CN105126173A - bFGF优化的促进硬组织再生的ADM屏障膜及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种bFGF优化的促进硬组织再生的ADM屏障膜及其制备方法与应用，将肝素化ADM膜用bFGF溶液于0-8℃浸泡后-60℃冻干膜材料，得到负载bFGF的肝素化ADM膜。本发明将bFGF负载于GTR屏障膜材料表面不仅可有效发挥其空间保持功能而且可以通过对骨髓间充质干细胞的募集和促增殖作用加速大鼠颅骨缺损的愈合，因此该发明更新了现有的ADM膜材料，促进了骨组织工程的发展。
Description
技术领域
本发明属于生物医学工程技术领域，具体涉及一种bFGF优化的促进硬组织再生的ADM屏障膜及其制备方法与应用。
背景技术
先天畸形、外伤及肿瘤等引起的各种骨缺损严重困扰着广大患者及医疗工作者，牙周炎引起的骨丧失一直是妨碍牙周医学发展的主要瓶颈。近年来，骨组织工程作为一门新兴的交叉学科为骨缺损的修复带来了新的希望。其中，引导组织再生(GTR)屏障膜具有细胞阻隔和维持引导特定组织再生空间的功能而成为GTR不可缺少的一个组成部分，理想的屏障膜材料应该具有良好的生物相容性、生物可吸收性及合适的机械和物理特性，并能够促进细胞间的交流及组织再生。大概可分为可吸收性膜和不可吸收性膜，其中，第一代屏障膜是不可吸收性膜，需要二次手术取出，增加患者痛苦；第二代生物膜是可吸收性膜，以胶原膜和壳聚糖膜为代表，已在临床上广泛应用；目前技术已经发展到第三代生物膜，不仅要求GTR膜作为屏障，而且希望其能作为载体释放药物，如抗炎药，生长因子，粘附因子等促进缺损区域的愈合。已有研究发现碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是一种可促进骨髓基质细胞生长和增殖的重要因子,bFGF及其制剂的相关应用研究一直是组织工程材料、再生医学及创伤治疗领域最活跃的课题之一。但是，bFGF作为一种碱性多肽，对热和酸敏感、易被蛋白酶分解、在体内半衰期短，因此其生物学效应不能得到充分发挥.如何有效地发挥bFGF的生物学效应制约着bFGF的进一步体内应用研究，目前解决这一问题的方法大都采用微球缓释系统，但缓释微球的制备工序繁琐，需要经过交联，乳化，磁力搅拌，洗涤，过滤冻干等多个步骤，平均时长约为125小时，耗时，费力，成本高。
脱细胞真皮基质(acelluardermalmatrix,ADM)是一种被去除细胞结构的天然细胞外基质，具有天然细胞外基质的基本成分和三维结构，胶原网架是其基本结构。目前关于ADM膜的研究主要集中于引导组织再生的屏障膜及软组织再生中，临床应用以烟台正海生物技术有限公司生产的海奥膜为主要商品，效果佳，该种商品化的膜材料分为两面：基质面和真皮面，其中，基质面粗糙，可帮助细胞粘附、生长和增殖，调控细胞分化；真皮为光滑面，有效减少纤维细胞，上皮细胞向缺损区迁移和伸展，为缺损区骨再生提供一定的空间。但基于该屏障膜的研究基本很少涉及骨组织工程，且未发现负载生长因子的ADM膜，这体现了ADM膜材料领域的一大空白，也制约了ADM膜在硬组织再生领域的大范围应用。
1996年，Faham等发现了bFGF的肝素结合位点(FahamS；HilemanRE；FrommJRHeparinstructureandinteractionswithbasicfibroblastgrowthfactor.Science.1996Feb23；271(5252):1116-2.)，且低浓度的外源肝素(0.1-30nmol/L)可以促进bFGF与受体结合。体外试验发现，与肝素结合可以增强bFGF对酸、热及蛋白酶降解的抵抗能力。体内试验证明，在果蝇发育过程中，对于bFGF正常发挥其调控作用来说，硫酸肝素是必不可少的物质(OrnitaDM.FGFs,heparinsulfateandFGFRs:complexinteractionsessentialfordevelopment.Bioessays.2000Feb；22(2):108-12.)。目前虽有学者证明肝素可有效结合bFGF并使其生物活性得以更好的发挥，但未有报道将该项技术应用于改良引导组织再生屏障生物膜。
专利CN103656751A公开了一种bFGF-ADM复合体，应用于创面、肉芽创面和慢性溃疡及褥疮的覆盖，起到防止水分蒸发、蛋白质和热量流失，预防微生物感染，促进创面愈合的作用，该专利运用静电吸附的方法将bFGF负载于ADM表面，吸附能力弱，缓释效果不明显，并且该复合体仅限于软组织修复，未有报道可应用于骨组织工程。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题，提供一种bFGF优化的促进硬组织再生的ADM屏障膜及其制备方法与应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种bFGF优化的ADM屏障膜，步骤为：(1)将ADM膜置于含有肝素的MES生物缓冲液中浸泡后，除去浮于表层的肝素分子获得肝素化ADM膜；
(2)将步骤(1)得到的肝素化ADM膜置于bFGF溶液中浸泡后，冻干膜材料，即得到bFGF优化的ADM屏障膜。
所述ADM膜为单面膜，即基质面和真皮面；或双面膜，即双面均为基质面。
上述bFGF优化的ADM屏障膜的制备方法，包括以下步骤：
(1)肝素化脱细胞真皮基质膜的制备：将ADM膜置于含有肝素的MES生物缓冲液中浸泡后，除去浮于表层的肝素分子，获得肝素化ADM膜；
具体步骤为：将ADM膜置于含有0.5-1.5mmol/L肝素的MES生物缓冲液(0.1mol/L，pH＝5-5.5)中，浸泡3-5小时后置于不含肝素的MES生物缓冲液(0.1mol/L，pH＝5-5.5)中12-18h，以洗去浮于表层的肝素分子，获得肝素化ADM膜。MES生物缓冲液(0.1mol/L，pH＝5-5.5)优点：含有EDC，可以激活肝素分子的羧基或磺胺基与材料表面的氨基或羧基进行反应，实现肝素分子与材料的共价结合。
(2)负载bFGF的肝素化ADM膜制备：将步骤(1)得到的肝素化ADM膜用bFGF溶液于0-8℃(优选4℃)浸泡后冻干(优选-60℃)膜材料，得到负载bFGF的肝素化ADM膜。优点：4℃条件下浸泡过夜有利于bFGF因子与肝素分子的吸附，使因子充分深入膜材料纤维结构的空隙中，另外可保存因子的生物活性；-60℃条件下冻干可有效保存因子的活性。
所述肝素化ADM膜与bFGF溶液的用量关系：1cm2：500μL。
所述bFGF溶液为：200ng/mLbFGF，0.1％BSA,5％蔗糖，0.01％EDTA溶于pH＝7-7.5的PBS缓冲液。
每张1cm2大小的膜含有100ngbFGF。
上述的bFGF优化的ADM膜在制备骨组织工程中所用到的材料中的应用。
本发明的有益效果：
本发明将bFGF负载于GTR屏障膜材料表面不仅可有效发挥其空间保持功能而且可以通过对骨髓间充质干细胞的募集和促增殖作用加速大鼠颅骨缺损的愈合，因此该发明更新了现有的ADM膜材料，促进了骨组织工程的发展。
目前有关将因子负载于膜上的技术中，其他研究者一般采用静电纺丝技术，该技术对肝素或因子溶液的浓度、粘度、液体的流量等要求比较严格，不易操作，且容易产生负载不均匀的现象，并对脱细胞真皮基质本身的结构有破坏；也有研究者采用化学接枝的方法实现肝素与bFGF因子的结合，该方法的结合能力受因子浓度、环境温度等影响较大，效率低，产生大量的因子浪费。本发明中采用的bFGF与肝素/硫酸肝素及ADM膜材料的结合工艺简单，按照一定比例混合后仅需一步真空冻干技术即可达到目的。
本发明采用真空冻干技术和肝素化方法使bFGF物理性与化学性吸附于ADM膜表面，bFGF的吸附能力强，缓释效果好。
本发明选取的ADM膜是商品化的海奥膜无需自己加工，保证其结构、功能的统一。
本发明制备的膜突破了软组织修复的范围，成功应用于骨组织工程，有效促进骨缺损愈合和骨组织再生。
本发明的膜载药前后的ADM膜材料未有明显变化如图1。
肝素化膜材料可有效达到缓释bFGF的目的。体外缓释实验表明未经肝素化的ADM膜负载bFGF突释效应明显，48h内可释放载药量的70％左右，72h可释放载药量的80％左右，后期有少量释放，但变化不大；而利用肝素化的ADM膜可推迟其突释时间，达到有效平稳释放因子，1周内均有明显释药量的增加，10天后趋于稳定，基本无新药释放。
利用肝素化膜材料节约时间，节约成本。负载bFGF的肝素化ADM膜制备仅耗时约48小时，基本不涉及复杂工艺，不涉及技术人员培训等工作，其中使用的原料包括：bFGF生长因子(60RMB/μg)、肝素(44RMB/g)、BSA(3RMB/g)、蔗糖(0.15RMB/g)、EDTA(0.5RMB/g)，价格低廉，降低生产成本。
将肝素化的bFGF首次负载于ADM膜材料表面，应用于骨组织再生，效果显著。
为骨组织工程提供一种新的安全有效、价格易于接受和推广应用的新型膜材料。
提供一种负载因子的膜材料的制备方法，方便，可操作性强，所制备的膜材料性能稳定，有良好的生物安全性。
本发明的方法相较于其他方法制备的屏障膜，bFGF的吸附能力强，缓释效果更好。
EDTA、蔗糖和BSA的使用可模拟细胞、细胞间质及生物活性物质等，实现仿生控释，应用于体内后可有效刺激细胞增殖，分化。
EP管中500μl液体可将膜材料完全浸泡又不至因子浪费。
附图说明
图1本发明膜材料负载因子前后对比照片；
图2本发明膜材料的体外释药曲线；
图3本发明膜材料应用于颅骨缺损区域microct扫描结果及新生骨情况；
图4CD34-/CD90+免疫荧光双染示bFGF对干细胞募集作用图；
图5ALP免疫组化染色示ADM+bFGF组阳性表达图。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
实施例1负载bFGF的肝素化ADM膜的制备方法：
原料：成品ADM膜(烟台正海生物技术有限公司，B型口腔生物膜海奥，请详细写明公司名称，以及所买产品的型号)
1mmol/L肝素/硫酸肝素溶液
200ng/mL的bFGF溶液
(1)MES生物缓冲液配置：以配1L为例，称量9.76gMES、29.22gNaCl、5mL10％的Brij35，溶于1L蒸馏水，用NaOH溶液调整PH至6.0±0.1，备用；PBS缓冲液配置：以配1L为例，称量9gNaCl，6gNa2HPO4·12H2O(或Na2HPO42.38g)，0.4gNaH2PO4·2H2O，溶于1L蒸馏水，用NaOH溶液调整PH至7.4，备用。
也可直接通过试剂商购买上述缓冲液。
(2)肝素化脱细胞真皮基质膜的制备：将成品ADM膜置于含有1mmol/L肝素的0.1mol/L,PH＝5的MES生物缓冲液中，浸泡3小时，后置于MES生物缓冲液中过夜，获得肝素化ADM膜；
(3)负载bFGF的肝素化ADM膜制备。每1cm2ADM膜用500μL的bFGF溶液(200ng/mLbFGF，0.1％BSA,5％蔗糖,0.01％EDTA溶于PBS缓冲液)于4℃条件下浸泡过夜，然后采用-60℃真空冻干机冻干膜材料，得到负载bFGF的肝素化ADM膜，每张1cm2大小的膜含有100ngbFGF。
负载bFGF的肝素化ADM膜体外释药测定
取一片制备完成的ADM膜(含bFGF100ng)，置于1.5mL的eppendorf(EP)管中，盖紧管口，管内加入0.5mLPBS缓冲液作为释放介质，将EP管置恒温箱中，温度为37℃，在4，8,12,24,48,72,120,168,240,336h取样0.3mL，并加入0.3mL新鲜释放介质，收集所有缓释液于-80℃保存，采用酶联免疫吸实验(ELISA)方法(国产Assay人bFGF酶联免疫吸附试验试剂盒)测定缓释液中bFGF的浓度，计算累积释放度。重复三个样本，取平均值。用累积释药百分数对时间绘图得到载药ADM屏障膜的释药曲线，见图2，由图2可知总体缓释药量为总体药量的90％，即其载药率约为90％。体外缓释系统显示24小时内释放药量为34.1％，48小时内释放药量52.3％，72小时内释放药量62.5％，120小时内释药量78.7％，观察至240小时后基本无新药释放。
负载bFGF的肝素化ADM膜应用于大鼠颅骨缺损及其愈合效果测定
动物实验分为三组，分别为空白对照组(control)，单纯膜材料(ADM组)，负载bFGF的膜材料(ADM+bFGF组)。在8w龄的雌性Wistar大鼠的颅骨左侧顶骨上制备8mm×6mm椭圆全厚骨缺损，分别将上述膜材料覆盖于缺损表面，并设置空白对照组。于术后1周，2周，4周，8周处死所有实验动物并取材。
(1)4％多聚甲醛内固定后常规EDTA脱钙，脱水，透明，石蜡包埋，石蜡切片，通过HE染色，Microct扫描分析比较四组骨缺损的愈合情况。
(2)采用CD34-/CD90+免疫荧光双染观察骨缺损愈合过程中材料对间充质干细胞的募集情况。
(3)碱性磷酸酶(ALP)免疫组化染色检测干细胞成骨分化的情况。
(4)所得数据均以均数±标准差表示。应用SPSS17.0统计软件包，对相关参数进行单因素方差分析，α＝0.05。
结果显示，如图3所示(A)三维重建的缺损区域愈合的典型结果，圆圈部分为原本缺损的制备范围，NEWBONE显示新生骨情况；(B)对数据进行单因素方差分析，检验水准为0.05，*P＜0.05，相比于空白对照组；**P＜0.01，相比于空白对照组；▲P＜0.05，相比于ADM+bFGF组。由图中可见，bFGF+ADM组愈合情况明显好于其他两组，说明bFGF优化了ADM屏障膜，增强了其在骨缺损愈合中的作用。
如图4所示，红色荧光标记的为干细胞表面标志CD34，绿色荧光标记为干细胞表面标志CD90，蓝色荧光标记细胞核，我们默认的间充质干细胞为CD34-,CD90+细胞，即表达绿色荧光而不表达红色荧光的细胞，每组选取5张片子，每张选取三个视野进行观察计数，计算间充质干细胞的数量。(A)1w处死动物取材后检测干细胞数量；(B)2w处死动物取材检测干细胞数量；(C)对数据进行单因素方差分析，检验水准为0.05，*P＜0.05，相比于空白对照组；**P＜0.01，相比于空白对照组；▲P＜0.05，相比于ADM+bFGF组。由结果可见，1w和2w时bFGF+ADM组对干细胞的募集作用强于其他，这也解释了后期成骨效果好的原因。
结果如下：
(1)术后实验动物成活率90％，缺损处无明显炎症及免疫排斥反应发生。
(2)组织学HE染色观察发现，ADM组、ADM+bFGF组缺损处修复组织量明显多于空白对照组。
(3)8w组Microct影像学分析结果显示，ADM组骨愈合情况明显好于空白对照组(图3A)，ADM+bFGF组骨缺损基本完全愈合，新生骨体积明显多于其他两组(图3B)。
(4)CD34-/CD90+免疫荧光双染结果显示ADM+bFGF在1w和2w时对干细胞的募集作用很强，明显高于其他两组(P<0.01)(图4)。
(5)碱性磷酸酶(ALP)免疫组化染色显示2w时ADM+bFGF组的平均光密度(IOD)明显高于单纯ADM组和空白对照组(P<0.05)(图5)。
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (10)
1.一种bFGF优化的ADM屏障膜的制备方法，其特征是：
(1)将ADM膜置于含有肝素的MES生物缓冲液中浸泡后，除去浮于表层的肝素分子获得肝素化ADM膜；
(2)将步骤(1)得到的肝素化ADM膜置于bFGF溶液中浸泡后，冻干膜材料，即得到bFGF优化的ADM屏障膜。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述步骤(1)中浸泡温度为0-8℃。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述步骤(1)中肝素的浓度为0.5-1.5mmol/L。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述步骤(1)中MES生物缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH＝5-5.5。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述步骤(2)中冻干温度为-60℃。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述步骤(2)中肝素化ADM膜与bFGF溶液的用量关系为1cm2：500μL。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述步骤(2)中bFGF溶液为：200ng/mLbFGF，0.1％BSA，5％蔗糖，0.01％EDTA溶于pH＝7-7.5的PBS缓冲液制得。
8.如权利要求1-7任一所述的方法制备的ADM屏障膜。
9.如权利要求8所述的ADM屏障膜，其特征是：每张1cm2大小的膜含有100ngbFGF。
10.如权利要求8所述的ADM屏障膜在制备骨组织工程中所用到的材料中的应用。
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