CN105125573B - 宝乐果多糖在制备增强人体、动物体免疫力的药物、保健品或食品上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于增强免疫力的药物，包括增强免疫力有效量的宝乐果多糖和药学上可接受的载体，上述的药物可以是片剂、丸剂、胶囊、注射剂、悬浮剂或乳剂。本发明还公开了宝乐果多糖是一种用途，具体是在增强人体、动物体，免疫力上的应用，包括在制备增强免疫力药物、保健品、食品上的应用。
Description
技术领域
本发明涉及宝乐果多糖的用途，具体来说，是涉及宝乐果多糖在增强人体、动物体免疫力上的应用。
背景技术
宝乐果(Boroja)，亦称博罗霍，属于茜草科林果属的热带水果，包括有BorojoapatinoiCuatrec和BorojoasorbilisCuatrec的成熟果实，产于拉丁美洲厄瓜多尔气候的热带雨林。宝乐果营养丰富，含多糖、植物油、矿物质、维生素、稀土元素，蛋白质、氨基酸等成分。据目前的研究报导，宝乐果可以缓解人的贫血症状、具有抗炎及抗氧化功效。但是，宝乐果多糖用于增强免疫力的功效尚未有文献报道。
免疫力是人体自身的一种主动防御机制，对维持生理和生命活动具有十分重要的意义。机体免疫系统由胸腺、骨髓、脾脏、淋巴结等结构和器官组成，通过产生的淋巴细胞、吞噬细胞、干扰素等物质，精确的识别体外的病毒和体内衰老、癌变的细胞，并可以主动将其抑制、清除。
疾病，过度疲劳，身体老化，膳食平衡失调，情绪低落、焦虑或悲观等都可以导致免疫力低下。免疫力不足会给自身带来不利影响，主要表现为食欲不振、营养不良、精神恍惚、体质虚弱、浑身乏力、睡眠失常等。免疫力低下是亚健康人群的重要表现之一。约60％的知识分子，白领以及管理干部属于亚健康人群。
发明内容
本发明的目的在于提供宝乐果多糖在增强人体、动物体免疫力上的应用，以解决上述技术问题中的至少一个方面。
根据本发明的一个方面，本发明还提供了一种用于增强免疫力的药物，包括增强免疫力有效量的宝乐果多糖和药学上可接受的载体，上述的药物可以是片剂、丸剂、胶囊、注射剂、悬浮剂或乳剂。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了宝乐果多糖是一种用途，具体是在增强人体、动物体，免疫力上的应用，包括在制备增强免疫力药物、保健品、食品上的应用。
本发明所述的宝乐果多糖可以通过下述步骤制备得到：
(1)取宝乐果的水提物，以质量浓度为85～95％的乙醇-水溶液浸泡 6～24小时以除去脂溶性成分和部分色素，过滤，滤渣自然晾干；
其中，上述的宝乐果水提物是指通过下述方法提取得到的物质：以水作为溶剂，在电热套加热下对宝乐果进行回流提取，提取压力为1500MPa (或超高压提取)、温度为30℃、料液比为1:10g/mL、提取次数为：1次，将提取液冷冻干燥，即可得到。宝乐果的水提物的主要成分为宝乐果总多糖。
(2)将滤渣溶解于水中，滤渣与水的质量体积比为1:8～1:50，搅拌均匀后于80～100℃恒温水浴中回流提取30min～120min，过滤得上清液和沉淀；
(3)向步骤(2)中所得的上清液中加入质量浓度为85％～100％的乙醇-水溶液，将上清液中的乙醇的体积浓度调至60％～80％，静置6～24小时，过滤收集沉淀，得到宝乐果精制多糖；
(4)宝乐果精制多糖用Sevage法除蛋白质及色素5～7次，然后用分子量为5～30kd的透析袋透析12～36小时，除掉杂质和其中的单糖和寡糖等小分子，干燥即为宝乐果多糖。
本发明中，使用乙醇作为溶剂进行提取，在其他的实施方式中，也可以使用其他与乙醇性能近似的溶剂来提取。
在一些具体的实施方式，上述制备方法步骤(2)可以为：
(a)将滤渣溶解与水中，滤渣与水的质量体积比为1:8～1:50，搅拌均匀后于80～100℃恒温水浴中回流提取30min～120min，过滤得上清液和沉淀；
(b)沉淀按步骤(a)的方法重复提取1～2次，合并步骤(a)和(b) 所得的上清液。
附图说明
图1为本发明提取的宝乐果多糖的紫外吸收图谱。
图2为本发明提取的宝乐果多糖的红外吸收图谱。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细的说明。
(1)取宝乐果的水提物以乙醇溶液浸泡以除去脂溶性成分和部分色素，过滤，滤渣自然晾干。乙醇浓度和浸泡时间如表1所示。
上述的宝乐果水提物是指通过下述方法提取得到的物质：以水作为溶剂，在电热套加热下对宝乐果进行回流提取，提取压力为1500MPa(或超高压提取)、温度为30℃、料液比为1:10g/mL、提取次数为：1次，将提取液冷冻干燥，即可得到。宝乐果的水提物的主要成分为宝乐果总多糖。
(2)将滤渣溶解与蒸馏水中，搅拌均匀后于恒温水浴中回流提取，过滤得上清液和沉淀。沉淀按上述方法重复提取1～2次，合并所得的上清液。滤渣与水的质量体积比、水浴温度、提取时间如表1所示。
(3)向步骤(2)中所得的上清液中加入乙醇，将上清液中的乙醇体积浓度调至表1所示浓度，静置后过滤收集沉淀，得到宝乐果精制多糖。乙醇浓度和静置时间如表1所示。
(4)宝乐果精制多糖用Sevage法除蛋白质及色素，然后用透析袋透析，除掉杂质和其中的单糖和寡糖等小分子，干燥即为宝乐果多糖。除蛋白质及色素次数、透析袋分子量和透析时间如表1所示。
| 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | |
| 步骤(1)乙醇的质量浓度(％) | 80 | 85 | 90 | 95 |
| 浸泡时间(h) | 6 | 12 | 24 | 36 |
| 滤渣与水的质量体积比 | 1:8 | 1:50 | 1:15 | 1:20 |
| 步骤(2)水浴温度(℃) | 80 | 90 | 95 | 100 |
| 提取时间(h) | 0.5 | 1.5 | 2 | 1 |
| 步骤(3)加入的乙醇的质量浓度(％) | 85 | 90 | 100 | 95 |
| 调整后上清液中乙醇的体积浓度(％) | 60 | 70 | 75 | 80 |
| 静置时间(h) | 12 | 24 | 36 | 14 |
| 除蛋白质及色素次数 | 6 | 5 | 7 | 6 |
| 透析袋分子量 | 5kd | 20kd | 30kd | 10kd |
| 透析时间(h) | 12 | 18 | 36 | 24 |
表1
以葡萄糖单糖作为标准，用苯酚-硫酸法测其吸光度，测得实施例1～4 的多糖得率的平均值为0.052587％。
经过肉眼观察和检测，总结宝乐果多糖的特性如下：
(1)白色粉末状固体。
(2)pH约为6.87。
(3)图1为本发明提取的宝乐果多糖的紫外吸收图谱。紫外扫描图谱在260,280nm处无紫外吸收，说明不含有核算和蛋白质等杂质。
(4)图2为本发明提取的宝乐果多糖的红外吸收图谱。红外图谱显示在3337.87cm-1范围内出现-OH的伸缩振动峰，在2835.65cm-1出现C-H的变角振动，在1033.32cm-1出现吡喃葡萄糖的吸收峰。
(5)苯酚硫酸法测得总糖含量为96.87％。
(6)菲林试剂和硫酸-苯酚反应为阳性，说明为还原性葡萄糖。
(7)茚三酮反应，双缩脲反应和碘-碘化钾反应均为阴性，提示多糖中无蛋白质和淀粉。
(8)使用不同浓度乙醇沉淀的多糖，其比旋光度不同，说明为非均一性多糖。
对实施例1～4所得的宝乐多糖，根据《保健食品检验与评价技术规范》 (2003年版)第4页、第22～34页进行增强免疫力试验，试验的方案如下：
近交系雄性BALB/c小鼠，体重18～22g，按体重平均分为6组，每组 9只。实验设三个模型给药组：低剂量组100mg/kg，中剂量组200mg/kg，高剂量组400mg/kg，一个空白组(生理盐水组)，一个模型组(生理盐水组)和空白给药组(200mg/kg)，试验总时间为30天。模型组和三个模型给药组于给药期间的第1、2、3、13和23天腹腔注射80mg/kg的环磷酰胺生理盐水溶液。每天称一次体重。
通过ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)检测细胞免疫功能，Jerne改良玻片法检测体液免疫功能，血凝法检测体液免疫功能，小鼠碳廓清实验检测单核-巨噬细胞功能，将结果记录到表2～6中。
根据《保健食品检验与评价技术规范》(2003版)相关要求，本次实验中，体液免疫功能、细胞免疫功能和单核-巨噬细胞功能结果为阳性，可判定，宝乐果多糖有增强免疫力作用。
*,p<0.05vs空白组
表2：脾脏指数和胸腺指数
表2中，脾脏指数和胸腺指数通过以下方法得到的，称量小鼠体重(g)，摘取小鼠的胸腺和脾脏，用滤纸吸干残血后，称重(mg)，计算胸腺指数和脾脏指数。胸腺指数＝(胸腺重量/小鼠体重)×10，脾脏指数＝(脾脏重量/ 小鼠体重)×10。
表2中，标记为*的数据(模型组)与空白组的进行对比，p<0.05；而给药模型组(低剂量组、中剂量组、高剂量组)与模型组小鼠进行对比， p>0.05。由此可见，给药模型组与模型组小鼠的脾脏指数和胸腺指数无显著差异。
Note:a.P<0.05vs空白组；aa.P<0.01vs空白组；b.P<0.05vs模型组；bb.P<0.01vs模型组.
表3：细胞免疫功能测定(ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验)
表3记载了通过ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)检测细胞免疫功能的结果，采用了非参数kruskal-Wallis检验，两两比较采用秩和检验的方法。表3中，标记为*的数据(空白给药组)与模型组的进行对比，p<0.05；标记为#的数据(低剂量给药组、中剂量给药组)与模型组的进行对比，p<0.01。由此可见，ConA诱导小鼠脾淋巴细胞转化实验中，低剂量(100mg/kg，0.119±0.0733)和中剂量给药组(200mg/kg，0.132±0.0371) 两个剂量组为阳性，故判定样品对细胞免疫功能有增强作用。
Note:a.P<0.05vs空白组；aa.P<0.01vs空白组；b.P<0.05vs模型组；bb.P<0.01vs模型组.
表4：体液免疫功能测定(抗体生成细胞检测)
Note:a.P<0.05vs空白组；aa.P<0.01vs空白组；b.P<0.05vs模型组；bb.P<0.01vs模型组
表5：体液免疫功能测定(血清溶血素测定)
表4中记载了Jerne改良玻片法检测体液免疫功能。表4中，标记为a 的数据(模型组、空白给药组)与空白的组进行对比，p≤0.01；标记为b 的数据(中剂量给药组、高剂量给药组)与模型组的进行对比，p<0.01。
表5记载了血凝法检测体液免疫功能的结果，采用非参数kruskal-Wallis 检验，两两比较采用秩和检验的方法。其中标记为a的数据(空白给药组) 与空白组的进行对比，p≤0.01；标记为b的数据(低剂量给药组)与模型组的进行对比，p<0.05；标记为c的数据(中剂量给药组、高剂量给药组)与模型组的进行对比，p<0.01。
由表4可见，抗体生成细胞检测实验中，中剂量(200mg/kg，11.53±0.61) 和高剂量组(400mg/kg，11.80±0.92)为阳性，由表5可见，血清溶血素测定中，低剂量(100mg/kg，103.1125±0.3732)、中剂量(200mg/kg， 103.6864±0.8161)和高剂量(400mg/kg，104.4074±0.5858)三个剂量组为阳性，故判定样品对体液免疫功能有增强作用。
Note:a.P<0.05vs空白组；aa.P<0.01vs空白组；b.P<0.05vs模型组；bb.P<0.01vs模型组.
表6：单核-巨噬细胞功能测定 (小鼠碳廓清实验/小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验)
表6记载了小鼠碳廓清实验检测单核-巨噬细胞功能的结果。其中，标记为*的数据(模型组的碳廓清-吞噬指数)与空白组的进行对比，p≤0.01；标记为#的数据(低剂量给药组、中剂量给药组的碳廓清-吞噬指数)与模型组的进行对比，p<0.01；标记为$的数据(模型组、空白给药组的吞噬百分率)与空白组的进行对比，p<0.01；标记为￥的数据(低剂量给药组、中剂量给药组、高剂量给药组的吞噬百分率)与模型组的进行对比，p<0.01；标记为@的数据(模型组、空白给药组的鸡红细胞-吞噬指数)与空白组的进行对比，p<0.01；标记为&的数据(中剂量给药组、高剂量给药组的鸡红细胞-吞噬指数)与模型组的进行对比，p<0.01。
由表6可见，碳廓清实验中，低剂量组(100mg/kg，1.25±0.12)和中剂量组(200mg/kg，1.61±0.12)为阳性；腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验 (吞噬百分率％)中，低剂量组(100mg/kg，23.33±2.52)、中剂量(200mg/kg， 24.67±2.87)和高剂量组(400mg/kg，24.33±2.72)为阳性；腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(吞噬指数)中，中剂量(200mg/kg，0.57±0.08)和高剂量组(400mg/kg，0.59±0.05)为阳性，故判定样品对单核-巨噬细胞功能有增强作用。
由表2～6中可见，宝乐果多糖能显著提高ConA诱导小鼠脾淋巴细胞的OD值，增强机体特异性细胞免疫的功能；能显著提高免疫低下小鼠血清溶血素的OD值，提高特异性体液免疫功能；可明显提高免疫低下小鼠单核-巨噬细胞吞噬功能。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种用于增强免疫力的宝乐果多糖，其特征在于，由下述方法制得：
（1）取宝乐果水提物，以质量浓度为85%~95%的乙醇-水溶液浸泡6～24小时以除去脂溶性成分和部分色素，过滤，滤渣自然晾干；
（2）将滤渣溶解于水中，滤渣与水的质量体积比为1:8~1:50，搅拌均匀后在80~100℃恒温水浴中回流提取30 min~120min，过滤得上清液和沉淀；
（3）向步骤(2)中所得上清液中加入质量浓度为85％～100％的乙醇-水溶液，将上清液中乙醇的体积浓度调至60％～80％，静置6~24小时，过滤收集沉淀，得到宝乐果精制多糖；
（4）宝乐果精制多糖用Sevage法除蛋白质及色素5~7次，然后用分子量为5~30kd的透析袋透析12~36小时，除掉杂质、单糖和寡糖，干燥即得宝乐果多糖。
2.根据权利要求1所述的一种用于增强免疫力的宝乐果多糖，其特征在于，步骤（1）所述的宝乐果水提物通过下述方法制得：
以水为溶剂，在电热套加热下对宝乐果进行回流提取，提取压力为1500MPa、温度为30℃，料液比为1:10g/mL，提取次数为1次，将提取液冷冻干燥，即得宝乐果水提物。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于增强免疫力的宝乐果多糖，其特征在于，所述的步骤(2)为：(a)将滤渣溶解与水中，滤渣与水的质量体积比为1:8～1:50，搅拌均匀后于80～100℃恒温水浴中回流提取30min～120min，过滤得上清液和沉淀；(b)沉淀按步骤(a)的方法重复提取1～2次，合并步骤(a)和(b)所得的上清液。
4.根据权利要求1所述的一种用于增强免疫力的宝乐果多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取宝乐果水提物，以质量浓度为85%~95%的乙醇-水溶液浸泡6～24小时以除去脂溶性成分和部分色素，过滤，滤渣自然晾干；
（2）将滤渣溶解于水中，滤渣与水的质量体积比为1:8~1:50，搅拌均匀在80~100℃恒温水浴中回流提取30 min~120min，过滤得上清液和沉淀；
（3）向步骤(2)中所得上清液中加入质量浓度为85％～100％的乙醇-水溶液，将上清液中乙醇的体积浓度调至60％～80％，静置6~24小时，过滤收集沉淀，得到宝乐果精制多糖；
（4）宝乐果精制多糖用Sevage法除蛋白质及色素5~7次，然后用分子量为5~30kd的透析袋透析12~36小时，除掉杂质、单糖和寡糖，干燥即得宝乐果多糖。
5.根据权利要求4所述的一种用于增强免疫力的宝乐果多糖的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的宝乐果水提物通过下述方法制得：
以水为溶剂，在电热套加热下对宝乐果进行回流提取，提取压力为1500MPa、温度为30℃，料液比为1:10g/mL，提取次数为1次，将提取液冷冻干燥，即得宝乐果水提物。
6.根据权利要求4或5所述的一种用于增强免疫力的宝乐果多糖的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)为：(a)将滤渣溶解与水中，滤渣与水的质量体积比为1:8～1:50，搅拌均匀后于80～100℃恒温水浴中回流提取30min～120min，过滤得上清液和沉淀；(b)沉淀按步骤(a)的方法重复提取1～2次，合并步骤(a)和(b)所得的上清液。
7.权利要求3所述的宝乐果多糖作为唯一活性成分在制备增强免疫力的药物、保健品或食品中的应用，其特征在于，所述的应用为将所述宝乐果多糖制备成增强免疫力的药物、保健品或食品。
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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