CN105106938A - 血小板生成素在促进造血干细胞归巢中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了血小板生成素在促进造血干细胞归巢中的用途。其中，血小板生成素能够有效促进骨髓移植术后造血干细胞归巢，进而血小板生成素能够有效用于制备促进造血干细胞归巢的药物，该药物能够增加归巢的造血干细胞的数量，提高造血干细胞归巢效率，进而能够促进造血干细胞的植入，提高骨髓造血干细胞的移植成功率。

Description

血小板生成素在促进造血干细胞归巢中的用途

技术领域

本发明涉及生物制药领域，具体地，涉及血小板生成素在促进造血干细胞归巢中的用途。

背景技术

造血干细胞(Hematopoieticstemcells，HSC)移植已经成为临床上治疗多种恶性血液病、免疫缺陷性疾病等的重要手段之一。造血干细胞移植后，经血液循环归巢于受体造血微环境，进行增殖、分化，重建受者的造血和免疫系统，从而达到治疗的目的。造血干细胞在受者体内长期植入，受到多种因素的影响，其中造血干细胞归巢于骨髓的效率是一个重要的影响因素。在移植细胞后的24小时内，通过有效的促归巢药物的作用来达到增加归巢的造血干细胞数量的目的，对于改善造血干细胞的植入效率具有重要意义。

然而，目前临床上尚没有应用于造血干细胞移植术后促进造血干细胞归巢的药物，用于该领域的药物有待进一步研究。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出血小板生成素用于制备造血干细胞移植术中促进造血干细胞归巢药物中的用途。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

重组人促血小板生成素(rhTPO)在临床上用于化疗后所致的血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜和造血干细胞移植后血小板重建。血小板生成素作用靶点是细胞表面的c-MPL受体。造血干细胞及巨核细胞表面表达c-MPL。血小板生成素与受体结合，激活了下游信号通路，调节了造血干细胞及巨核细胞的扩增及分化等生物学行为。

基于人重组血小板生成素可以安全、有效地应用于异基因造血干细胞移植术后血小板减少症的临床治疗，发明人进一步研究发现血小板生成素对造血干细胞的归巢有重要作用，能明显增加造血干细胞归巢至骨髓的数量，进而促进造血干细胞的植入，提高造血干细胞的移植成功率。发明人的研究结果表明：血小板生成素促进造血干细胞归巢的机理与其扰乱趋化轴SDF-1α-CXCR4有关。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了血小板生成素或血小板生成素受体激动剂在制备药物中的用途，所述药物促进造血干细胞归巢。

发明人惊奇的发现，应用血小板生成素制备的药物，可以在造血干细胞移植术中促进造血干细胞的归巢，增加归巢的造血干细胞的数量，提高造血干细胞归巢效率，进而改善骨髓造血干细胞的移植成功率。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于促进造血干细胞归巢的药物。根据本发明实施例，该药物包含血小板生成素。

发明人惊奇的发现，该药物可以在造血干细胞移植术中促进造血干细胞的归巢，增加归巢的造血干细胞的数量，提高造血干细胞归巢效率，进而提高骨髓造血干细胞的移植成功率。

根据本发明实施例，所述药物为选自注射剂、颗粒剂、片剂和胶囊剂的至少一种，优选注射剂。

根据本发明实施例，所述药物采用生理盐水或者PBS进行稀释。

根据本发明实施例，所述药物在骨髓移植后24小时内，优选4小时内进行给药。由此，药物促进造血干细胞归巢的效果好，进而促进造血干细胞的早期植入。

根据本发明实施例，所述药物的给药途径为选自皮下注射、肌肉注射和静脉注射的至少一种。根据本发明的一些具体示例，优选皮下注射。由此，药物的吸收效果好。

根据本发明实施例，所述药物的给药剂量为10-100μg/kg。由此，药物的疗效好。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例，利用流式细胞术检测供者细胞在受者体内归巢的比例示意图；

图2显示了根据本发明一个实施例，利用流式细胞术检测供者小鼠造血干细胞(CD45.1/LSK)在受者体内归巢比例的示意图；

图3显示了根据本发明一个实施例，利用集落培养的方法检测供者小鼠造血细胞在受者体内的归巢数量的示意图；

图4显示了根据本发明一个实施例，血小板生成素对骨髓细胞移植后小鼠存活率影响的实验结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

根据本发明的一个方面，本发明提供了血小板生成素在制备药物中的用途，所述药物促进造血干细胞归巢。

发明人惊奇的发现，应用血小板生成素制备的药物，可以在造血干细胞移植术中促进造血干细胞的归巢，增加归巢的造血干细胞的数量，提高归巢效率，进而改善骨髓造血干细胞的移植成功率。

需要说明的是，本发明所述的血小板生成素(TPO)，泛指一切具备血小板生成素功能的化合物，即包括TPO，以及TPO类似物，例如TPO模拟肽(TPOmimeticpeptide，TMP)、TPO非模拟肽(TPOnonpeptidemimics)等。

根据本发明的另一方面，本发明提供了一种促进造血干细胞归巢的药物。根据本发明实施例，该药物包含血小板生成素。

发明人惊奇的发现，该药物可以在造血干细胞移植术中促进造血干细胞的归巢，增加归巢的造血干细胞的数量，提高归巢效率，进而促进造血干细胞的早期植入。

根据本发明实施例，所述药物的剂型不受特别的限制，可以制成选自注射剂、颗粒剂、片剂和胶囊剂的至少一种。根据本发明具体示例，所述药物为注射剂。

根据本发明实施例，所述药物采用生理盐水或者PBS(即磷酸盐缓冲液，pH＝7.4)进行稀释。

根据本发明实施例，所述药物在骨髓移植后24小时内，优选4小时内进行给药。由此，药物促进造血干细胞归巢的效果好，提高药物疗效。

根据本发明实施例，所述药物的给药途径不受特别限制，例如可以通过静脉注射给药、肌肉注射给药或皮下注射给药。根据本发明具体示例，所述药物的给药途径优选为皮下注射。由此，药物的吸收效果好。

根据本发明实施例，所述药物的给药剂量不受特别限制，可以根据用药需求及治疗个体差异，依据临床经验进行适当调整。根据本发明具体示例，对于6-8周龄，20g体重，雄性C57BL/45.1品系小鼠，在进行Co⁶⁰射线照射，剂量9.5Gy，照射20-22小时，所述药物的给药剂量为10-100μg/kg。由此，药物的疗效好。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

按照以下步骤，检测血小板生成素对骨髓细胞移植后造血干细胞归巢的影响：

1、分离小鼠骨髓细胞

C57BL/45.2品系小鼠(该品系小鼠造血干细胞表达CD45.2标志，可通过流式检测鉴别)购自北京维通利华公司，6-8周龄，18-22g体重，雄性，该批小鼠作为骨髓细胞移植供者。小鼠稳定状态一周以上，脊椎脱臼处死，取出股骨和胫骨，并用PBS反复冲洗骨髓腔，获得的细胞悬液以2000rpm离心5分钟，然后加入红细胞裂解液(购自美国BD公司，货号555899，使用时去离子水将原液1∶10稀释后使用)，2分钟后加入5-10倍体积的PBS，2000rpm离心5分钟并洗2次，获得小鼠骨髓细胞悬液，备用。

2、血小板生成素(thrombopoietin，TPO)促进小鼠造血细胞归巢的实验

C57BL/45.1品系小鼠(该品系小鼠造血干细胞表达CD45.1标志，可通过流式检测鉴别，其造血干细胞可异体移植于上述C57BL/CD45.2小鼠，并通过流式细胞术对供者和受者的细胞进行区分；上述两种小鼠造血干细胞的相互移植是一种经典的移植检测模型)购自天津血研所，6-8周龄，18-22g体重，雄性。小鼠稳定状态一周后，进行⁶⁰Coγ射线照射(钴源由中国人民解放军军事医学科学院提供)，剂量9.5Gy，接受辐照后的该批小鼠将作为骨髓细胞移植受者，是骨髓造血干细胞清除的小鼠。C57BL/45.1小鼠辐照后20小时，通过尾静脉移植上述步骤1获得的新鲜分离的C57BL/45.2小鼠的骨髓细胞，每只移植4×10⁷细胞。完成细胞移植后，立即进行下列步骤(优选于细胞移植后4小时内完成)：实验组小鼠皮下单次注射50μg/kg的人促血小板生成素(沈阳三生制药有限责任公司，批号：20130301)，对照组皮下注射等体积的PBS，每组5只小鼠。其中，针对实验组，注射前，人促血小板生成素要利用PBS进行100倍稀释。

针对上述两组小鼠，于完成细胞移植后18-20小时，脊椎脱臼处死小鼠，取出股骨和胫骨，用1-2mlPBS反复冲洗骨髓腔，2000rpm离心5min，加入红细胞裂解液(购自美国BD公司，货号555899，使用时去离子水将原液1∶10稀释后使用)，2分钟后加入5-10倍体积的PBS中止反应，2000rpm离心5分钟并洗2次，获得小鼠骨髓细胞，然后进行以下实验：流式细胞术及造血集落培养方法检测归巢到受者体内的造血细胞的比例。

其中，流式细胞术检测的具体步骤如下：

(1)针对上述两组小鼠中的每一只小鼠，将其骨髓细胞重悬于100μl的PBS，获得浓度为1×10⁷/ml细胞的细胞悬液；

(2)向上述细胞悬液中加入抗小鼠CD45.2、Sca-1、c-Kit抗体各1μl，Lineage抗体0.3μl，封好封口膜，放入4摄氏度冰箱中的转轮上，孵育40min；

(3)将孵育后的细胞进行离心，3000rpm，5min；

(4)将离心后的细胞用PBS洗两遍，定容至500μl，进行流式检测。

造血集落培养方法步骤如下：

针对上述两组小鼠中的每一只小鼠，取其骨髓细胞，将之与500μL小鼠造血细胞半固体培养基(配方为：0.9％甲基纤维素，15％胎牛血清，100U/ml青霉素/链霉素，1mM丙酮酸钠，2mM谷氨酰胺，2mMPFHMII，200μg/ml转铁蛋白，1体积％BSA，0.45mMMTG，30体积％IMDM，50ng/mlSCF，10ng/mlTPO，10ng/mlIL-3，10ng/mlIL-11，10ng/mlGM-CSF，3U/mlEPO)混匀，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养7天后，对总的造血集落形成单位(CFU)进行计数。

实验结果显示，注射血小板生成素的小鼠骨髓腔内供者骨髓细胞的比例，即CD45.2⁺细胞的比例与对照组相比无明显变化，CD45.2⁺细胞群中Lin^-细胞的比例与对照组相比变化不明显，CD45.2⁺Lin^-细胞群中Sca-1⁺c-Kit⁺细胞的比例有显著上升，骨髓细胞形成的造血集落数量明显多于对照组，具体结果见图1-3。其中，CD45.2⁺细胞为供者细胞^-、Lin^-Sca-1⁺c-Kit⁺是目前较为公认的小鼠造血干细胞表面标志，CD45.2⁺Lin-Sca-1⁺c-Kit⁺细胞群代表供者造血干细胞。其中，图1中对照组和TPO组的三张流式图分别展示了受者小鼠骨髓腔内供体来源细胞(CD45.2⁺)、以及其中血谱系阴性细胞、造血干/祖细胞(Lin^-、Lin^-Sca-1⁺C-kit⁺)的比例。如图1所示，针对对照组或TPO组的三张流式图，其中从左至右，左侧小图：CD45.2⁺代表供者小鼠来源的血细胞的比例；中间小图：表示从左侧CD45.2⁺细胞群中继续分析Lin^-细胞群的比例，此群细胞代表供者小鼠血谱系标志表达为阴性的造血细胞；右侧小图，表示从上一级Lin^-细胞群继续分析Sca-1⁺C-kit⁺细胞的比例，即LSK细胞(Lin^-Sca-1⁺C-kit⁺；L^-S⁺K⁺)，代表小鼠造血干/祖细胞。

图3中集落数量代表上述获得的骨髓细胞的集落形成能力，间接证明了其细胞中造血干/祖细胞的比例。图1-3的结果说明血小板生成素能够促进外源植入的造血干细胞归巢，并提高归巢的造血干细胞的数量。

进一步，通过实时定量PCR和Western-Blotting实验，发明人发现TPO会降低小鼠mmp-9基因的表达、抑制其蛋白表达，而mmp-9对于SDF-1α有降解作用，后者则在造血干/祖细胞归巢过程中发挥重要作用。因此，发明人认为，血小板生成素促进造血干细胞归巢的机理与其扰乱趋化轴SDF-1α-CXCR4有关。

实施例2

按照以下步骤，检测血小板生成素对骨髓细胞移植后小鼠存活率的影响：

C57BL/45.1品系小鼠购自天津血研所，6-8周龄，20g体重，雄性。小鼠稳定状态一周后进行⁶⁰Coγ射线照射(钴源由中国人民解放军军事医学科学院提供)，剂量9.5Gy，辐照20小时，经辐照的该批小鼠作为骨髓细胞移植受者。辐照后20小时，通过尾静脉移植实施例1中步骤1获得的新鲜分离的供者C57BL/45.2小鼠的骨髓造血细胞，每只移植5×10⁵细胞。完成细胞移植后，立即进行下列步骤(优选于细胞移植后4小时内完成)：实验组小鼠皮下单次注射50μg/kg的人促血小板生成素(沈阳三生制药有限责任公司，批号：20130301)，对照组皮下注射等体积的PBS，每组10只小鼠，观察小鼠的存活情况。其中，针对实验组，注射前，人促血小板生成素要利用PBS进行100倍稀释。

实验结果显示，移植细胞后单次注射血小板生成素的小鼠存活率明显优于对照组小鼠，小鼠生存曲线见图4。结合实施例1的结果，进一步说明血小板生成素促进了小鼠造血干细胞的归巢、增加了归巢的造血干细胞的数量，从而提高了辐射损伤小鼠的存活率。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.血小板生成素在制备药物中的用途，所述药物用于促进造血干细胞归巢。

2.一种用于促进造血干细胞归巢的药物，其特征在于，包含血小板生成素。

3.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物为选自注射剂、颗粒剂、片剂和胶囊剂的至少一种，优选为注射剂。

4.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物采用生理盐水或者PBS进行稀释。

5.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物在骨髓移植后24小时内，优选4小时内进行给药。

6.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物的给药途径为选自皮下注射、肌肉注射和静脉注射的至少一种，优选皮下注射。

7.根据权利要求2所述的药物，其特征在于，所述药物的给药剂量为10-100μg/kg。