CN105092546B - 检测磷脂酶a2活性的囊泡及其制备方法和荧光探针检测磷脂酶a2活性的方法 - Google Patents

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本发明提供一种检测磷脂酶A2活性的囊泡及其制备方法和应用该囊泡检测磷脂酶A2活性的方法，以1‑萘酚为英冠探针，分别测定450nm及360nm处的荧光强度并获得两者的比值，在标准曲线中读取相应的酶活性度数即可。本发明使用的探针分子简单且价格便宜，其特殊的性质非常适合与磷脂参与的囊泡类型的底物结构和酶催化反应的测定。同时，本发明的检测方法稳态光谱、寿命与酶活性相关性良好，两种方法所得结果比较匹配。

Description

检测磷脂酶A2活性的囊泡及其制备方法和荧光探针检测磷脂 酶A2活性的方法
技术领域
本发明涉及磷脂酶A2活性的检测，具体而言是一种检测磷脂酶A2活性的囊泡及其制备方法和应用该囊泡的荧光探针检测磷脂酶A2活性的方法。
背景技术
磷脂广泛存在于自然界所有动植物机体中，是生物膜的主要组成部分。而对磷脂的代谢过程研究，例如磷脂酶的水解，在生物化学领域中有着重要作用。
磷脂酶A2(PLA2)是一类催化磷脂二位酰基(Sn2)水解的酶族，其广泛存在于细菌、植物、哺乳动物的组织、细胞和分泌物中，具有产生二十烷酸类炎性介质、参与磷脂重建、肺泡表面活性物质代谢、细胞信号传递、宿主反应、促进血液凝固等作用。研究证明，磷脂酶A2在肺脏、心血管、胃肠道、皮肤、骨骼等系统的急、慢性炎症性疾病中，磷脂酶A2活性均有增高并介导一系列病理生理过程。因此，磷脂酶A2活性的检测可作为早期预报病理进程及诊断性指标。
目前，磷脂酶A2活性的检测法主要有：滴定法、放射标记法、分光光度法以及荧光分析法。滴定法是保持体系pH值稳定条件下，采用碱滴定磷脂酶A2水解卵磷脂生成的自由脂肪酸浓度，通过消耗的碱的量来确定磷脂酶A2的活性。作为滴定标准液的碱可用溶有咪唑.SO2和I2的甘油-甲酯，这是一种连续检测方法，它可以探测自然底物卵磷脂的水解。放射性检测需要合成被放射性元素标记的卵磷脂，这些卵磷脂都可以买到，但通常十分昂贵，且灵敏度依赖于标记底物的特定的放射性。分光光度法与荧光分析法使用最为广泛，通常选择体系灵敏的探针或标记物，对其光谱性质进行检测。
上述各方法均存在不同的问题：滴定法灵敏度不高；放射标记法灵敏度非常高，但是需要有放射性元素标志的磷脂，通常十分昂贵；分光光度法与荧光分析法使用最为广泛，但是通常情况下使用的标记物、探针比较昂贵或者灵敏度不够。
因此，我们需要一种新的磷脂酶A2活性的检测法，灵敏度高且易于操作又经济实惠。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明提出一种检测磷脂酶A2活性的囊泡及其制备方法和应用该囊泡中的荧光探针检测磷脂酶A2活性的方法。
为实现上述目的，所采取的技术方案是：一种检测磷脂酶A2活性的囊泡，具有由卵磷脂和胆固醇分子构成的双分子层，在所述双分子层中包封有荧光探针分子。
在本发明一实施例中，所述荧光探针为1-萘酚。
在本发明一实施例中，所述卵磷脂、胆固醇的质量比为3:1。
本发明还提供一种上述检测磷脂酶A2活性的囊泡的制备方法，所述方法是将卵磷脂、胆固醇按质量比溶解于氯仿-甲醇的混合液中，40℃恒温旋转蒸发，使溶剂完全蒸发；然后加入溶解有1-萘酚的Tris-HCl缓冲液，使总脂浓度为3％，然后搅拌使膜脱落，60℃孵化0.5～1.5小时。
在本发明一实施例中，所述卵磷脂、胆固醇的质量比为3:1，所述氯仿-甲醇的混合液中，氯仿、甲醇的体积比为2:1。
在本发明一实施例中，所述Tris-HCl缓冲液中1-萘酚的浓度为4μmol/L。
在本发明一较优实施例中，提供一种上述检测磷脂酶A2活性的囊泡的制备方法，所述方法是将卵磷脂、胆固醇按质量比为3:1溶解于氯仿-甲醇的混合液中，40℃恒温旋转蒸发，使溶剂完全蒸发；然后加入溶解有1-萘酚的Tris-HCl缓冲液，使总脂浓度为3％，然后搅拌使膜脱落，60℃孵化0.5～1.5小时。
本发明还提供一种检测磷脂酶A2活性的方法，所述方法是将待测样品滴加入上述囊泡的溶液中，将其荧光光谱在360nm处归一化，获得450nm处荧光强度或荧光寿命，在归一化后450nm荧光强度与磷脂酶A2活性标准曲线或者450nm荧光寿命与磷脂酶A2活性标准曲线中读取相应的酶活性度数即可。
在本发明一实施例中，所述的归一化后450nm荧光强度与磷脂酶A2活性标准曲线为 y1＝-8.93+9.27x1，其中，x1为归一化后450nm处荧光强度，y1为磷脂酶A2活性；所述的归一化后450nm荧光寿命与磷脂酶A2活性标准曲线为y2＝-34.84+2.178x2，其中，x2为归一化后450nm处荧光寿命，y2为磷脂酶A2活性。
在本发明中，采用荧光稳态光谱，在特定波长下测定荧光探针在不同条件下的荧光寿命。选择1-萘酚作为荧光探针是因为：萘酚分子最令人关注的特点之一就是该分子在电子激发态时有很高的一个质子从OH基转移到分子周围的其他溶剂分子的几率，而在电子基态时这种转移的几率却很低，因而萘酚分子成为研究质子转移机理及其应用方面典型的分子。1- 萘酚的两个发光状态分别是中性状态(NpOH﹡)与阴离子状态(NpO—﹡)。在水相时，萘酚的主要存在形式为阴离子状态的NpO—﹡(λ激发＝290nm，λ发射＝450nm)，而没有被水解的NpOH﹡(λ激发＝290nm，λ发射＝365nm)则被淬灭不发光。在疏水相，介质接受质子能力弱，激发单线态NpOH﹡不离解，只能观察到NpOH﹡的荧光。在囊泡体系中，由于对探针的包埋作用，则既可看到萘酚分子型体的受激发光，也能观察到离子型体所发的光。
在本发明中，囊泡中的磷脂在磷脂酶A2的水解作用下，一方面囊泡结构被破坏，导致包埋在内水相中的萘酚分子部分释放到水相之中，增加了离子态的比例及荧光强度；一方面水解产物自由脂肪酸导致了溶液偏酸性，分子态的NpOH﹡更易被酸式离解。这两方面原因都将导致450nm处的荧光增强。因此450nm处的归一化强度与寿命两方面都可以对磷脂酶A2的反应速率进行表征，进而计算磷脂酶活性。
与现有技术相比，由于1-萘酚分子比较常见，且自身的化学性质非常适合表征酶催化反应，因而克服了常用的荧光探针价格昂贵的技术缺陷；同时本发明的检测非常灵敏，结果也准确。本发明提供了一种荧光的、可连续的酶催化动力学的测定法，它可以随着时间测定反应底物的水解进程。本发明使用的探针分子简单且价格便宜，其特殊的性质非常适合与磷脂参与的囊泡类型的底物结构和酶催化反应的测定。同时，本发明的检测方法稳态光谱、寿命与酶活性相关性良好，两种方法所得结果比较匹配。
附图说明
图1是归一化后450nm荧光强度与酶活性标准曲线；
图2是归一化后450nm荧光寿命与酶活性标准曲线；
图3是实施例一的荧光光谱图；
图4是无离子、Ca2+离子和Zn2+离子状态下的荧光衰减图；
图5是应用实施例一的荧光光谱图；
图6是应用实施例二的荧光光谱图；
图7是以荧光强度和荧光寿命两种方法获得的磷脂酶A2活性的对比图。
具体实施方式
以下结合实施例对本实用新型做详细的说明，实施例旨在解释而非限定本实用新型的技术方案。
实施例1标准曲线的绘制
将精确称取计算好重量的卵磷脂、胆固醇以3:1的质量比混合溶于氯仿-甲醇的混合溶液 (所述氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后用旋转蒸发仪在40℃恒温水浴中旋转蒸发。等溶剂完全蒸发后，取出并放入真空干燥器中抽真空，以尽可能的使溶剂蒸发干净。接着，加入 10mL含有浓度为4μmol/L的1-萘酚的Tris-HCl缓冲液，使总脂浓度达3％，得到淡黄色溶液。搅拌使膜脱落，并60℃孵化1小时，使囊泡结构优化，并保证探针分子平衡分布于水相与囊泡中。然后，待其稳定后测其光谱，测定稳态光谱时分别将样品放入装有小磁子的比色皿中，放入样品池，打开搅拌。设定激发波长290nm，扫描范围为300nm～550nm，狭缝宽度为2，积分时间0.1s，得到其稳态光谱。然后使用微量注射器迅速滴入一定量的磷脂酶 A2溶液。在第5min、10min、20min、30min以及40min进行重复扫描，获得如图3所示的荧光光谱图。对其数据在360nm处进行归一化，得到450nm处的荧光强度值。取第5min时间段测定其在450nm处的衰减曲线并获得如图4所示的荧光衰减图，其中，空白组即为本实施例的荧光衰减图，得到其寿命值。
将上述标准样品中加入酚红使其浓度达到12mmol/L，进行紫外同样检测，酚红将与磷脂酶A2催化卵磷脂水解产生的自由脂肪酸与酚红作用，可用紫外可见分光光度计来检测，在559nm处产生最大吸收峰。得到其在0min、5min、10min、20min、30min以及40min酶催化反应处的紫外吸光光度值。使用空白囊泡溶液作为比照，加入一定浓度自由脂肪酸，使其吸光度分别达到上述5min、10min、20min、30min以及40min的值。
使用加入的自由脂肪酸的量作为酶催化反应产物的量，计算相应酶活度绘制获得如图 1和图2所示的标准曲线。稳态光谱图的相对荧光强度值与寿命均取第5min作为酶活性检测点。
应用实施例一
将精确称取计算好重量的卵磷脂、胆固醇以3:1的质量比混合溶于氯仿-甲醇的混合溶液 (所述氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后用旋转蒸发仪在40℃恒温水浴中旋转蒸发。等溶剂完全蒸发后，取出并放入真空干燥器中抽真空，以尽可能的使溶剂蒸发干净。接着，加入 10mL含有浓度为4μmol/L的1-萘酚的Tris-HCl缓冲液，使总脂浓度达3％，得到淡黄色溶液。搅拌使膜脱落，并60℃孵化1小时，使囊泡结构优化，并保证探针分子平衡分布于水相与囊泡中。然后，加入Ca2+离子并使Ca2+离子在溶液中的浓度为1mmol/L，充分搅拌。待稳定后测其光谱，测定稳态光谱时分别将样品放入装有小磁子的比色皿中，放入样品池，打开搅拌。设定激发波长290nm，扫描范围为300nm～550nm，狭缝宽度为2，积分时间 0.1s，得到其稳态光谱。然后使用微量注射器迅速滴入一定量的磷脂酶A2溶液。在第 5min、10min、20min、30min以及40min进行重复扫描，获得如图5所示的荧光光谱图。对其数据在360nm处进行归一化，得到450nm处的荧光强度值。取第5min时间段测定其在 450nm处的衰减曲线并获得如图4所示的荧光衰减图，其中，Ca2+组即为本实施例的荧光衰减图，得到其寿命值。
将荧光强度于寿命值分别对照标准曲线1、2，即可得到酶催化反应活度。
应用实施例二
将精确称取计算好重量的卵磷脂、胆固醇以3:1的质量比混合溶于氯仿-甲醇的混合溶液 (所述氯仿与甲醇的体积比为2:1)，然后用旋转蒸发仪在40℃恒温水浴中旋转蒸发。等溶剂完全蒸发后，取出并放入真空干燥器中抽真空，以尽可能的使溶剂蒸发干净。接着，加入 10mL含有浓度为4μmol/L的1-萘酚的Tris-HCl缓冲液，使总脂浓度达3％，得到淡黄色溶液。搅拌使膜脱落，并60℃孵化1小时，使囊泡结构优化，并保证探针分子平衡分布于水相与囊泡中。然后，加入Zn2+离子并使Zn2+离子在溶液中的浓度为1mmol/L，充分搅拌。待稳定后测其光谱，测定稳态光谱时分别将样品放入装有小磁子的比色皿中，放入样品池，打开搅拌。设定激发波长290nm，扫描范围为300nm～550nm，狭缝宽度为2，积分时间 0.1s，得到其稳态光谱。然后使用微量注射器迅速滴入一定量的磷脂酶A2溶液。在第 5min、10min、20min、30min以及40min进行重复扫描，获得如图6所示的荧光光谱图。对其数据在360nm处进行归一化，得到450nm处的荧光强度值。取第5min时间段测定其在 450nm处的衰减曲线并获得如图4所示的荧光衰减图，其中，Zn2+组即为本实施例的荧光衰减图，得到其寿命值。
将荧光强度于寿命值分别对照标准曲线1、2，即可得到酶催化反应活度。
为了比较上述三个实施例中以荧光强度和荧光寿命两种方法获得的磷脂酶A2活性的相关性，申请人对以两种方法获得的磷脂酶A2活性进行了对比，并获得了如图7所示的对比图。由图7可以看出，两种方法获得的磷脂酶A2活性基本相同，从而说明本发明中以荧光强度和荧光寿命两种方法均可以获得准确的磷脂酶A2活性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改变、改进和润饰，这些改变、改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种检测磷脂酶A2活性的囊泡，其特征在于，所述囊泡具有由卵磷脂和胆固醇分子构成的双分子层，在所述双分子层中包封有荧光探针分子，其中，所述荧光探针为1-萘酚。
2.如权利要求1所述的囊泡，其特征在于，所述卵磷脂、胆固醇的质量比为3:1。
3.权利要求1所述的囊泡的制备方法，其特征在于，所述方法是将卵磷脂、胆固醇按质量比溶解于氯仿-甲醇的混合液中，40℃恒温旋转蒸发，使溶剂完全蒸发；然后加入溶解有1-萘酚的Tris-HCl缓冲液，使总脂浓度为3％，然后搅拌使膜脱落，60℃孵化0.5～1.5小时。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述卵磷脂、胆固醇的质量比为3:1，所述氯仿-甲醇的混合液中，氯仿、甲醇的体积比为2:1。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述Tris-HCl缓冲液中1-萘酚的浓度为4μmol/L。
6.一种检测磷脂酶A2活性的方法，其特征在于，所述方法是将待测样品滴加入如权利要求1所述的囊泡的溶液中，将其荧光光谱在360nm处归一化，获得450nm处荧光强度或荧光寿命，在归一化后450nm荧光强度与磷脂酶A2活性标准曲线或者450nm荧光寿命与磷脂酶A2活性标准曲线中读取相应的酶活性度数即可。
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