CN105102610B - 用于细胞培养的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于干细胞或祖细胞培养的方法。更准确地说，本发明涉及使用一种或多种IαI(间α胰蛋白酶抑制剂或间α抑制剂)蛋白或其部分作为细胞培养基的组分或细胞培养表面材料上的包被层的细胞培养的方法。此外，本发明涉及细胞培养基和由一种或多种IαI蛋白或其部分提供的细胞培养包被层/基质。

Description

用于细胞培养的方法

发明领域

本发明涉及细胞培养的方法。更准确地说，本发明涉及使用一种或多种IαI (间α胰蛋白酶抑制剂(inter-alpha trypsin inhibitor)或间α抑制剂)蛋白或其部分作为细胞培养基的组分或细胞培养表面材料上的包被层用于细胞培养的方法。此外，本发明涉及细胞培养基和以一种或多种IαI蛋白或其部分提供的细胞培养包被层/基质。

发明背景

多能干(PS)细胞例如胚胎干(ES)细胞和诱导性多能干(iPS)细胞具有在长期培养期间维持多能性并且仍诱导分化成多种谱系的能力，因此潜在地提供用于例如基础研究、毒理学筛选、遗传病症的体外建模或治疗性细胞置换的新的细胞来源。直到可完全实现这些终点之前，仍有许多障碍要克服。例如寻找支持安全、简单和稳健的衍生化、生长、维持和大规模扩增，同时保持这些难以培养的细胞的自我更新的培养条件会是必要的。尤其重要的是需要用于体外维持人PS细胞的方法。这些方法必须足够好以维持细胞群而不诱导诱变、高水平的分化或多能性的丧失。

小鼠ES细胞广泛用于基础研究以例如研究正常和病理性发育和功能，且使用这些细胞获得的知识常常转移到人类系统中。现今使用的大多数小鼠ES (mES)细胞系生长在补充了选定批次的胎牛血清(FBS)和白血病抑制因子(LIF)的培养基中的预先平板接种去有丝分裂活性的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养细胞上。饲养细胞提供支持mES细胞附着和分泌提高mES细胞生长存活和繁殖的各种生长因子的基质，而FBS提供激素和必需营养物，以及改变培养基的生理/生理化学性质。LIF显著提高mES细胞多能性的衍生化和维持。已衍生出一些mES细胞系，并已适应在含有血清和LIF的培养基中0.1%明胶包被层(存在于胶原中的高平均分子量的水溶性蛋白质的异质混合物，并从牛皮肤提取)上无饲养细胞生长。这两种细胞培养方案有缺点，其组分(即FBS、牛血清白蛋白或BSA、明胶)中的许多不确定，并且是动物来源的。例如，FBS含有各种生长因子和促进ES细胞生长的其它不确定的组分，但它还表明含有可能影响mES细胞平板接种效率、生长和分化的潜在分化因子。因此FBS批次需要预先筛选和ES-合格以确保维持mES细胞维持和生长的血清因子的净作用超过分化诱导因子的作用。饲养细胞反过来（in their turm）分泌过多的无法控制的因子，并且是致病性污染的可能来源。

为了加强控制ES细胞实际上遇到什么因子，并且为了避免来自非所需的因子的干扰，已建立了若干更新的和更确定的方案。在2003年，已表明BMP4可与LIF组合有效地在不含血清和饲养细胞的培养物中用于mES衍生化和维持(Qi，Li等人，2004)。在2004年，开发了化学上确定的(未描述确切配方)合成的敲除血清替代品(synthetic knockout serumreplacement，KOSR)以替代血清。然而，KOSR在缺乏饲养细胞时不能单独支持mES单细胞培养。在2008年，表明了mES可在缺乏血清和饲养细胞时作为自由漂浮的球体保持在含LIF和bFGF (碱性成纤维细胞生长因子)的N2补充培养基，本文称为ESN2培养基中(Andang，Moliner等人，2008，Moliner，Enfors等人，2008)。

最近，加入B27和N2补充培养基中的补充2种抑制剂，促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)/胞外信号调节激酶(ERK)激酶(MEK)抑制剂PD0325901和糖原合酶激酶3 (GSK3)抑制剂CHIR99021的另一种确定的培养基(本文称为2i培养基)显示，在不加入外源因子的情况下维持mES细胞自我更新(Ying，Wray等人，2008)。培养在2i培养基中的小鼠ES细胞仍对LIF起反应，所述LIF提高克隆效率和增殖速率。这个培养方案的缺点是在血清不存在时，细胞不附着于组织培养板，而替代地作为自由漂浮的球体生长(Tamm，Pijuan Galito等人，2013)；而且，mES细胞的生长速率降低。

人PS (hPS)细胞及其分化细胞最常被在含有动物来源的组分的存在的表面或培养基的存在下培养，所述组分例如饲养层(小鼠来源的(通常为MEF)和人来源的(通常人包皮成纤维细胞或HFF)二者)、Matrigel® (Engelbreth-Holm-Swarm EHS肿瘤的可溶性基底膜提取物)、敲除血清替代品(KOSR)和/或衍生物如BSA。加入培养环境的这些动物来源的试剂使细胞暴露于潜在有害的病毒或其它感染剂中，其可能转移给患者或损害hPS细胞的一般培养和维持。另外，这类生物制品对于批次改变、免疫应答和有限的存放期是脆弱的，并且如果细胞待用于细胞疗法，则细胞暴露于来自其它物种的分子还产生可在接受者中产生免疫应答的改变。

迄今为止，已描述了几个利用化学上确定的培养基和合成的或确定的表面的完全重组的无异源物(xeno-free)系统。人PS细胞培养中的最新成就发表于2011年的Nature方法，其描述了化学上减少且完全确定的培养基，名为E8，只含8种不同的化学组分，可支持hiPS细胞衍生化和在Matrigel®或基于玻连蛋白的表面上更成功的培养(Chen，Gulbranson等人，2011)。即使如此，当使用确定的培养基时，不同的细胞系和不同的实验室仍获得不同的结果，而且最广泛使用的方案对于hPS细胞依然是Matrigel®和mTESR1®(其含有从FBS纯化的BSA)的组合；对于mES细胞为明胶包被层和补充FBS的培养基。而且，如果不是在ROCK抑制剂分子(即Y-27632)的存在下，hPS细胞不能作为单细胞分裂(Watanabe，Ueno等人，2007)，并且对于常规传代需要使用和缓分离技术以团块分裂，这证实了胞外环境对多能干细胞的关键作用。

仍急需了解未分化未突变的多能干细胞的生长和维持所必需的所有不同的组分。重要的是得到胞外基质(ECM)和培养基因子的正确组合用于最佳维持，特别用于人PS细胞系，否则细胞显示低的附着率、存活率和增殖速率以及高的分化水平。

为了细胞存活和增殖速率，用于细胞培养的当前方案在细胞培养基中仍使用FBS或衍生物例如BSA，因此，仍需要不损害细胞、培养条件或多能性的改良的无血清方案。

发明概述

在本发明中，我们发现促进细胞黏着和长期细胞培养活力的因子。更准确地说，本发明提供在部分或完全化学上确定的培养基存在下，间α胰蛋白酶抑制剂(IαI)家族蛋白质或其部分，具体地说HC2 (重链2)作为表面包被层和/或培养基添加剂用于细胞黏着和长期培养、多能干细胞的维持和生长至少20次传代，而不诱导显而易见的分化或核型异常的新的用途。

因此，第一方面，本发明提供用于干细胞或祖细胞培养的方法，所述方法包括将来自IαI (间α胰蛋白酶抑制剂)蛋白质家族的一种或多种蛋白质或其部分加入细胞的无血清培养物中。细胞优选为干细胞。本发明的添加会促进自我更新、附着、存活，且在PS细胞的情况下，还促进多能性。IαI蛋白或其部分自血清分离、作为重组蛋白产生或以化学方法合成。

细胞优选为黏着细胞，而在一个优选的实施方案中，细胞是PS (多能干)细胞，并且可为ES (胚胎干)细胞或iPS (诱导多能干)细胞。在本发明的一个实施方案中，细胞为人细胞。

优选IαI蛋白或其部分选自IαI (IαIHC1、IαIHC2和尿抑胰酶素)或IαIH2,B。可以使用IαI蛋白的重链，例如来自IαI的重链2 (HC2)。

在PS细胞的情况下，优选细胞培养是无血清的。

在一个实施方案中，IαI蛋白或其部分作为包被剂包被在细胞培养表面，所述表面例如塑料、载体、支架、基质或网。

在另一个实施方案中，将IαI蛋白或其部分加入无血清细胞培养基中。

IαI蛋白或其部分的浓度为0.1 µg/ml-200 µg/ml、优选2-100 µg/ml、最优选10-50 µg/ml培养基或包被溶液。

本发明的方法适于在至少20次传代期间不诱导细胞分化或突变的细胞培养。在细胞培养后，可制备/提供PS细胞用于例如细胞疗法、药物筛选和毒性测定法。

第二方面，本发明提供包含浓度为0.1 µg/ml-200 µg/ml、优选2-100 µg/ml、最优选10-50 µg/ml的IαI蛋白或其部分的细胞培养基。培养基优选为无血清培养基。

第三方面，本发明提供包含以上述浓度含有IαI蛋白或其部分的包被层的细胞培养表面。包被可在4℃下过夜或在室温或37℃下1-2小时产生，包被层浓度范围为0.1 µg/ml-200 µg/ml、优选2-100 µg/ml、最优选10-50 µg/ml。

第四方面，本发明涉及使用IαI蛋白、优选IαI或H2用于细胞黏着和更新。

各种间α胰蛋白酶抑制剂蛋白质的一种或多种或部分会提供超过之前的包被材料的优势用于培养多能干细胞、特别是未分化未转化的多能干细胞系。例如，来自人血清的间α胰蛋白酶抑制剂蛋白质或其部分的纯化提供无动物组分的基质，并且使用来自商业生产的因子IX的副流分使得该方法相对简单且经济。然而，IαI的亚部分也可重组表达或以化学方法合成以使其完全确定。

在化学上确定的表面培养未分化细胞的能力排除了特别来自复合培养基的动物血清组分的额外污染组分。另外，与血清和血清来源的添加剂例如血清(通常FBS)、KOSR和BSA相比，批次间变化也会减小，因为它不会依赖于不同组分的比例浓度。当结合附图阅读时，从下面的描述会理解这些和其它优势。

附图简述

图1是mES细胞中一些自我更新途径的示意图，表明IαI蛋白掺入TEAD2-Yes-YAP途径中。

图2显示IαI蛋白质家族的概况。

图3显示在mES细胞中IαI对TEAD2依赖性转录活性的作用的剂量反应分析。

图4显示不同包被层和/或含不同培养基补充剂的2i培养基生长的mES E14细胞的附着测定明视场图像。

图5显示在未包被塑料、用玻连蛋白肽(Vitronectin XF™，Stem CellTechnologies)在室温下包被1小时的塑料、在补充10 μg/ml IαI的培养基中未包被塑料和在4℃下用20 μg/ml IαI-HC2 ON包被的塑料上，在E8培养基中人iPS细胞系K02C的附着测定明视场图像。

图6显示在2i培养基、补充2% FBS的2i培养基和补充IαI 10µg/ml的2i中生长3次传代的mES细胞系E14的倍增时间。

图7显示经适应生长在以下两种不同条件下在基本E8培养基中的人PS细胞系K02C的明视场显微镜图像：玻连蛋白包被层(Vitronectin FX™，Stem Cell Technologies)持续16次传代，在补充20μg/ml IαI的未包被塑料持续14次传代。

图8显示在接种后3天在TeSR™-E8™培养基中使用递增浓度的IαI，黏着在未包被的塑料孔上的碱性磷酸酶阳性K02C hiPS细胞集落。

发明详述

之前描述了新的激酶途径涉及小鼠胚胎干(mES)细胞的自我更新和多能性的维持(Tamm，Bower等人，2011)。简单地说，发现LIF受体的一个新的下游途径激活Src激酶Yes，该激酶进而激活胞质Yes相关蛋白(Yes-associated protein，YAP)，所述胞质Yes相关蛋白会进入核，并与TEAD2形成转录复合体，激活其它充分描述的自我更新和多能性因子(例如Oct3/4和Nanog)的转录(图1)。

本发明人发现，FBS还可激活TEAD2依赖性转录活性。通过一套分级技术，设法鉴定血清中激活TEAD2依赖性转录的一种组分。该分离的蛋白质被鉴定为间α胰蛋白酶抑制剂(Iα)家族的组分：ITIH2或IαI重链2 (HC2)。

由于5种重链即HC1、HC2、HC3、HC4和HC5 (虽然未发现最后这两种形成复合体，并且仅作为肽存在于血清中)和通过硫酸软骨素(CS)链连接在一起的kunitz结构域蛋白酶抑制剂尿抑胰酶素(Bk)的交替组合的结合，IαI蛋白家族是复杂的一组蛋白质-糖胺聚糖-蛋白质(PGP)复合体，其在血清中以相当高的浓度组成型出现(人中为0.6-1.2 mg/ml)(Josic，Brown等，2006)。IαI蛋白家族的两个最常见的成员是IαI (HC1、HC2和Bk)和Pre-α-抑制剂(PαI、HC3和Bk)；虽然IαIH2 (HC2、Bk)、IαIH4P (仅HC4)和仅Bk也可存在于血浆中(图2)。

IαI蛋白主要由肝产生；前肽(pro-peptide)在高尔基体中经加工并装配，然后分泌进入血流。IαI蛋白复合体大部分仍然是无活性的，直到它们到达其靶组织，并被肿瘤坏死因子基因相关蛋白6 (TSG-6)切割。TSG-6切割含硫酸软骨素链的HC共价键，与HC形成瞬时共价键以将其最终转移至乙酰透明质酸(HA)，一种胞外基质的常见部分。尿抑胰酶素结构域结合TSG-6提高蛋白水解活性(Wisniewski，Hua等人，1996)，并且只负责IαI针对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、纤溶酶、组织蛋白酶G、顶体蛋白和白细胞弹性蛋白酶的蛋白酶抑制活性。乙酰透明质酸是由重复二糖：(1-β-4)D-葡糖醛酸和(1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡萄糖构成的长的线性非硫酸化糖胺聚糖(GAG)。乙酰透明质酸还被描述为胚胎发育(Schoenfelder和Einspanier 2003)、组织组构(Trochon，Mabilat等，1996；Itano，Atsumi等，2002)、伤口愈合(Pienimaki，Rilla等，2001；Baier Leach，Bivens等，2003)、血管生成(West，Hampson等，1985)、肿瘤发生(Toole和Hascall 2002)和可能甚至在组织的生物化学性质中的重要元件。另外，众所周知，HA与细胞表面受体缔合，并可助于调节细胞运动性和黏着(Zhu，Mitsuhashi等人，2006；Block，Hansen等人，2011)。IαI-HC是已明确证实与HA共价结合的唯一蛋白质。通过结合组织中的HA纤维，HC可改变细胞的小生境，因此在例如黏着、炎症和ECM形成中起作用。一些研究表明，IαI蛋白不仅在炎症控制和胞外基质稳定中起重要作用，而且当加入细胞中时还可诱导富含HA的胞外基质的产生和分泌。

按照本发明，发现IαI对PS细胞培养是重要的。当使用半确定的培养基2i和含LIF和FGFb的完全确定的悬浮培养基ESN2时，mES细胞在漂浮球体中并以比在含血清条件下慢的速率生长。而且，当使用常规包被表面明胶、纤连蛋白和胶原时，2i或ESN2培养基中的小鼠ES细胞不贴壁，并作为自由漂浮的球体继续生长(图4)。加入2% FBS使细胞呈精致紧密的集落黏附于塑料表面，并加快倍增时间。本发明人发现与仅2i培养基相比，加入相应的(10μg/ml)或更低量的IαI还实现mES集落黏附于无血清2i培养基中的塑料表面，提高增殖速率(图4和6)。

当使用完全重组的无血清培养基TeSR™-E8™时，针对附着还测试了4个人PS细胞系。在从mTeSR™1到TeSR™-E8™ (Stem Cell Technologies)逐步进行的E8适应的1次传代后，使用不同条件接种细胞。图4显示人iPS细胞系K02C上的附着数据。当无补充加入商用TeSR™-E8™培养基时，阴性对照显示在未包被板上无附着，尽管它们停留在使用玻连蛋白肽(Vitronectin FX™，Stem Cell Technologies)包被的塑料皿上。人iPS细胞系K02C也停留在使用20 μg/ml IαI-HC2包被的塑料皿上。而且，用浓度范围为10-50 μg/ml的纯化的人完整分子IαI补充培养基也诱导人iPS细胞在未包被塑料皿上的附着(图4)。当在补充20 μg/ml IαI的TeSR™-E8™培养基中培养超过5次传代时，人ES细胞系H181和H207 (由Dr.Outti Houvatta友情提供)和HUES1 (由Dr. Douglas A. Melton友情提供)显示在相同条件下相同的附着行为，并维持多能性以及集落形态。

按照本发明，IαI可形成PS细胞ECM的一部分，并改变性质或其小生境，诱导胞外基质形成和/或重塑。此外可将IαI加入确定的培养物中以促进附着，为体外细胞存活和增殖提供良好环境。IαI会与细胞结合，改变来自其环境的信号转导，改进分裂后的存活以及自我更新和多能性的维持。

实验部分

血清分级分离和TEAD2依赖性转录活化中活性流分的鉴定

如前所述，首先将胎牛血清(FBS)用适度的乙腈(ACN)沉淀处理以从其载体分离较小的蛋白质(Lei等人，2008)。简单地说，加入30% V/V的ddH₂O和20% V/V的乙腈(ACN)将FBS稀释，加温至40℃ 15分钟。然后，将混合物以14,000xg离心10分钟以沉淀任何不溶性物质。如前所述将上清液在结合缓冲液中稀释用于改进的Blue Sepharose色谱法纯化(Arakawa等人，2007)。简单地说，在将其加入平衡的Blue Sepharose柱(GE Healthcare)中之前，加入4ml饱和硫酸铵溶液(SAS)和24ml结合缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，2M硫酸铵，pH 7)，将4ml稀的FBS进一步稀释。随后将柱用20mM磷酸盐缓冲液pH 7洗涤以除去全部结合的牛血清白蛋白(BSA)，并进一步洗脱；第一次用含2M NaCl的20mM磷酸盐缓冲液pH 7，然后用20mM磷酸盐缓冲液1M精氨酸(Arg) pH 7。

将洗脱的流分(洗脱1和洗脱2)浓缩，并使用Vivaspin 6柱(GE Healthcare)针对PBS透析，然后加入无血清培养基中的E14 mES细胞，采用萤光素酶测定，评价TEAD2依赖性转录活性。将E14 mES细胞系接种到含血清的培养基中的24孔板和明胶包被板中，并生长过夜直到70-80%汇合。然后按照生产商的建议，将细胞在OPTI-MEM无血清培养基(LifeTechnologies)中使用Lipofectamine™ 2000 (Life-Technologies)在37℃、5% CO₂下转染4小时，之后加入基于无血清GMEM的培养基中终止转染。将细胞用pCS GT-IIC-萤光素酶(GTIIC) (Jiang和Eberhardt 1995)和含有细菌β-半乳糖苷酶基因的pCMV β-gal参考质粒转染。在血清饥饿24小时后，将细胞暴露于稀释于无血清培养基的不同的洗脱流分中，并采用萤光素酶测定，测量TEAD2依赖性转录活性。将细胞裂解，并在微量板发光计和光度计读数器(Wallac VICTOR 1420 Multilabel Counter：Perkin Elmer)中针对萤光素酶和β-半乳糖苷酶活性进行测定。

发现第一洗脱样品(2M NaCl)具有最大TEAD2依赖性转录活化作用(图3)，并采用常规肝素色谱法(Pharmacia AB，现为GE Healthcare)进一步分级。简单地说，使用Vivaspin柱20 (GE Healthcare)，将洗脱流分浓缩，并针对肝素色谱法结合缓冲液50mMTris-HCl pH 8透析，并加载到平衡的柱中。用含0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 M NaCl的1ml体积的6个流分逐步进行洗脱。使用Vivaspin 6柱将流分再次透析，并浓缩至适于细胞的缓冲液中，如上所述针对TEAD2依赖性转录进行测试。使用SDS-PAGE 10%丙烯酰胺凝胶和考马斯蓝染色，分析不同的洗脱样品。将TEAD2依赖性转录作用与不同流分的蛋白质模式进行比较，2个条带被鉴定为可能的TEAD2-转录激活分子。将凝胶送交MS-MALDI-TOFF分析(ÅkeEngstrom，IMBIM)，条带被鉴定为：1)间-α球蛋白抑制剂H2多肽[Bos taurus]和2) α-2-巨球蛋白[Bos taurus]。

如上所述，在细胞中测试纯化的人IαI，并进行了剂量反应试验。细胞上的IαI暴露不仅具有TEAD2-转录活化作用，而且这种作用还遵循剂量反应趋势，其达到超过5% FBS的类似量。结果以一式三份进行并归一化至%对照的至少3个独立实验的对照平均百分比和SEM线条表示，其中代表血清饥饿细胞的对照为100%（were the control is 100% for theserum-starved cells）。通过应用用于Mac的GraphPad Prism version 5.00d (GraphPadSoftware，San Diego California USA)的单向ANOVA与Dunnett事后检验进行统计分析，其中*表示p<0.05，**表示p<0.001和*** p<0.001 (图3)。

人IαI的纯化

如前所述，进行IαI和重链HC1和HC2的分离(Blom，Morgelin等，1999)。简单地说，将来自商业化生产的因子IX的副流分针对磷酸缓冲盐水(PBS)透析，离心以除去不溶性蛋白质聚集体。然后将这种材料过滤，并在HiPrep 26/60 Sephacryl S-400 HR进行凝胶过滤，这产生超过95%纯的IαI。对于重链的释放，将2M NaOH加入含1mg/ml IαI的PBS溶液中，得到0.05M NaOH的终浓度(Enghild，Thogersen等人，1989)。在室温下15分钟后，加入Tris-HCl pH 8.0，得到0.25M的终浓度。使混合物在37℃下孵育1小时。然后使样品针对20mM磷酸钠pH 7.6在4℃下透析过夜，应用于用相同缓冲液平衡的阴离子交换凝胶(MonoQ 5/50 GL；GE Healthcare)中。蛋白质以0.5 ml/分钟的线性流速用100 ml由0至0.7M NaCl的/20mM磷酸钠(pH 7.6)的梯度洗脱(Balduyck，Piva等，1993)。在8%丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶中接着用考马斯亮蓝染色，对流分进行分析。除非另有说明，否则通过UV测量确定蛋白质浓度。IαI的蛋白质部分、HC1和HC2的吸光度系数获自以前的出版物(Blom，Morgelin等人，1999)。完整蛋白质的相应值对于IαI、HC1和HC2分别为0.60、0.47和0.72 mg^-1 ml cm^-1。在Vivaspin 20柱(GE Healthcare Bio-Sciences AB)中将蛋白质溶液浓缩，并针对PBS透析，保存在-20℃下，直到用于实验。

加入2% FBS或10µg/ml IαI增加mES细胞在2i培养基中的倍增时间

如前所述(Smith，1991)，在0.1%明胶(Sigma)包被的细胞培养皿(Corning)上，在补充青霉素、链霉素、谷氨酸盐、丙酮酸盐(所有来自Life technologies)、β-巯基乙醇(Sigma)和LIF (Millipore)的基于GMEM的培养基(Sigma)中，在10% FBS和KOSR中以50/50的浓度连续培养维持E14 mES细胞系。使用进入2i培养基(Ying，2008 Nature)的TrypLE™(Life Technologies)，一种含LIF、PD0325901和CHIR99021抑制剂的N2B27配方(Selleckchem)，使细胞在无血清条件下传代。在2次传代后，所有细胞在漂浮球体中生长。使用TryPLE™，使该球体再次在无血清条件下传代，然后平板接种在2i培养基、含2% FBS的2i培养基和补充10 µg/ml IαI的2i培养基中。使细胞生长持续3次传代，在每次传代中计数以评价增殖速率。与生长在用2i培养基的漂浮球体中的细胞相比，补充的培养基显示较高的增殖速率。补充FBS的培养基具有最短的倍增时间，均值为15.19小时。补充IαI的培养基具有21.16小时的较长倍增时间，但与在2i培养基中生长的漂浮球体的25.64小时相比仍较短(图5)。统计分析进一步证实了不同配方的生长速率的显著差异。

针对胚胎干细胞和培养基添加剂FBS或IαI评价mES细胞在2i培养基中在不同的常 规表面包被蛋白质上的附着

将不同的包被蛋白质在PBS中稀释到10 µg/ml玻连蛋白、10 µg/ml纤连蛋白、10ug/ml胶原I、2% FBS、25 µg/ml IαI和50 µg/ml HC2的终浓度。将12孔板孔用不同的溶液在37℃、5% CO₂下包被2小时。对于玻连蛋白、纤连蛋白、胶原I和FBS将孔用PBS洗涤3次，对于IαI和HC2洗涤1次。在2i培养基中无血清分裂后，将相同数目的E14 mES细胞接种到不同的包被孔中。在48小时后，将培养基转移到新的孔中，将新鲜的培养基加入旧的孔中，拍摄孔中剩余的贴壁细胞(上部分)和用上清液转移的漂浮细胞球体(下部分)的照片以评价附着(图4)。同样，使用TryPLE™，使E14 mES细胞在无血清条件下从2i培养基中传代，并转移到含或不含2% FBS、5µg/ml IαI、10µg/ml IαI或20µg/ml IαI的2i培养基中。将对照细胞接种到明胶包被(0.1%)孔中的2i培养基中(图4)。也使细胞生长24-48小时，并拍摄贴壁细胞和上清液漂浮球体的照片。常规包被层无一促进生长在2i培养基中的E14 mES细胞的附着，即对于用于mES细胞系E14的2i培养基配方，明胶、纤连蛋白和胶原全都无法作为合适的包被蛋白质。只有玻连蛋白支持mES集落的附着和生长。当加入2% FBS作为包被溶液或作为2i培养基的补充剂时，几乎所有的细胞都附着在细胞培养塑料上。当用IαI或裂解的球形部分HC2包覆塑料时，2i培养基中的细胞也是贴壁的。当加入纯化的人IαI蛋白作为2i培养基的补充剂时，细胞也黏附在细胞培养介质上(图4)。

E14 mES细胞在2i培养基中长期培养达20次传代

使用TryPLE™，使生长在2i培养基中的E14 mES细胞系在无血清条件下传代，然后平板接种在2i培养基、含2% FBS的2i培养基或含10µg/ml IαI的2i培养基中。补充的培养基中的细胞黏附于细胞培养塑料上，而对照细胞(仅2i培养基)继续作为漂浮球体生长。生长在含2% FBS的2i培养基中的细胞显示高的贴壁率，细胞在板上的散布加快。然而，在这些条件下，一些集落失去mES细胞集落典型的紧密集落形态。生长在补充IαI的培养基中的细胞也黏附于塑料上，但不使紧密的集落形态疏松。培养物保持达20次连续传代，其自我更新得到维持，分化水平非常低。为了研究细胞是否保持其多能性，使其在悬滴中形成用胚状体(1600细胞/滴)达4天，然后允许其黏附于细胞培养塑料上，随后分化6天。不同培养基配方之间未观察到含有博动心肌细胞的EB派生物的量的差异。

人PS细胞系在用IαI和HC2的不同包被/补充的条件下在E8培养基中的附着

将人诱导多能干细胞系K02C和人ES细胞系H181、H207 (由Dr. Outi Houvatta友情提供)和HUES1 (由Dr. Douglas A. Melton友情提供)按常规培养在Matrigel® (BDBiosciences，hES合格的基质)和mTERS1® (Stem Cell Technologies，含有BSA的确定的培养基)中。采用逐步培养基适应使培养物自mTeSR™至TeSR™-E8™培养基适应，在实验前将适应的培养物接种到Vitronectin-FX™包被层和TeSR™-E8™培养基(Stem CellTechnologies)中。生长在E8培养基中的人PS细胞用ROCKi Y27632 (Stem CellTechnologies)处理，使用和缓的分离溶液(0.5 M EDTA pH 8.0)和细胞推杆传代，以收集小型集落，用P1000吸液，对集落进行额外的机械破碎。将集落接种到具有以下的12孔板上：未包被表面、玻连蛋白包被表面(在室温下1小时)、IαI-HC2包被表面(20µg/ml在PBS ON中，在4℃下)和在孔中加入10µg/ml IαI补充的E8培养基的未包被表面。24小时后，更换孔中的培养基，拍照以评价细胞附着。人PS细胞不附着于未包被表面上。具有玻连蛋白包被层的阳性对照达到人PS细胞附着的正常水平。将IαI加入E8培养基中刺激人PS细胞附着至与玻连蛋白包被层类似的程度。与玻连蛋白包被层或补充IαI的培养基相比，IαI-HC2包被孔实现细胞较低但仍显著的附着(图5)。

人PS细胞在未包被塑料上在补充IαI的TeSR™-E8™培养基中的长期培养

将人诱导多能干细胞系K02C和人ES细胞系H181、H207 (由Dr. Outi Houvatta友情提供)和HUES1 (Dr. Douglas A. Melton友情提供)按常规在Matrigel® (BDBiosciences，hES合格的基质)和mTERS1® (Stem Cell Technologies，含有BSA的确定的培养基)中培养。采用逐步培养基适应使培养物从mTeSR™至TeSR™-E8™培养基适应，将适应的培养物接种到Vitronectin-FX™包被层和TeSR™-E8™培养基(Stem CellTechnologies)中。在人PS细胞对TeSR™-E8™和Vitronectin-FX™适应的1次传代后，使用和缓的分离溶液(0.5 M EDTA pH 8.0)和细胞推杆(TPP)使人PS细胞传代以收集小型集落。然后将部分细胞接种到具有补充20 μg/ml纯化的IαI完整人蛋白质的TeSR™-E8™的未包被塑料上。当接种在具有补充IαI的培养基的未包被的塑料上时，全部4种人PS细胞系都显示附着。将使用IαI补充或Vitronectin-FX™包被层的培养物保持长期培养。补充20 μg/mlIαI的TeSR™-E8™的新的培养基配方以与Vitronectin-FX™包被层组合的TeSR™-E8™的商用配方类似的方式，保持人PS细胞持续超过20次传代。图7显示使用IαI补充集落如何在14次传代后保持相同的形态。

多能性标志物的免疫细胞化学

采用免疫细胞化学和碱性磷酸酶染色，针对多能性标志物检查经适应生长在Vitronectin-FX™包被层或20 μg/ml IαI补充上的TeSR™-E8™的人PS细胞系和经适应生长在补充2% FBS或10 μg/ml IαI的2i培养基上的小鼠ES细胞。采用免疫细胞化学，检查小鼠ES细胞中的Oct3/4、Nanog、Sox2。两种培养条件显示高水平的多能性标志物，其分化可忽略或无分化迹象。采用免疫细胞化学针对仅胞外多能性标志物Tra-1-60、Tra-1-80和SSEA-4或与针对IαI-HC1和HC2的抗体组合，检查人PS细胞系K02C和H181。两种培养条件保持两个细胞系中的多能性标志物表达。然而，IαI-HC2显示类似于多能性标志物的模式，即仅在同时对多能性标志物阳性的集落上为阳性，并且不染色开始分化的集落。综上所述，将IαI加入培养基在5次传代后保持小鼠和人PS细胞两者的无血清培养物的多能性。

碱性磷酸酶染色

使用0.5 EDTA pH 8.0和细胞推杆，接种经适应生长在TeSR™-E8™和Vitronectin-FX™包被层上的人PS细胞系H181和K02C，并使用补充不同浓度的纯化的人IαI完全蛋白质的TeSR™-E8™培养基，将小集落接种到12孔板中。在生长2或3天后，使用碱性磷酸酶试剂盒(Life Technologies)将细胞染色，以视觉上检测多能人PS集落。较高浓检测度的IαI实现人ES细胞的较高贴壁率和生长速率(图8)。

参考文献

Claims (12)

1.一种用于干细胞或祖细胞培养的方法，所述方法包括将来自间α胰蛋白酶抑制剂蛋白家族的一种或多种蛋白或其部分加入细胞的无血清培养物中，其中所述一种或多种蛋白或其部分选自间α胰蛋白酶抑制剂、尿抑胰酶素或间α胰蛋白酶抑制剂蛋白的重链2，且其中所述细胞在不存在胞外基质包被层的情况下培养。

2.权利要求1所述 的方法，其中所述间α胰蛋白酶抑制剂蛋白或其部分从血清中分离、作为重组蛋白产生或以化学方法合成。

3.权利要求1或2所述 的方法，其中所述细胞是黏着细胞。

4.权利要求1或2所述 的方法，其中所述干细胞是多能干细胞。

5.权利要求1或2所述 的方法，其中所述干细胞是胚胎干细胞或诱导多能干细胞。

6.权利要求1或2所述 的方法，其中所述细胞是人的。

7.权利要求1或2所述 的方法，其中将所述间α胰蛋白酶抑制剂蛋白或其部分加入细胞培养基中，或作为包被剂加入细胞培养表面。

8.权利要求1或2所述 的方法，其中所述间α胰蛋白酶抑制剂蛋白或其部分的浓度为0.1 µg/ml-200 µg/ml培养基或包被溶液。

9.权利要求1或2所述 的方法，其中所述间α胰蛋白酶抑制剂蛋白或其部分的浓度为2-100 µg/ml培养基或包被溶液。

10.权利要求1或2所述 的方法，其中所述间α胰蛋白酶抑制剂蛋白或其部分的浓度为10-50 µg/ml培养基或包被溶液。

11.权利要求1或2所述 的方法，其在至少5次传代期间用于细胞培养而又不诱导细胞分化或突变。

12.间α胰蛋白酶抑制剂或间α胰蛋白酶抑制剂蛋白的重链2用于无血清干细胞或祖细胞黏着和更新的用途。

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