CN105132356B - 一种聚（癸二酰基甘油二酯）在制备视网膜神经细胞载体中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种聚（癸二酰基甘油二酯）在制备视网膜神经细胞载体中的应用，视网膜祖细胞RPCs在视网膜神经细胞载体上进行增殖、分化和迁移；其中，视网膜神经细胞载体的成分包括聚(癸二酰基甘油二酯)PSeD。本发明的视网膜神经细胞递送载体，具有良好的生物相容性，细胞的炎症表达和细胞凋亡因子低，而且具有优异的促神经分化功能。

Description

一种聚（癸二酰基甘油二酯）在制备视网膜神经细胞载体中的 应用

技术领域

本发明属于细胞载体及其制备方法领域，特别涉及一种聚(癸二酰基甘油二酯)在制备视网膜神经细胞载体中的应用。

背景技术

老年性黄斑变性(AMD)和色素性视网膜炎(RP)是造成视神经元退化变性进而导致视力缺陷的两个主要因素。新发展的治疗手段可将病变的视网膜神经元重建。由此发展出多种治疗方法，比如基因治疗、生长因子治疗和小分子药物疗法。但这些治疗方法只能延缓病变恶化，不能从根本上治疗疾病。近年来，数据显示体外培养视网膜神经细胞元移植到体内替换病变组织的治疗方法得到越来越多的关注。但寻找一种合适的细胞培养基质作为细胞的递送载体成为这一治疗方法突破的关键。聚(癸二酰基甘油二酯)[Poly(sebacoyldiglyceride)， PSeD]是新近研制的功能化可降解聚酯，其在生物医学领域展现出了良好的应用前景。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供聚(癸二酰基甘油二酯)在制备视网膜神经细胞载体中的应用，该发明中的视网膜神经细胞递送载体，具有良好的生物相容性，细胞的炎症表达和细胞凋亡因子低，而且具有优异的促神经分化功能。

本发明的聚(癸二酰基甘油二酯)在制备视网膜神经细胞载体中的应用，视网膜祖细胞 RPCs在视网膜神经细胞载体上进行增殖、分化和迁移；其中，视网膜神经细胞载体的成分包括聚(癸二酰基甘油二酯)PSeD。

所述PSeD的分子式为

所述PSeD的分子式中n＝10-300。

所述PSeD的制备方法包括：将二缩水甘油癸二酸值单体、等摩尔量的癸二酸和催化量的四丁基溴化铵溶解在DMF中，在氮气保护下的干燥的反应管中150℃反应24小时，沉淀纯化，真空干燥，即得。

本发明通过RPCs的分离和培养、PSeD/PLGA对RPCs的增殖和分化作用、免疫细胞化学、蛋白质印迹分析、总RNA分离及质量控制、逆转录和定量聚合酶链反应(qPCR)、细胞毒性分析、创伤愈合和统计分析来表征PSeD对RPCs行为的影响。

有益效果

本发明的视网膜神经细胞递送载体，具有良好的生物相容性，细胞的炎症表达和细胞凋亡因子低，而且具有优异的促神经分化功能，具有很大的应用前景。

附图说明

图1为实施例1中PSeD对RPCs的细胞毒性的表征；A：在增殖条件下，炎症因子(MCP-1) 的表达和细胞在支架上的生长通过qPCR分析；B：RPCs在PSeD和PLGA支架以及对照组上培养细胞的凋亡因子(Caspase-3)表达；C：增殖条件下培养三天，测量RPC细胞粘附因子cadherin 4的表达；D：RPC细胞在PSeD和PLGA支架上培养对于通过乳酸脱氢酶释放试验(LDH assays)与对照组的比较；

图2为实施例1中PSeD对RPCs的分化影响；A为在分化条件下，RPCs在PSeD上的生长情况；B-D为qPCR分析；E-J为蛋白质印迹分析；a中比例尺：100μm；b中比例尺：50μm；

图3为实施例1中利用免疫染色分析对PSeD对RPC分化的影响；其中，生长在PSeD上RPCs 中含视觉神经细胞和神经胶质细胞的标志物包括：β3-管蛋白(A-D),rhodopsin(E-H)， GFAP(I-L)；比例尺为100μm；

图4为实施例1中创口愈合实验的效果数据；其中，A为创口愈合图；B为创口愈合程度数据；C为细胞的迁移速度；比例尺为200μm。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

PSeD的合成。

二缩水甘油癸二酸酯单体、等摩尔量的癸二酸和催化量的四丁基溴化铵(TCI,>99.0％)溶解在DMF中，在氮气保护的干燥的反应管中加热(150℃)反应24小时。然后反应液用乙醚沉淀纯化三次，然后将沉淀物抽真空干燥获得PSeD。

通过RPCs的分离和培养、PSeD/PLGA对RPCs的增殖和分化作用、免疫细胞化学、蛋白质印迹分析、总RNA分离及质量控制、逆转录和定量聚合酶链反应(qPCR)、细胞毒性分析、创伤愈合和统计分析来表征PSeD对RPCs行为的影响。

实施例中的NC表示无材料空白试验组。

(1)RPCs的分离和培养

本发明所用动物均依照视觉与眼科协会动物使用标准，并严格按照Schepens眼科研究所动物饲养使用委员会审批过的程序进行。视网膜神经祖细胞从出生1天的绿色荧光蛋白呈阳性(GFP+)的转基因C57BL/6小鼠身上获得，合并视网膜经过切碎及几个周期0.1％的I型胶原蛋白酶消化进行分离。分离的RPCs用孔径为100微米的尼龙网进行过滤，在转速为800rpm 下离心4min，将细胞在含有DMEM/F12(Invitrogen),1％N2神经供给物(Invitrogen),2mML- 谷氨酰胺(Invitrogen),100U/ml青霉素-链霉素(Invitrogen),and20ng/ml表皮生长因子(EGF, Invitrogen)的培养液中进行培养。将细胞种植在培养皿中并每隔3-4天传代一次。为了对细胞的分化情况进行分析，将增殖培养液用分化培养液替代，将其中表皮生长因子(EGF)除去，并加入10％的胎牛血清(Invitrogen)。用于细胞培养的聚合物样品涂膜于聚苯乙烯组织培养板 (Tissue culture-treated polystyrene,TCPS)上。将浓度为1g/l的PSeD和PLGA(作为对照) 的甲醇溶液分别加入到12孔聚苯乙烯组织培养板(tissue culture-treated polystyrene,TCPS)中 (80μl/孔)。待甲醇挥发后，置于真空中抽吸12小时进一步去除溶剂获得涂膜的组织培养板。将组织培养板置于紫外光下30min进行杀毒，然后用1ml磷酸盐缓冲液清洗三次，再用1ml 培养液润洗，接着种上RPCs，进行培养。

(2)PSeD/PLGA对RPCs的增殖和分化作用

RPCs在PSeD/PLGA的生长情况分别在培养第1，3，5天时用标准落射荧光显微镜(Olympus IX51；Olympus,Tokyo,Japan)进行拍照观察，其增殖情况通过CCK-8试剂盒(cellcounting kit-8,Dojindo,Kumamoto,Japan)进行进一步检测。细胞培养在96孔板，浓度为1×104 个细胞/孔，CCK8溶液在第一天，第二天，第三天直接加入孔板中，在37℃继续培养4h后，用ELISA读板器(ELX800,BioTeK,USA)测量其在450nm处的吸光度，细胞活性用A450值进行表示。为了表征在分化条件下，生长在PSeD上的RPCs细胞形态，在第三天的时候用标准落射荧光显微镜(Olympus IX51；Olympus,Tokyo,Japan)放大10倍和20倍进行拍摄。

(3)免疫细胞化学

RPCs在培养三天后(增殖条件下)或者七天后(分化条件下)，RPC–PSeD,RPC-PLGA和RPC-glass复合物用磷酸缓冲液(PBS)润洗三次然后室温下用多聚甲醛(Invitrogen)固定15 分钟。磷酸缓冲液润洗三次后，细胞固定在固定液(磷酸缓冲液包括10％常规羊血清(Invitrogen)，0.3％Triton X-100(Sigma-Aldrich)和0.1％NaN3(Sigma-Aldrich))中1小时。 4℃下与初级抗体培育过夜，然后细胞与二级抗体继续培育(Alexa Fluor546-goatanti-mouse/rabbit,BD,1:800)，继续水洗。细胞核用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；Invitrogen) 染色。免疫细胞利用荧光显微镜(Olympus BX51,Japan)观察，拍照。免疫活性细胞比例根据划分由DAPI染色的细胞核数目确定。每组随机划取区域分别观测到共500至1000细胞。数据收集使用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics,Bethesda,MD)。

5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)掺杂：在10μM BrdU(Sigma-Aldrich,Poole,UK)存在条件下培养8小时，室温下用4％的多聚甲醛处理样品15分钟然后用封闭缓冲液(PBS含有10％的NGS，0.3％riton X-100,和100μg/ml RNaseA)培育60分钟。细胞随后用PBS润洗，室温下用2M HCl培育30分钟，然后先用PBS再用汉克斯平衡盐溶液(HBSS)室温下润洗。4℃下利用抗BrdU抗体在培育过夜(1:200,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA,USA)，细胞用PBS润洗，和荧光共轭二级抗体(Alexa Fluor488-goat anti-mouse,1:800)室温下培育1小时。细胞核利用DAPI染色。免疫活性细胞利用荧光显微镜(Olympus BX51,Japan)观察，拍照。

(4)蛋白质印迹分析

使用RIPA(Radioimmunoprecipitation assay)裂解液(Thermo FisherScientific)提取蛋白质溶解产物，之后用BCA蛋白浓度测定试剂盒(Pierce,Rockford,IL)测定蛋白质的浓度。利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将蛋白质分离，之后将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,Bedford,MA)上，用5％牛血清白蛋白对膜进行封闭处理，然后加入一级抗体包括鼠Rhodopsin抗体(多克隆抗体)(Millipore,1:300),兔β3-微管蛋白抗体(多克隆抗体)(Abcam,1:1000)，鼠GFAP抗体(单克隆抗体)(Millipore,1:1000), 鼠β-肌动蛋白抗体(Sigma,1:0000)在4℃下过夜培养。最后用TBST清洗三次后，加入HRP 标记二抗(Sigma)培养1h。免疫印迹可通过Odyssey V3.0图像扫描(LI-COR,Lincoln,NE,USA) 观察。蛋白条带信号用Bandscan 5.0软件进行检测，每个样品的值以β-肌动蛋白的值为对照进行标准化。

(5)总RNA分离及质量控制

RPC在不同材料上培养3天(增殖条件)或7天(分化条件)后进行收集。从每个样品中用Trizol(Invitrogen)提取的总RNA按标准方法进行纯化。RNA的浓度在波长260nm(A260) 下进行测定，总RNA的纯度通过A260/A280比进行评定。OD260/280nm比在1.9和2.1之间的样品用于cDNA的合成。

(6)逆转录和定量聚合酶链反应(qPCR)

从RPCs中提取1微克RNA使用PrimeScriptTM RT试剂盒(Perfect Real Time；TaKaRa, Dalian,China)进行逆转录。逆转录后，把1μl cDNA溶于10倍的无核酸酶水(Invitrogen)并以此作为qPCR模板，此模板在总容量为20μl，包括10ul Power SYBR GreenPCR Master Mix 预混液，1ul cDNA,2μl引物，7μl ddH2O中使用7500Real-Time PCRSystem(Applied Biosystems,Foster,CA,USA)进行处理。PCR的反应效率通过已进行cDNA系列稀释(1:1, 1:5,1:25,1:125,1:625,和1:3125)的引物测量。每个测量样品一式三个。使用Pfaffl方法分析mRNA相关表达。相对的基因表达用相对于β-actin表达标准化后的对照组的倍数变化来表示。

(7)细胞毒性分析

PSeD和PLGA材料的细胞毒性用CytoTox 96非放射性细胞毒性测定试剂盒(Promega) 进行细胞裂解时，释放到细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性来表征。细胞毒性(％) 用释放到细胞培养液中的LDH占总LDH活性的百分比来表示。

(8)创伤愈合

RPCs在分化培养液下种植到6孔细胞培养板中直至完全汇合。之后用200μl的吸管头制造一条线状创口。用PBS缓冲液清洗3次以除去悬浮起来的细胞，之后细胞在分化条件下继续培养。在0h到48h分别对伤口的宽度进行拍照。伤口的面积用Image J软件进行量化。

(9)统计分析

本发明的所有数据均为平均值±标准差的格式。除非另有说明，所有实验都重复三次以上。用未配对双尾学生t检验对数据进行分析。利用SPSS统计17.0软件对两组以上的数值用单向方差分析(One-wayANOVA)进行比较。*P≤0.05和*P≤0.01被认为统计学显著差异。

实验结束后对通过各项测试对PSeD的生物性能进行了分析。

(1)PSeD对RPCs的细胞毒性

为了评估PSeD的体外相容性，对培养于其上的RPCs的炎症，细胞凋亡及粘附因子的表达水平以及材料对RPCs的细胞毒性进行了研究。qPCR结果表明在PSeD上培养的RPCs同PLGA或对照组相比，炎症因子白细胞介素6(IL-6)表达水平明显下降，而单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达稍有降低(图1A)。而在PSeD上培养的RPCs中表达的细胞凋亡含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)同PLGA或对照组相比并没有明显的差异(图 1B)。另外，细胞的粘附性对细胞的贴附和增殖十分重要，所得的qPCR数据表明，同对照组相比，在PSeD上培养的RPCs表达的细胞粘附分子钙粘蛋白4(cadherin)上升2倍(图1C)。细胞毒性实验表明PSeD和PLGA对生长在上面的RPCs无明显的细胞毒性(图1D)。总体来说，所得数据表明PSeD对RPC的生长有优良的生物相容性。其中，误差线表示标准偏差，数据统计采用学生t检验，其中*p<0.05,**p<0.01代表统计学显著差异。

(2)PSeD对RPCs的分化影响

在分化条件下，RPCs在PSeD上单层生长，且多数细胞延伸为又细又长的神经突状(图 2A)，这表明PSeD支架上RPCs有向视网膜神经细胞分化的倾向。为了进一步研究PSeD对RPCs分化的影响，对培养的RPCs进行了qPCR和蛋白质印迹分析。qPCR分析的结果表明，同PLGA和空白对照相比，生长在PSeD支架上的RPCs，β3-微管蛋白(β3-tublin，视网膜神经细胞的标志物)(图2B)，视紫红质(rhodopsin，感光细胞的标志物)(图2C)，和神经胶质细胞标志物GFAP的表达水平(图2D)均明显上调，这些结果同蛋白质印迹分析所得结果是一致的(图2E-J)。蛋白质印记结果显示PSeD支架上生长的RPC细胞对照组相比，β3-tublin (视网膜神经细胞的标记),rhodopsin(视网膜感光细胞的标记),和GFAP(视网膜神经胶质标志)的表达水平分别大幅增加约2.1倍,3.2倍和3.4倍。其中，误差线指示标准偏差，数据统计采用学生t检验，其中*p<0.05表示统计学显著差异。a中比例尺：100μm；b中比例尺：50μm。

进一步，利用免疫染色分析对PSeD对RPC分化的影响进行了研究。分化条件下，在不同材料上种植RPC培养7天后，固定细胞并用β3微管蛋白，rhodopsin和GFAP抗体对其进行免疫染色。免疫染色分析结果表明，同对照组相比，生长在PSeD上RPCs中含视觉神经细胞和神经胶质细胞的标志物包括：β3-管蛋白(56.51％vs 37.25％)(图3A-D),rhodopsin(26.87％vs 17.32％)(图3E-H)，GFAP(46.32％vs 39.76％)(图3I-L)的比例都大幅度增加，比例尺：100μm。这些数据表明，PSeD支架能够明显著地促进RPCs向视觉神经细胞包括感光细胞分化，而感光细胞，是在视网膜细胞替代治疗中最令人关注的细胞之一。

(3)PSeD对RPCs迁移的影响

利用创口愈合实验研究了PSeD对RPCs迁移的影响。单层细胞上伤口造成2天之后，当 RPCs培养在PSeD,PLGA上时，伤口愈合程度分别为57.63％，38.45％(图4A-B)。另外，生长于PSeD上的RPCs的迁移速度大于PLGA上的RPCs(图4C)。这些结果表明在PSeD 上的RPCs表现出更好的迁移能力。其中，*p<0.05,**p<0.01，比例尺为200μm。

通过一系列实验验证了PSeD对视网膜神经祖细胞分化的促进作用。体外细胞实验数据显示PSeD具有良好的生物相容性，细胞的炎症表达和细胞凋亡因子低。体外分化实验，对细胞的β3-微管蛋白和视紫红质的表征数据显示视网膜神经祖细胞更易分化为视网膜神经元细胞，从而证明了PSeD具有优异的促神经分化功能。生长在PSeD上的RPCs具有显著地向视网膜神经元分化的趋势，并具有良好的迁移能力，这对视网膜细胞替代治疗十分重要。

Claims (2)

1.一种聚(癸二酰基甘油二酯)在制备视网膜神经细胞载体中的应用，其特征在于，视网膜祖细胞RPCs在视网膜神经细胞载体上进行增殖、分化和迁移；其中，视网膜神经细胞载体的成分包括聚(癸二酰基甘油二酯)PSeD；所述PSeD的分子式为n＝10-300。

2.根据权利要求1所述的一种聚(癸二酰基甘油二酯)在制备视网膜神经细胞载体中的应用，其特征在于，所述PSeD的制备方法包括：将二缩水甘油癸二酸值单体、等摩尔量的癸二酸和催化量的四丁基溴化铵溶解在DMF中，在氮气保护下的干燥的反应管中150℃反应24小时，沉淀纯化，真空干燥，即得。