CN105132514B - 多菌种发酵壳聚糖生产抗病型寡糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多菌种发酵壳聚糖生产抗病型寡糖的制备方法，利用多种菌种发酵产生的酶使壳聚糖降解生成寡糖，发酵过程中黄柏、丁香、茵陈以及白头翁混合制成的中药提取物的加入使得抗病型寡糖对真菌引起的农作物疾病有良好的治疗效果，增强农作物的抗病性，使农产品的产量更高且品质得到提高，制备方法绿色环保，制备过程中超声波的多次使用使得抗病型寡糖的收率高。
Description
技术领域
本发明涉及寡糖的制备，更具体地说，本发明涉及一种多菌种发酵壳聚糖生产抗病型寡糖的制备方法。
背景技术
壳聚糖是甲壳素部分脱乙酰基后的产物，是一种天然碱性多糖，壳聚糖通过降解后生成低分子量的壳寡糖，寡糖在抑制肿瘤细胞的生长和转移，降低血糖和胆固醇、促进蛋白质合成、活化植物细胞等方面具有独特的生理活性，因此被广泛应用于医药、生物农药和饲料添加剂等领域。
目前，将壳聚糖制备成寡糖的方法主要有化学降解法和酶解法，化学降解法操作简单但易产生副产物，难以控制，酶解法不产生副产物但较复杂，为了增强农作物抗病性，提高农作物的经济效益，亟需需找一种操作简便的能增强农作物抗病性的寡糖的制备方法。
发明内容
本发明的一个目的是解决上述问题缺陷，并提供后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种多菌种发酵壳聚糖生产抗病型寡糖的制备方法，制备过程中药提取物的加入使得抗病型寡糖对真菌引起的农作物疾病有良好的治疗效果，增强农作物的抗病性，使农产品的产量更高且品质得到提高，利用多种菌种发酵产生的酶使壳聚糖降解生成寡糖，制备方法绿色环保，结合超声波的多次使用使得产品收率高。
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种多菌种发酵壳聚糖生产抗病型寡糖的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：将质量比为2∶2∶1∶1的黄柏、丁香、茵陈以及白头翁粉碎后混合，在60～70℃下，控制搅拌速度为450～550转/min，超声波频率30～40kHz，加热1～2h后，过滤，收集第一滤液与第一滤渣；
在所述第一滤液中加入体积分数为75％的酒精，先在常温下，控制超声波频率50～60kHz，控制搅拌速度为100～200转/min，搅拌20～30min后，在0～4℃静置4～8h，过滤，收集滤渣，40～50℃下干燥3～6h后粉碎得到中药提取物；
步骤二：按重量份数计，取枯草芽孢杆菌1～5份，巨大芽孢杆菌0.2～2份，酵母菌0.5～3份扩大培养得到多菌种菌液后，将35～45份壳聚糖和所述多菌种菌液加入到发酵槽中得到第一混合物，在发酵槽中调节所述第一混合物的含水量为35～40％，之后在32～35℃下发酵5～8h；
步骤三：按重量份数计，将5～8份中药提取物均分为多份，分次加入到发酵槽中，每次间隔2～3h，在32～35℃下发酵8～12h得到第二混合物；
步骤四：将所述第二混合物过滤，得到滤液为第二滤液，将所述第二滤液在65～75℃下控制搅拌速度为450～550转/min，超声波频率50～60kHz，加热40～60min后，过滤，得到滤液为第三滤液；
步骤五：在所述第三滤液中加入体积分数为75％的酒精，在0～4℃静置4～8h，过滤，得到滤液为第四滤液，浓缩，干燥得到所述抗病型寡糖。
优选的是，按重量份数计，所述步骤二中多菌种菌液中还包括麸皮200～300份和豆粕60～80份。
优选的是，所述步骤二中得到第一混合物后，先用醋酸调节所述第一混合物的pH为4.7～5.2，然后在发酵槽中调节所述第一混合物的含水量为35～40％。
优选的是，所述发酵槽包括：
外槽体，其为长方体，所述外槽体内部为容纳水的空腔，所述外槽体上表面设置有条形通槽；
内槽体，其为敞口长方体，所述内槽体内部有容纳腔，其固定嵌设于所述条形通槽内，所述内槽体内部的侧壁上开设有长方形凹槽；
其中，所述外槽体还包括：
进水口，其设置于所述外槽体上表面的靠近边缘处，所述进水口通过进水管连接到加热水箱；
出水口，其为可开闭结构，其设置于所述外槽体外侧面底部的靠近边缘处，所述出水口通过出水管连接到水泵后连接到所述加热水箱；
所述步骤二中将35～45份壳聚糖和所述多菌种菌液加入到发酵槽中得到第一混合物之前，将所述第一滤渣设置在所述长方形凹槽内，关闭所述出水口，从所述进水口往所述外槽体中注水，控制水浴温度为32～35℃，然后将35～45份壳聚糖和所述多菌种菌液加入到所述内槽体中得到第一混合物。
优选的是，所述内槽体的外侧壁上设置有进气口，所述步骤二与所述步骤三中发酵期间每隔1～3h从所述进气口通入一次氧气。
优选的是，所述步骤五中浓缩以循环水为加热介质，将第四滤液在真空减压浓缩罐中进行浓缩，控制温度为60～65℃，真空度为0.05～0.06MPa，浓缩为密度为1.05g/mL的浓缩液。
优选的是，所述步骤五中干燥为喷雾干燥方式。
本发明至少包括以下有益效果：
1、本发明的抗病型寡糖能广泛应用于小麦、玉米等农作物，发酵过程中中药提取物的加入使得产生的抗病型寡糖对真菌引起的农作物疾病如小麦锈病、玉米黑穗病均有良好的治疗效果，能增强农作物的抗病性，使农产品的产量更高且品质得到提高。
2、本发明的制备方法中，选用黄柏、丁香、茵陈以及白头翁制成中药提取物，中药提取物中含有的药用植物多糖能促进菌种发酵产生酶类，配合步骤二中用醋酸调节第一混合物的pH能更好的促进壳聚糖利用发酵产生的酶降解生成寡糖，且生成的寡糖与中药提取物中含有的各种生物碱、丁香油等具有良好的杀灭真菌作用的药用组分发生复合作用，最终得到对真菌性疾病有防治效果的，能增强农作物的抗病性的抗病型寡糖。制备方法中采用微生物发酵生产酶的方法绿色环保，比传统的酶解法节约了成本，提取过程中超声波的多次使用，提取效率高，得到的抗病型寡糖的收率高。
3、发酵槽的内外双层结构能在发酵时起到更好、更均匀的恒温效果，使酶解反应能稳定高效进行，促进壳聚糖利用发酵产生的酶降解生成寡糖，使得抗病型寡糖收率更高，将第一滤渣设置在内槽体的长方形凹槽内不仅能通过第一滤渣中残留的药性组分起到杀灭发酵槽中的杂菌的作用而且使第一滤渣也得到了利用，更加环保。
4、枯草芽孢杆菌与巨大芽孢杆菌均属于好氧菌，通过进气口补入氧气，能促进细菌的增殖形成优势种群，从而产生更多的发酵产物和酶类。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明所述的发酵槽的结构示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1
步骤一：将质量比为2∶2∶1∶1的黄柏、丁香、茵陈以及白头翁粉碎后混合，在60℃下，控制搅拌速度为450转/min，超声波频率30kHz，加热1h后，过滤，收集第一滤液与第一滤渣。
在所述第一滤液中加入体积分数为75％的酒精，先在常温下，控制超声波频率50kHz，控制搅拌速度为100转/min，搅拌20min后，在0℃静置4h，过滤，收集滤渣，40℃下干燥3h后粉碎得到中药提取物。
步骤二：按重量份数计，取枯草芽孢杆菌1份，巨大芽孢杆菌0.2份，酵母菌0.5份扩大培养，加入麸皮200份和豆粕60份，得到多菌种菌液后，将35份壳聚糖和所述多菌种菌液加入到发酵槽中；
如图1所示，所述发酵槽包括：
外槽体1，其为长方体，所述外槽体1内部为容纳水的空腔，所述外槽体1上表面设置有条形通槽；
内槽体2，其为敞口长方体，所述内槽体2内部有容纳腔，其固定嵌设于所述条形通槽内，所述内槽体2内部的侧壁上开设有长方形凹槽3，所述内槽体2的外侧壁上设置有进气口6；
其中，所述外槽体1还包括：
进水口5，其设置于所述外槽体1上表面的靠近边缘处，所述进水口5通过进水管连接到加热水箱；
出水口4，其为可开闭结构，其设置于所述外槽体1外侧面底部的靠近边缘处，所述出水口4通过出水管连接到水泵后连接到所述加热水箱。
将35份壳聚糖和所述多菌种菌液加入到发酵槽中之前，将所述第一滤渣设置在所述长方形凹槽3内，关闭所述出水口4，从所述进水口5往所述外槽体1中注水，控制水浴温度为32℃，然后将35份壳聚糖和所述多菌种菌液加入到所述内槽体2中得到第一混合物，先用醋酸调节所述第一混合物的pH为4.7，在发酵槽中调节所述第一混合物的含水量为35％，之后在32℃下发酵5h，发酵期间每隔1h从所述进气口6通入一次氧气。
步骤三：按重量份数计，将5份中药提取物均分为多份，分次加入到发酵槽中，每次间隔2h，在32℃下发酵8h得到第二混合物，发酵期间每隔1h从所述进气口6通入一次氧气。
步骤四：将所述第二混合物过滤，得到滤液为第二滤液，将所述第二滤液在65℃下控制搅拌速度为450转/min，超声波频率50kHz，加热40min后，过滤，得到滤液为第三滤液。
步骤五：在所述第三滤液中加入体积分数为75％的酒精，在0℃静置4h，过滤，得到滤液为第四滤液，以循环水为加热介质，将第四滤液在真空减压浓缩罐中进行浓缩，控制温度为60℃，真空度为0.05MPa，浓缩为密度为1.05g/mL的浓缩液，将浓缩液喷雾干燥得到所述抗病型寡糖，所述抗病型寡糖重均分子量为2000，脱乙酰度为86％，收率为88％。
实施例2
步骤一：将质量比为2∶2∶1∶1的黄柏、丁香、茵陈以及白头翁粉碎后混合，在70℃下，控制搅拌速度为550转/min，超声波频率40kHz，加热2h后，过滤，收集第一滤液与第一滤渣。
在所述第一滤液中加入体积分数为75％的酒精，先在常温下，控制超声波频率60kHz，控制搅拌速度为200转/min，搅拌30min后，在4℃静置8h，过滤，收集滤渣，50℃下干燥6h后粉碎得到中药提取物。
步骤二：按重量份数计，取枯草芽孢杆菌5份，巨大芽孢杆菌2份，酵母菌3份扩大培养，加入麸皮300份和豆粕80份，得到多菌种菌液后，将45份壳聚糖和所述多菌种菌液加入到发酵槽中，所述发酵槽包括：
外槽体，其为长方体，所述外槽体内部为容纳水的空腔，所述外槽体上表面设置有条形通槽；
内槽体，其为敞口长方体，所述内槽体内部有容纳腔，其固定嵌设于所述条形通槽内，所述内槽体内部的侧壁上开设有长方形凹槽，所述内槽体的外侧壁上设置有进气口；
其中，所述外槽体还包括：
进水口，其设置于所述外槽体上表面的靠近边缘处，所述进水口通过进水管连接到加热水箱；
出水口，其为可开闭结构，其设置于所述外槽体外侧面底部的靠近边缘处，所述出水口通过出水管连接到水泵后连接到所述加热水箱。
将45份壳聚糖和所述多菌种菌液加入到发酵槽中之前，将所述第一滤渣设置在所述长方形凹槽内，关闭所述出水口，从所述进水口往所述外槽体中注水，控制水浴温度为35℃，然后将45份壳聚糖和所述多菌种菌液加入到所述内槽体中得到第一混合物，先用醋酸调节所述第一混合物的pH为5.2，在发酵槽中调节所述第一混合物的含水量为40％，之后在35℃下发酵8h，发酵期间每隔3h从所述进气口通入一次氧气。
步骤三：按重量份数计，将8份中药提取物均分为多份，分次加入到发酵槽中，每次间隔3h，在35℃下发酵12h得到第二混合物，发酵期间每隔3h从所述进气口通入一次氧气。
步骤四：将所述第二混合物过滤，得到滤液为第二滤液，将所述第二滤液在75℃下控制搅拌速度为550转/min，超声波频率60kHz，加热60min后，过滤，得到滤液为第三滤液。
步骤五：在所述第三滤液中加入体积分数为75％的酒精，在0～4℃静置8h，过滤，得到滤液为第四滤液，以循环水为加热介质，将第四滤液在真空减压浓缩罐中进行浓缩，控制温度为65℃，真空度为0.06MPa，浓缩为密度为1.05g/mL的浓缩液，将浓缩液喷雾干燥得到所述抗病型寡糖，所述抗病型寡糖重均分子量为2500，脱乙酰度为85％，收率为90％。
实施例3
步骤一：将质量比为2∶2∶1∶1的黄柏、丁香、茵陈以及白头翁粉碎后混合，在65℃下，控制搅拌速度为500转/min，超声波频率35kHz，加热1.5h后，过滤，收集第一滤液与第一滤渣。
在所述第一滤液中加入体积分数为75％的酒精，先在常温下，控制超声波频率55kHz，控制搅拌速度为150转/min，搅拌25min后，在2℃静置6h，过滤，收集滤渣，45℃下干燥5h后粉碎得到中药提取物。
步骤二：按重量份数计，取枯草芽孢杆菌2份，巨大芽孢杆菌1份，酵母菌2份扩大培养，加入麸皮250份和豆粕70份，得到多菌种菌液后，将40份壳聚糖和所述多菌种菌液加入到发酵槽中，所述发酵槽包括：
外槽体，其为长方体，所述外槽体内部为容纳水的空腔，所述外槽体上表面设置有条形通槽；
内槽体，其为敞口长方体，所述内槽体内部有容纳腔，其固定嵌设于所述条形通槽内，所述内槽体内部的侧壁上开设有长方形凹槽，所述内槽体的外侧壁上设置有进气口；
其中，所述外槽体还包括：
进水口，其设置于所述外槽体上表面的靠近边缘处，所述进水口通过进水管连接到加热水箱；
出水口，其为可开闭结构，其设置于所述外槽体外侧面底部的靠近边缘处，所述出水口通过出水管连接到水泵后连接到所述加热水箱。
将40份壳聚糖和所述多菌种菌液加入到发酵槽中之前，将所述第一滤渣设置在所述长方形凹槽内，关闭所述出水口，从所述进水口往所述外槽体中注水，控制水浴温度为33℃，然后将40份壳聚糖和所述多菌种菌液加入到所述内槽体中得到第一混合物，先用醋酸调节所述第一混合物的pH为5.0，在发酵槽中调节所述第一混合物的含水量为38％，之后在33℃下发酵6h，发酵期间每隔2h从所述进气口通入一次氧气。
步骤三：按重量份数计，将6份中药提取物均分为多份，分次加入到发酵槽中，每次间隔2.5h，在33℃下发酵10h得到第二混合物，发酵期间每隔2h从所述进气口通入一次氧气。
步骤四：将所述第二混合物过滤，得到滤液为第二滤液，将所述第二滤液在70℃下控制搅拌速度为500转/min，超声波频率55kHz，加热50min后，过滤，得到滤液为第三滤液。
步骤五：在所述第三滤液中加入体积分数为75％的酒精，在2℃静置6h，过滤，得到滤液为第四滤液，以循环水为加热介质，将第四滤液在真空减压浓缩罐中进行浓缩，控制温度为62℃，真空度为0.05MPa，浓缩为密度为1.05g/mL的浓缩液，将浓缩液喷雾干燥即可得到所述抗病型寡糖，所述抗病型寡糖重均分子量为1800，脱乙酰度为89％，收率为92％。
为了说明本发明的效果，发明人选择一个小麦试验田和一个玉米试验田，在两个试验田中各随机选择200株试验苗和200株对照苗作为实验材料，其中试验苗采用本发明的实施例3中的多菌种发酵壳聚糖生产抗病型寡糖配制成质量分数为2％的抗病型寡糖溶液处理，对照苗未采用抗病型寡糖溶液处理，测定相关数据如下：
表1农作物生长情况测定
| 组别 | 抗病型寡糖处理组 | 对照组 |
| 小麦锈病发病率/％ | 0.3 | 4 |
| 玉米黑穗病发病率/％ | 0.2 | 3 |
从表1中可以看出，采用本发明的多菌种发酵壳聚糖生产抗病型寡糖后的农作物与普通农作物比较，本发明的多菌种发酵壳聚糖生产抗病型寡糖对小麦锈病、玉米黑穗病均有良好的抑制效果，能增强农作物的抗病性。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。
Claims (7)
1.一种多菌种发酵壳聚糖生产抗病型寡糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：将质量比为2∶2∶1∶1的黄柏、丁香、茵陈以及白头翁粉碎后混合，在60～70℃下，控制搅拌速度为450～550转/min，超声波频率30～40kHz，加热1～2h后，过滤，收集第一滤液与第一滤渣；
在所述第一滤液中加入体积分数为75％的酒精，先在常温下，控制超声波频率50～60kHz，控制搅拌速度为100～200转/min，搅拌20～30min后，在0～4℃静置4～8h，过滤，收集滤渣，40～50℃下干燥3～6h后粉碎得到中药提取物；
步骤二：按重量份数计，取枯草芽孢杆菌1～5份，巨大芽孢杆菌0.2～2份，酵母菌0.5～3份扩大培养得到多菌种菌液后，将35～45份壳聚糖和所述多菌种菌液加入到发酵槽中得到第一混合物，在发酵槽中调节所述第一混合物的含水量为35～40％，之后在32～35℃下发酵5～8h；
步骤三：按重量份数计，将5～8份中药提取物均分为多份，分次加入到发酵槽中，每次间隔2～3h，在32～35℃下发酵8～12h得到第二混合物；
步骤四：将所述第二混合物过滤，得到滤液为第二滤液，将所述第二滤液在65～75℃下控制搅拌速度为450～550转/min，超声波频率50～60kHz，加热40～60min后，过滤，得到滤液为第三滤液；
步骤五：在所述第三滤液中加入体积分数为75％的酒精，在0～4℃静置4～8h，过滤，得到滤液为第四滤液，浓缩，干燥得到所述抗病型寡糖。
2.如权利要求1所述的多菌种发酵壳聚糖生产抗病型寡糖的制备方法，其特征在于，按重量份数计，所述步骤二中多菌种菌液中还包括麸皮200～300份和豆粕60～80份。
3.如权利要求2所述的多菌种发酵壳聚糖生产抗病型寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤二中得到第一混合物后，先用醋酸调节所述第一混合物的pH为4.7～5.2，然后在发酵槽中调节所述第一混合物的含水量为35～40％。
4.如权利要求3所述的多菌种发酵壳聚糖生产抗病型寡糖的制备方法，其特征在于，所述发酵槽包括：
外槽体，其为长方体，所述外槽体内部为容纳水的空腔，所述外槽体上表面设置有条形通槽；
内槽体，其为敞口长方体，所述内槽体内部有容纳腔，其固定嵌设于所述条形通槽内，所述内槽体内部的侧壁上开设有长方形凹槽；
其中，所述外槽体还包括：
进水口，其设置于所述外槽体上表面的靠近边缘处，所述进水口通过进水管连接到加热水箱；
出水口，其为可开闭结构，其设置于所述外槽体外侧面底部的靠近边缘处，所述出水口通过出水管连接到水泵后连接到所述加热水箱；
所述步骤二中将35～45份壳聚糖和所述多菌种菌液加入到发酵槽中得到第一混合物之前，将所述第一滤渣设置在所述长方形凹槽内，关闭所述出水口，从所述进水口往所述外槽体中注水，控制水浴温度为32～35℃，然后将35～45份壳聚糖和所述多菌种菌液加入到所述内槽体中得到第一混合物。
5.如权利要求4所述的多菌种发酵壳聚糖生产抗病型寡糖的制备方法，其特征在于，所述内槽体的外侧壁上设置有进气口，所述步骤二与所述步骤三中发酵期间每隔1～3h从所述进气口通入一次氧气。
6.如权利要求5所述的多菌种发酵壳聚糖生产抗病型寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤五中浓缩以循环水为加热介质，将第四滤液在真空减压浓缩罐中进行浓缩，控制温度为60～65℃，真空度为0.05～0.06MPa，浓缩为密度为1.05g/mL的浓缩液。
7.如权利要求6所述的多菌种发酵壳聚糖生产抗病型寡糖的制备方法，其特征在于，所述步骤五中干燥为喷雾干燥方式。
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