电压参数为15千伏，电子束电流为2.0×10-8安培，束斑直径为5微米，每点驻留时间为15秒，每间隔10微米测量下一点；面分布分析电压参数为15千伏，电子束电流为5.0×10-8安培，束斑直径为5微米，每点驻留时间为30毫秒。
将上述分析所获定量线分析整理并绘制成图5，可完整、清晰地了解3尾个体从孵化（耳石核心）至被捕获（耳石边缘）整个生活史过程中的锶钙元素比情况。具体特征为早期生活史阶段锶钙元素比较低（平均值在3以下）反映了其淡水生活史，而中后期生活史阶段锶钙元素比较高（平均值在3-7）反映了其离开淡水并进入河口半咸水生活的情况。
锶元素的面分布（图6）分析结果尤为直观地反映这个变化过程，耳石核心及周边的区域均表现为低锶浓度的蓝色，而靠外的耳石区域均表现为较高锶浓度的绿色乃至黄绿色。因此利用本发明所获得的耳石标本能够很好的用于电子探针微区分析，进而较客观、清晰、完整地了解标本的生境履历信息。
实施例4
一种刀鲚耳石微化学分析前处理的方法，采用以下工艺步骤：
a、摘取2012年7月在江西鄱阳湖水域采集的刀鲚个体为6尾（标注为PYCE）、2012年8月在江西鄱阳湖水域采集的短颌鲚个体为5尾（标注为PYCB）、2011年4月长江口采集的刀鲚幼鱼个体各5尾（标注为CMCEC）、2011年8月长江口采集的刀鲚幼鱼个体5尾（标注为CMCEX）以及2012年5月黄海南通沿岸采集的刀鲚个体6尾（标注为NTCE）的左耳石，使用去离子水清洗3分钟以除去粘液和包膜，后再用纯酒精进一步清洗表面有机质2分钟，并在10倍的放大镜下检查是否有残留有机质，随后将耳石移入48孔细胞培养板，并在室温条件下晾干12小时；
b、在干净的铝箔纸上取用4毫升的AB胶水（日本小西株式会社）并搅拌1分钟后，在酒精灯上加热15秒使其呈水样后，分别在直径为25毫米、高度在30毫米的耳石固定模具的底板上表面滴加0.08毫升的加热混匀后的AB胶水，迅速将干燥好的耳石的较为弯曲的一面放置于AB胶水上，下压至于模具底部接触，并确认其呈水平放置后静置45分钟等待AB胶水充分凝固；
c、称取环氧树脂35克与凝固剂（三乙烯四氨）5克，在同一个一次性纸杯内先后倒入，随后使用木棒作缓速、圆周搅拌5分钟，搅拌过程中注意去除气泡；
d、以每个模具添加4克试剂的标准将搅拌好的试剂依次加入模具中，然后将其放入压力为0.15巴的真空镶嵌机内进行20分钟的抽气以进一步去处试剂内的气泡，去除完气泡后将模具放入烘箱内以35℃凝固12小时；
e、将已经凝固的树脂从模具中取出，并在500目砂纸上粗磨至耳石将要暴露后，换用1200目砂纸继续精磨至耳石大部分暴露，但耳石核心尚未暴露；
f、在干净的铝箔纸上取用20毫升的AB胶水（日本小西株式会社）并搅拌1分钟后，在酒精灯上加热15秒使其呈水样后，在一块中间写好样本号的载玻片上滴2毫升的混匀后的AB胶水，随后将打磨至耳石暴露的树脂块以耳石暴露的一面向下黏贴在载玻片上，注意压紧并去除气泡，等待45分钟使AB胶水充分凝固；
g、使用切割机切除除耳石部分的树脂后，换用70微米砂轮打磨至耳石即将暴露，用500目砂纸打磨耳石树脂片至耳石刚要暴露，换用1200目砂纸进行精磨至正反金相显微镜下都能看清耳石核心，使用抛光机对耳石切片进行抛光，先用抛光液进行抛光2分钟，随后换用自来水抛光1分钟，抛光后耳石切片使用金相显微镜的反射光进行检查，确定表面无明显划痕后使用切割机切去除耳石及样本标签外多余的玻璃和树脂部分；
h、用去离子水清洗切下的耳石切片6遍后，将耳石切片放于干净的烧杯中，并加入适量Milli-Q水超声清洗6分钟，将超声清洗后的耳石切片取出，并再次用Milli-Q水淋洗6遍，将清洗好的耳石切片放置于干净纸巾上并放置于培养皿内，随后放入35~38°C烘箱干燥20小时。
处理好的样品进行激光烧蚀等离子电感耦合质谱分析，其中激光烧蚀系统（NW213，美国ESI公司）参数设定为高压10千伏、波长213纳米、脉冲频率10赫兹、能量强度每平方厘米4.2毫焦，分析的标准样品选用NIST612（美国国家标准局）。
将上述分析所得的结果进行数据整理，并做主成分分析（图7）。结果显示本次分析中的5组样品中除了2011年8月长江口的样品，其余各组样品距离均较近，除了反映出相关群体间存在个体交流的可能，也说明鄱阳湖、长江乃至黄海沿岸水域刀鲚群体间存在关联性。而2011年8月的长江口样品与其余群体间区分明显，特别是与2011年4月长江口样品有明显的区分，反映了长江内存在有多个刀鲚孵化群体，亦即长江内存在有多个刀鲚孵化场的可能。由此可见，利用本发明所获得的刀鲚耳石样本可以很好地用于激光烧蚀等离子电感耦合质谱分析，所获得的分析结果能够较好的了解刀鲚群体的组成以及关联性等情况。
Claims (8)
1.一种刀鲚耳石微化学分析前的处理方法，其特征是该处理方法包括以下步骤：
a、耳石在经过摘取后，首先使用去离子水清洗以除去粘液和包膜，然后用纯酒精进一步清洗耳石表面以除去有机质，最后将耳石移入细胞培养板并在室温条件下晾干；
b、取耳石固定模具，该耳石固定模具为内径在25~30毫米、高度在30~40mm的且一端具有底板的圆管状物体，使用AB胶水将已经晾干的耳石固定在耳石固定模具的底板上，使得耳石较为弯曲的一面与耳石固定模具的底板上表面接触，备用；
c、将环氧树脂与三乙烯四氨依次加入到器皿中并搅拌均匀配制成试剂，环氧树脂与三乙烯四氨的质量比为6~7:1；
d、将试剂加入到耳石固定模具中，每个耳石固定模具对应加入3.5~4克试剂，然后将模具型腔放入压力为0.15~0.36巴的真空镶嵌机内抽气以去除耳石固定模具中试剂内的气泡，最后将耳石固定模具放入35~38℃的烘箱内烘烤，使得耳石固定模具内的试剂凝固，形成圆柱状树脂；
e、将圆柱状树脂从耳石固定模具内取出，先使用粗砂纸粗磨具有耳石的圆柱状树脂的一端，再用细砂纸精磨耳石，使得耳石大部分暴露，但耳石核心尚未暴露；
f、将AB胶水加热融化呈水样后，取水样AB胶滴在写好样本号的载玻片上，随后将打磨至耳石暴露的圆柱状树脂以耳石暴露的一面向下黏贴在载玻片上，压紧并去除气泡，静置使得AB胶水凝固；
g、使用切割机切除载玻片另一端对应的圆柱状树脂，使用砂纸打磨耳石，使得耳石的核心暴露，使用抛光机并依次采用抛光液和自来水对耳石的核心面进行连续抛光，最后使用切割机切去除耳石及样本标签外多余的玻璃和树脂部分，得到耳石切片；
h、将耳石切片清洗干净后用35~38℃的烘箱烘干。
2.如权利要求1所述的一种刀鲚耳石微化学分析前的处理方法，其特征是：步骤a具体为：耳石在经过摘取后，使用去离子水清洗3~4分钟以除去粘液和包膜，再用纯酒精进一步清洗表面有机质1~2分钟，并在8~10倍的放大镜下检查是否有残留有机质，随后将耳石移入48孔细胞培养板，并在室温条件下晾干10~15小时。
3.如权利要求1所述的一种刀鲚耳石微化学分析前的处理方法，其特征是：步骤b中，在干净的铝箔纸上取用3~4毫升的AB胶水并搅拌1~2分钟后，在酒精灯上加热10~20秒使AB胶水呈水样后，然后取0.05~0.1毫升的AB胶水滴加在耳石固定模具的底板上表面上，将干燥好的耳石的较为弯曲的一面放置于AB胶水上，下压至与底板接触，并确认其呈水平放置后静置45~60分钟等待AB胶水充分凝固。
4.如权利要求1所述的一种刀鲚耳石微化学分析前的处理方法，其特征是：步骤d中，抽气时间控制在15~20分钟。
5.如权利要求1所述的一种刀鲚耳石微化学分析前的处理方法，其特征是：步骤e具体为：将已经凝固的圆柱状树脂从耳石固定模具内取出，先在在500目砂纸上粗磨至耳石将要暴露后，换用1200目砂纸继续精磨至耳石大部分暴露，但耳石核心尚未暴露。
6.如权利要求1所述的一种刀鲚耳石微化学分析前的处理方法，其特征是：步骤f具体为：在干净的铝箔纸上以每个样品取用2~3毫升的AB胶水的标准取用AB胶水并搅拌1~2分钟后，在酒精灯上加热10~20秒使其呈水样后，在一块中间写好样本号的载玻片上滴3~4毫升的混匀后的AB胶水，随后将打磨至耳石暴露的树脂块以耳石暴露的一面向下黏贴在载玻片上，压紧并去除气泡，等待45~60分钟使AB胶水充分凝固。
7.如权利要求1所述的一种刀鲚耳石微化学分析前的处理方法，其特征是：步骤g具体为：使用切割机切除载玻片另一端对应的圆柱状树脂，先用70微米砂轮打磨至耳石即将暴露，再用500目砂纸打磨耳石树脂片至耳石刚要暴露，最后换用1200目砂纸进行精磨至正反金相显微镜下都能看清耳石核心，使用抛光机对耳石切片进行抛光，先用抛光液进行抛光2~3分钟，随后换用自来水抛光1~2分钟，抛光后耳石切片使用金相显微镜的反射光进行检查，确定表面无明显划痕后使用切割机切去除耳石及样本标签外多余的玻璃和树脂部分。
8.如权利要求1所述的一种刀鲚耳石微化学分析前的处理方法，其特征是：步骤h具体为：用去离子水清洗切下的耳石切片6遍后，将耳石切片放于干净的烧杯中，并加入适量Milli-Q水超声清洗3~6分钟，将超声清洗后的耳石切片取出，并再次用Milli-Q水淋洗6遍，将清洗好的耳石切片放置于干净纸巾上并放置于培养皿内，随后放入35~38°C烘箱干燥12~24小时即完成耳石切片制作。
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