CN105684971A - 一种区分人工繁育与自然繁育青海湖裸鲤的方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用耳石元素指纹标记区分人工繁育与自然繁育青海湖裸鲤的方法，包括以下步骤：(1)对照样品采集；(2)耳石分离与处理；(3)耳石元素分析：获得各样品的Li：Ca,Mn:Ca,Mg:Ca,Sr:Ca及Ba：Ca的比值作为分析参数；(4)判别分析：采用SPSS 22.0的分布判别分析将待区分样品的分析参数与对照样品的分析参数进行判别分析，即可判断未知出生地的青海湖裸鲤是人工繁殖的还是自然繁殖的。使用该标记进行判别分析，可成功将人工繁育的青海湖裸鲤与溯河产卵青海湖裸鲤群体区分开来，区分准确率为100％。
Description
技术领域
本发明属于动物保护生物学领域，具体涉及一种区分人工繁育与自然繁育青海湖裸鲤的方法及应用。
背景技术
青海湖是我国最大的内陆咸水湖，是国家级湿地自然保护区。草地、鸟类和青海湖湿地裸鲤是这一自然保护区的三大成分。青海湖裸鲤(GymnocyprisprzewalskiiprzewalskiiQinghaiLakeNakedCraps)、隶属鲤科(Gyprinidae)、裂腹鱼亚科(Schizothoracinae)、裸鲤属(Gymnocypris),是青海湖中唯一的经济鱼类，适于盐水湖泊中生活。它是处于青海湖湿地整个生态系统核心地位，其资源的兴衰将导致整个生态系统的正常运转或衰竭，甚至于崩溃。青海湖裸鲤的原始资源蕴藏量约32万吨。但上世纪60年代，由于疯狂的滥捕致使青海湖裸鲤资源锐减。由于气候的变迁和人为的干扰(河流筑坝、引水灌溉、草场超载放牧和围湖造田等)使得湖水面积缩减、入湖的河流严重减少以及流量下降，致使溯河洄游的亲鱼数量受到限制，产卵场遭受破坏以及仔幼鱼的生活环境极无保障，加上严重的滥捕等因素，到90年代中期青海湖裸鲤的资源量下降到仅为0.75万吨，只相当于60年代的1/10，原始蕴藏量的百分之二。而本世纪初的2002年，青海湖裸鲤的总量已跌至最低谷的2600吨。1979年青海湖裸鲤被国务院在《水产资源繁殖保护条例》中列为我国重要或名贵水生动物，1994年在《中国生物多样性保护行动计划》中，列入鱼类优先保护物种二级名录，2004年被中国环境发展国际合作委员会生物多样性工作组在《中国物种红色名录》中，列为濒危物种。为恢复青海湖裸鲤资源，从上世纪80年代开始，青海省先后对青海湖实施四次封湖育鱼。天然状态下，青海湖裸鲤的生长速度十分缓慢，体重500克的个体需生长10年，相对繁殖力也很低，平均28.75粒/克，一般而言，参加自然繁殖的个体仅100多克，怀卵大约3000多粒。由于气候的变化和人为活动的干扰，很多流入青海湖的河流断流，因此能够溯河到达产卵场进行正常繁殖的数量大大下降。因此，仅靠封湖禁捕青海湖的裸鲤的种群数量是难恢复的。2002年开始裸鲤的人工增殖放流工作，并将孵出的鱼苗放流入通湖的河中。自2002年以来，我省已连续11次开展青海湖裸鲤增殖放流活动，总共向青海湖投放了7600万尾青海湖裸鲤鱼苗。经过多年的不懈努力，目前青海湖裸鲤资源量已经恢复到了3万多吨。但是，经20年的不懈努力，这个数量仅是原始数量的十分之一为有效保护及恢复这一高原珍宝，青海当地政府采取了5次持续10年的封湖禁鱼与人工增值放流活动，最新的资源调查发现，青海湖裸鲤资源量已得到一定的恢复，达到3万吨左右。但是，经20年的不懈努力，这个数量仅是原始数量的十分之一，且究竟何种保护措施对之一资源量的恢复贡献的大小缺乏系统的评价。此外，青海湖裸鲤在青海当地有着极大的市场需求，在日后青海湖裸鲤的天然种群恢复正常后，这条鱼的商业开发势必进行，届时如何有效区别人工养殖裸鲤与自然生长群体就成为执法部门打击偷捕、贩卖野生青海湖裸鲤活动的执法依据。而遗传标记因人工繁殖裸鲤亲本同样来自自然产卵河道不能用于区分人工繁殖群体与自然繁殖群体。传统外部标记，如植入芯片等成本过高且对会对鱼体产生不同程度的损伤，尤其不适于用于大规模的放流群体的标记。
耳石元素指纹分析(elementalfingerprinting)是指利用元素分析方法确立耳石中能有效表征鱼类特定生活阶段所特有的微化学组成,即元素指纹或元素标识,用于重新构建或反演鱼类的生活史及区分不同地理种群，已成为鱼类保护生态学领域的重要技术手段。由于青海湖裸鲤人工繁殖期为提高孵化率及对受精卵与幼苗进行消毒操作，需要对孵化用水进行加热、使用化学消毒剂(如高锰酸钾、聚维酮碘等)，加上在繁殖季节从河道人工捕获亲鱼、采集精子、卵子及将授精卵运至刚察裸鲤孵化中心过程中不可避免对亲鱼与授精卵产生一定应激，这些因素都将对影响微量元素在耳石中的沉积。而沉积与耳石核心的微化学元素差异(元素指纹图谱)将直接反应青海湖裸鲤授精与孵化期的水化学、水温及生理状态的差异，可以作为区分青海湖罗律人工繁育群体与自然群体的自身标记。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用耳石元素指纹标记区分人工繁育与自然繁育青海湖裸鲤的方法。
本发明的另一目的在于提供上述方法的应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种采用耳石元素指纹标记区分人工繁育与自然繁育青海湖裸鲤的方法，包括以下步骤：
(1)样品采集：于青海湖裸鲤春季繁殖季节，从青海湖各大入湖河流中分别采集当年孵化尚未入湖的1龄幼鱼作为自然繁育青海湖裸鲤对照样品，从淡水池塘中采集人工繁育的青海湖裸鲤1龄幼鱼作为人工繁育青海湖裸鲤对照样品；以未知出生地青海湖裸鲤作为待区分样品；
(2)耳石分离与处理：取出各青海湖裸鲤的左、右微耳石一对，用去离子蒸馏水清洗耳石表面的软组织，再依次用超纯硝酸和超纯水分别在超声波条件下清洗，将清洗好的耳石放入模具中，使用环氧树脂包埋，待其凝固硬化后打磨成耳石切片；
(3)耳石元素分析
在激光剥蚀进样系统和电感耦合等离子体质谱仪上进行耳石元素分析，每批置入激光剥蚀灶的样品包括从每个群体中随机取出的多个耳石切片及一个NIST612标样，元素测定按NIST612-耳石样品-NIST612的顺序循环进行；耳石核心区根据耳石内放射状标志带结构特征判断；测定元素包括：7Li；55Mn；24Mg,88Sr,138Ba；40Ca，获得各样品的Li：Ca,Mn:Ca,Mg:Ca,Sr:Ca及Ba：Ca的比值作为分析参数；
(4)判别分析
采用SPSS22.0的分布判别分析将待区分样品的分析参数与对照样品的分析参数进行判别分析，即可判断未知出生地的青海湖裸鲤是人工繁殖的还是自然繁殖的。
步骤(3)中所述耳石元素分析的分析参数为：高压10kV，波长213nm，脉冲频率10HZ，能量强度9.68J/cm2，驻留时间5s，激光束直径80μm。
步骤(1)中所述的青海湖各大入湖河流为布哈河、黑马河、泉吉河及沙柳河。
步骤(1)中所述的淡水池塘为青海湖裸鲤救护中心淡水池塘。
步骤(2)中所述耳石切片的厚度为0.3～0.7mm。
步骤(3)中从每个群体中随机取出的耳石切片的数量为5个。
上述的方法在区分人工繁育与自然繁育青海湖裸鲤中的应用。
本发明的有益效果：
本发明公开了采用耳石元素指纹标记区分人工繁育与自然繁育青海湖裸鲤的方法，使用该标记进行判别分析，可成功将人工繁育的青海湖裸鲤与溯河产卵青海湖裸鲤群体区分开来，区分准确率为100％。
附图说明
图1.青海湖裸鲤微耳石核心确定及年龄计算
图2.利用耳石核心Li：Ca,Mn:Ca,Mg:Ca,Sr:Ca及Ba：Ca区分人工繁育青海湖裸鲤与天然繁育青海湖裸鲤群体
具体实施方式
实施例1
(1)样品采集：于青海湖裸鲤春季繁殖季节从青海湖4大入湖河流(包括布哈河、黑马河、泉吉河及沙柳河)采集当年孵化尚未入湖的1龄幼鱼各5条；青海湖裸鲤救护中心淡水池塘养殖的1龄幼鱼5条；青海湖中捕获的未知出生地裸鲤5条用于本发明的应用分析。
(2)耳石的分离与处理：用碳纤镊子取出裸鲤的左、右微耳石一对，用去离子蒸馏水清洗耳石表面的软组织，然后用Fisher公司的Optima级别超纯硝酸(0.5％)在超声波条件下清洗，再用超纯水在超声波条件下清洗，将清洗好的耳石放入准备好的塑料模具中，使用Struers公司的EPOFIX环氧树脂包埋，室温下放置24h待其凝固硬化，之后打磨成厚度约为0.5mm左右的薄片待用。
(3)耳石元素分析：耳石元素分析在Merchantek激光剥蚀进样系统(UP-213Nd:YAGUV-LA；NewWaveResearch)和Agilent7500sICPMS(AgilentTechnologies)上进行。激光剥蚀定点取样、进样及ICPMS元素分析、数据采集和处理等均通过设备配置的标准操作方法和计算机软件系统分批进行。每批置入激光剥蚀灶的样品包括从每个群体中随机取出的5个耳石切片及一个NIST612标样(NationalInstituteofStandardsandTechnology,USA),元素测试按NIST612-耳石样品-NIST612顺序循环进行。NIST612用于校正ICPMS元素分析过程中的仪器测定误差,每次一点激光剥蚀取样。耳石核心区根据耳石内放射状标志带结构特征判断，放射状标志带的起始区域即为耳石核心区域(如图1所示)。分析参数为：高压10kV，波长213nm，脉冲频率10HZ，能量强度9.68J/cm2，驻留时间5s，激光束直径80μm。测定元素包括：7Li；55Mn；24Mg,88Sr,138Ba；40Ca，获得各样品的Li：Ca,Mn:Ca,Mg:Ca,Sr:Ca及Ba：Ca的比值作为分析参数。
(4)判别分析：采用SPSS22.0的分布判别分析(step-wisediscriminateanalysis,DFA)将待区分样品的分析参数与对照样品的分析参数进行判别分析，即可判断采自青海湖的未知出生地的裸鲤是人工繁殖后进行增值放流的还是自然繁殖后进入湖中生长的。分析结果见图2，青海湖中所捕获的未知出生地裸鲤，1条来自黑马河，1条来自沙柳河，两条来自布哈河，1条为青海湖裸鲤救护中心人工繁育后放归青海湖。
Claims (6)
1.一种采用耳石元素指纹标记区分人工繁育与自然繁育青海湖裸鲤的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)样品采集：于青海湖裸鲤春季繁殖季节，从青海湖各大入湖河流中分别采集当年孵化尚未入湖的1龄幼鱼作为自然繁育青海湖裸鲤对照样品，从淡水池塘中采集人工繁育的青海湖裸鲤1龄幼鱼作为人工繁育青海湖裸鲤对照样品；以未知出生地青海湖裸鲤作为待区分样品；
(2)耳石分离与处理：取出各青海湖裸鲤的左、右微耳石一对，用去离子蒸馏水清洗耳石表面的软组织，再依次用超纯硝酸和超纯水分别在超声波条件下清洗，将清洗好的耳石放入模具中，使用环氧树脂包埋，待其凝固硬化后打磨成耳石切片；
(3)耳石元素分析
在激光剥蚀进样系统和电感耦合等离子体质谱仪上进行耳石元素分析，每批置入激光剥蚀灶的样品包括从每个群体中随机取出的多个耳石切片及一个NIST612标样，元素测定按NIST612-耳石样品-NIST612的顺序循环进行；耳石核心区根据耳石内放射状标志带结构特征判断；测定元素包括：7Li；55Mn；24Mg,88Sr,138Ba；40Ca，获得各样品的Li：Ca,Mn:Ca,Mg:Ca,Sr:Ca及Ba：Ca的比值作为分析参数；
(4)判别分析
采用SPSS22.0的分布判别分析将待区分样品的分析参数与对照样品的分析参数进行判别分析，即可判断未知出生地的青海湖裸鲤是人工繁殖的还是自然繁殖的。
2.根据权利要求1所述的采用耳石元素指纹标记区分人工繁育与自然繁育青海湖裸鲤的方法，其特征在于所述耳石元素分析的分析参数为：高压10kV，波长213nm，脉冲频率10HZ，能量强度9.68J/cm2，驻留时间5s，激光束直径80μm。
3.根据权利要求1所述的采用耳石元素指纹标记区分人工繁育与自然繁育青海湖裸鲤的方法，其特征在于所述的青海湖各大入湖河流为布哈河、黑马河、泉吉河及沙柳河。
4.根据权利要求1所述的采用耳石元素指纹标记区分人工繁育与自然繁育青海湖裸鲤的方法，其特征在于所述的淡水池塘为青海湖裸鲤救护中心淡水池塘。
5.根据权利要求1所述的采用耳石元素指纹标记区分人工繁育与自然繁育青海湖裸鲤的方法，其特征在于所述耳石切片的厚度为0.3～0.7mm。
6.权利要求1所述的方法在区分人工繁育与自然繁育青海湖裸鲤中的应用。
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2016
- 2016-02-24 CN CN201610100168.9A patent/CN105684971A/zh active Pending
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