CN105087763A - 实时荧光pcr和探针法融解曲线结合的多重核酸检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及多重核酸检测探针以及检测方法，具体涉及一种实时荧光PCR和探针法融解曲线技术相结合的多重核酸检测探针和检测方法。本发明还涉及所述探针或方法用于多重核酸检测的用途。本发明在基于实时荧光PCR技术的反应体系中增加了根据融解曲线反应程序设计的探针，并提供了相应检测方法，其在同一反应体系内可检测的样本数可达到基于实时荧光PCR技术可检测的样本数的两倍。

Description

实时荧光PCR和探针法融解曲线结合的多重核酸检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及多重核酸检测探针和检测方法，具体涉及一种实时荧光PCR和探针法融解曲线技术相结合的多重核酸检测探针和检测方法。本发明还涉及所述探针或方法用于多重核酸检测的用途。

背景技术

自实时荧光定量PCR(Real-timePCR)技术发明以来，该技术通过实时监测杂交探针释放的荧光信号，能够定性或者定量检测样本中的核酸。由于其具备灵敏度高、特异性强、污染少等特点，在核酸检测领域得到了广泛的应用。

融解曲线(meltingcurve)技术主要运用染料法或者探针法对PCR终产物进行定性检测或者分析。其中，染料法主要通过在PCR终产物中加入饱和或者半饱和染料，该染料能和产物的双链DNA结合并发光，根据产物Tm值不同形成不同的融解峰。探针法融解曲线主要利用荧光标记的探针和PCR终产物进行杂交，探针和产物杂交时会释放荧光信号；不同荧光基团标记的探针代表不同的检测项，并且也以探针和产物杂交时的Tm值对应的融解峰判断阴阳性；探针法融解曲线技术可用于核酸定性检测，主要应用核酸突变方面的检测，因为探针的Tm值会随不同的碱基突变而有所变化，形成不同融解峰，这样就可以根据融解峰的Tm值的不同具体判断突位点。

多重荧光PCR技术是指利用实时荧光定量PCR技术、在同一反应体系内用多对引物及探针扩增一种或多种不同扩增子的检测方法。由于其具备灵敏度高、特异性强、污染少、快捷及节约成本等优点，已成为目前该领域的主要研究及应用热点。但本技术受到检测设备通道数目限制，目前的多重荧光定量PCR仪检测样本数至多为四个或五个。如果能实现在现有设备通道基础上扩大检测样本数目，那么将能够进一步节约时间、降低成本、提高效率和扩大应用范围。

发明内容

本发明通过将实时荧光PCR和探针法融解曲线技术相结合，实现了核酸的实时检测分析和终点分析相结合，使在同一反应体系内可检测的样本数能够达到基于实时荧光PCR技术可检测的样本数的两倍，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及基于探针法融解曲线技术进行多重核酸检测的探针，其特征在于该探针不能被DNA聚合酶水解，并且该探针与核酸结合的退火温度比同一反应体系中实时荧光PCR的探针与核酸结合的退火温度低3-20℃。

根据本发明第一方面任一项的探针，其中所述核酸为DNA或RNA。

根据本发明第一方面任一项的探针，其中所述DNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性。

根据本发明第一方面任一项的探针，其5’端的五碳糖、碱基或者报告荧光基团被基团修饰，所述基团例如为氨基、硫基、甲基或生物素等。

根据本发明第一方面任一项的探针，所述探针与核酸结合的退火温度比同一反应体系中荧光PCR探针与核酸结合的退火温度低5-15℃。

在本发明的实施方案中，所述探针与核酸结合的退火温度比同一反应体系中实时荧光探针与核酸结合的退火温度低12℃。

在本发明中，降低探针与核酸结合的退火温度的方法为本领域所公知，例如，缩短探针的长度、改变核酸的碱基组成或者引入突变位点。

在本发明中，通过引入突变位点降低探针与核酸结合的退火温度的方法为本领域所公知，例如正常引入一个A/T的突变，Tm值变化在2℃左右，引入一个G/C的突变，Tm值变化在4℃左右。

根据本发明第一方面任一项的探针，所述探针的长度为10-40bp，例如为16-21bp。

在本发明的实施方案中，所述融解曲线探针的长度为20bp。

本发明第二方面涉及基于探针法融解曲线技术进行多重核酸检测的反应体系，其包含本发明第一方面任一项的探针。

根据本发明第二方面任一项的反应体系，其中所述的探针个数与该检测设备的检测通道个数相匹配，例如当检测通道为4个时，则探针可以为1-4个，当检测通道为5个时，探针可以为1-5个。

根据本发明第二方面任一项的反应体系，其还包含相应的待测样本、引物等。

本发明第三方面涉及多重PCR反应体系，其包括基于实时荧光PCR技术的反应体系以及本发明第二方面任一项的基于探针法融解曲线技术进行多重核酸检测的反应体系。

在本发明中，基于实时荧光PCR技术的反应体系为本领域所公知。

在本发明的实施方案中，所述实时荧光PCR技术为实时荧光PCR探针技术，例如为Taqman探针实时荧光PCR。

本发明第四方面涉及基于实时荧光PCR和探针法融解曲线技术相结合的多重核酸检测方法，所述检测方法包括使用本发明第一方面任一项的探针、第二或第三方面任一项的反应体系的步骤。

根据本发明第四方面任一项的检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)在基于实时荧光PCR的基本反应体系中，另外加入一种或多种待测核酸样本，以及与该待测核酸样本对应的一个或多个本发明第一方面任一项的探针；

(2)同时设定实时荧光PCR反应程序，以及探针法融解曲线反应程序，所述融解曲线反应程序的起始温度与本发明第一方面任一项的探针的退火温度相比，低3-20℃，例如低5-15℃；

(3)待反应程序结束后，对得到的基于实时荧光PCR技术的扩增曲线和基于探针法融解曲线技术的融解曲线进行分析。

根据本发明第四方面任一项的检测方法，其中所述实时荧光PCR技术为实时荧光PCR探针技术，例如为Taqman探针实时荧光PCR。

根据本发明第四方面任一项的检测方法，其中步骤(1)中所述的另外加入的核酸样本数或本发明第一方面任一项的探针的个数最多与同一反应体系中基于实时荧光PCR技术可检测的样本数或探针数相同。

根据本发明第四方面任一项的检测方法，其中步骤(1)的基本反应体系中还含有引物、实时荧光PCR探针及其它实时荧光PCR或探针法融解曲线技术所必需的成分。

根据本发明第四方面任一项的检测方法，其中步骤(1)中的本发明第一方面任一项的探针还连接有报告荧光基团，当该探针的数目为多个(例如为2、3、4、5个)时，这些探针之间的报告荧光基团不同。

根据本发明第四方面任一项的检测方法，其中所述的融解反应程序为：从比本发明第一方面任一项的探针与核酸的退火温度低5-15℃开始(即起始温度)，逐渐升温至90-99℃，每秒钟升温0.1℃左右。

在本发明的实施方案中，所述融解曲线反应程序中的起始温度与的探针的退火温度相比低7℃左右。

在本发明的实施方案中，所述融解反应程序为40℃(即起始温度)升温到95℃，每秒钟升温0.1℃，全程收集荧光信号。

根据本发明第四方面任一项的检测方法，其中所述核酸为DNA或RNA。

根据本发明第四方面任一项的检测方法，该方法可用于检测2-10种核酸类型。

在本发明的实施方案中，基于实时荧光PCR技术和探针法融解曲线技术检测的核酸类型个数各为一个。

本发明第五方面涉及本发明第一方面任一项的探针、第二或第三方面的反应体系或第四方面任一项的检测方法用于检测核酸的用途。

根据本发明第五方面任一项的用途，其中所述的核酸为DNA或RNA。

在本发明的实施方案中，所述检测核酸是指定性检测核酸。

在本发明的实施方案中，所述检测核酸是指用于检测多重核酸，例如为检测2-10种核酸类型。

在本发明中，所述实时荧光探针技术属于实时荧光定量PCR的一种，实时荧光PCR探针(例如Taqman)是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。当完整的探针未与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。实时荧光PCR探针适合于各种耐热的聚合酶，如DyNAzymeTMⅡDNA聚合酶等。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累，因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。在本发明中，所述基于实时荧光PCR技术的反应体系即是指基于上述技术的反应体系，也称为扩增反应体系、扩增曲线反应体系或者扩增曲线技术。

在本发明中，所述多重实时PCR是指在同一个反应中实现两个或更多核酸序列的扩增和特异性检测的实时PCR，其可用于生成定性或定量的结果。

在本发明中，与单一实时PCR相比，在进行多重实时PCR时的反应体系或需要注意的问题等为本领域所公知。

在本发明中，所述扩增曲线是指在实时荧光PCR过程中随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团信号不断积累所形成的S型曲线。

在本发明中，所述融解曲线(也有称为熔解曲线或溶解曲线)是在融解曲线反应程序中，在逐渐增加温度的同时监测荧光信号的变化，经计算机自动形成以荧光信号强度的负导数为纵坐标，温度为横坐标的所形成的曲线。当有待测核酸产物存在时，会在融解曲线探针的Tm处产生融解峰，而无待测核酸产物存在时，则不存在该融解峰。

在本发明中，所述实时荧光PCR技术或基于实时荧光PCR技术的反应体系均为本领域所公知，例如该反应体系中包括模板、引物、探针、dNTP、DNA聚合酶、缓冲液、Mg²⁺或Mn²⁺等，这些组分的选择、浓度的设定以及反应程序等均为本领域所公知。

在本发明中，所述DNA聚合酶通常为耐高温热启动DNA聚合酶，其具有5’-3’外切酶活性。

在本发明中，基于传统的实时荧光PCR技术的反应体系，同时利用探针法融解曲线技术对核酸进行多重定量或定性检测。在本发明的具体实施方案中，在实时荧光PCR反应体系中，同时加入适于融解曲线检测的探针、引物，并设置相应的融解曲线反应程序，实现了实时荧光PCR技术和融解曲线技术的同步检测。

在本发明中，所述Tm值或退火温度可以在实验前通过软件例如DNAMAN、Primer5.0等计算得到。

在本发明中，所述Tm值和退火温度之间的关系为本领域所公知，例如退火温度通常比Tm值低5℃。

在本发明中，如果未特别说明，所述探针均连接有报告荧光基团。

在本发明中，所述融解曲线反应体系中探针的报告荧光基团与基于实时荧光PCR技术的报告荧光基团相同或不同，例如为FAM、ROX、VIC/HEX、CY3、CY5。在本发明的实施方案中，融解曲线反应体系中的荧光基团可以与扩增曲线反应体系中的荧光基团相同，但融解曲线反应体系的不同探针之间的荧光基团应该不同。

在本发明中，所述核酸为DNA或RNA。在本发明的实施方案中，所述核酸为微生物的核酸，例如为细菌、真菌、病毒或支原体的核酸。在本发明的具体实施方案中，所述微生物为人丙肝病毒和人免疫缺陷病毒。

在本发明中，根据实时荧光PCR技术的扩增曲线判断核酸检测结果的方法为本领域所公知。

在本发明中，根据融解曲线判断核酸检测结果的依据为有无融解峰。不同荧光通道代表不同的检测项，阳性在其对应的Tm值处会有融解峰，阴性则无融解峰。

本发明通过将实时荧光PCR和探针法融解曲线技术相结合，实现了核酸实时检测分析和终点分析的结合，使每一种技术均有多个通道可选择，每一技术都有各自的判定方法，且两种技术间、不同通道间彼此不相互干扰，同样具备实时荧光探针法的灵敏度及特异性，其可检测的样本数量最高可达到基于实时荧光PCR技术的两倍，从而可实现高通量、高灵敏度及高特异性的多重PCR检测。

在本发明的实施方案中，用不同的荧光基团代表不同检测项，用融解峰的有无判断阴阳性，可更好的防止假阳性的出现。

附图说明

图1HCV单重实时荧光扩增曲线(上)及融解曲线(下)结果

图2HIV单重实时荧光扩增曲线(上)及融解曲线(下)结果

图3HIV单重融解曲线探针扩增曲线(上)及融解曲线(下)结果

图4同时含有HCV实时荧光探针(上)及HIV融解曲线探针(下)扩增结果

图5三种不同体系的HIV融解曲线特异性

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

实验流程：

1.1：引物及探针的设计

针对HCV的5’端和HIV的Gag保守区设计了HCV和HIV引物及探针，并将HIV的实时荧光探针改造为融解曲线探针。两种探针都为FAM标记。其中HIV的融解曲线探针的5’端做氨基修饰，即以磷酸二酯键的方式和FAM的荧光基团相连接(宝生物工程(大连)有限公司)。引物及探针的序列见表1。

表1各引物及探针序列

注：HCV基因序列号：M67463，HIV的基因序列号：NC-001802

1.2：模板的提取及稀释：按照核酸提取试剂盒(北京金麦格生物技术有限公司，试剂目录号为NA007-2)说明书、提取已知浓度的HCV阳性、HIV阳性和HCV与HIV混合阳性样本及临床阴性血浆(样本由厦门大学提供)的RNA，将提取的阳性样本依次梯度稀释到1.0×10³IU/ml简(称E3)、1.0×10²IU/ml(简称E2)、1.0×10¹IU/ml(简称E1)。

1.3：体系的配制：按照引物及探针浓度分别配制如下4种体系：

(1)HCV实时荧光单重体系：50μl扩增体系内含有dNTP终浓度为10mM；rTth酶(东洋纺(上海)生物科技有限公司货号Tth-329)使用量为2.5U；Mn(AcO)₂终浓度为2.5mM；模板20μl；HCV-F终浓度为0.7μM，HCV-R终浓度为0.7μM,HCV-P终浓度为0.2μM；

(2)HIV实时荧光单重体系：50μl扩增体系内含有dNTP终浓度为10mM；rTth酶(东洋纺(上海)生物科技有限公司货号Tth-329)使用量为2.5U；Mn(AcO)₂终浓度为2.5mM；模板20μl；HIV-F终浓度为0.7μM，HIV-R终浓度为0.7Μm,HIV-P终浓度为0.2μM；

(3)HIV融解曲线单重体系：50μl扩增体系内含有dNTP终浓度为10mM；rTth酶(东洋纺(上海)生物科技有限公司货号Tth-329)使用量为2.5U；Mn(AcO)₂终浓度为2.5mM；模板20μl；HIV-F终浓度为0.7μM，HIV-R终浓度为0.14μM,HIV-Melt-P终浓度为0.4μM；

(4)同时含有HCV实时荧光及HIV融解曲线的二重体系：50μl扩增体系内含有dNTP终浓度为10mM；rTth酶(东洋纺(上海)生物科技有限公司货号Tth-329)使用量为2.5U；Mn(AcO)₂终浓度为2.5mM；模板20μl；HCV-F终浓度为0.7μM，HCV-R终浓度为0.7μM,HCV-P终浓度为0.2μM，HIV-F终浓度为0.7μM，HIV-R终浓度为0.14Μm,HIV-P终浓度为0.4μM。

1.4：模板扩增

分别用HCV实时荧光单重体系、HIV实时荧光单重体系、HIV融解曲线单重体系及同时含有HIV融解曲线和HCV实时荧光的二重体系扩增各自对应的梯度模板E3、E2、E1及阴性模板，每个做2个重复，在BIO-RADCFX-96荧光定量PCR仪上扩增。扩增程序包括2个部分，分别为1：荧光实时扩增程序，95℃,1min；61℃，20min；95℃，15s，64℃,30s，5个循环(该5个循环，每个循环降1℃)，；95℃，15s，62℃,30s，40循环，其中在62℃处收集荧光信号；2：融解曲线程序，40℃升温到95℃，每秒钟升温0.1℃，全程收集荧光信号。

实验结果：

具体实验结果请参见图1-图5。

从图1可以看出，HCV单重实时荧光PCR利用扩增曲线可检测到E1、E2、E3，而融解曲线没有对应的融解峰；

从图2可以看出，HIV单重实时荧光PCR利用扩增曲线可检测到E1、E2、E3，其中E1仅检测出一个浓度，而融解曲线没有对应的融解峰；

从图3可以看出，HIV单重融解曲线程序能够检测到E1、E2、E3的融解峰，其中E1仅检测出一个浓度，而没有对应的扩增曲线；

从图4可以看出，在同一体系中同时含有HCV实时荧光探针和HIV融解曲线探针，能够分别检测到HCV的E1、E2、E3和HIV的E1、E2、E3；

图5为三个反应体系在检测临床阴性样本时的融解曲线图，可以看出荧光强度依次降低，但都无融解曲线峰。

干扰性能结果分析：

(1)从实验结果图1和图2可以看出，HCV实时荧光单重体系和HIV实时荧光单重体系只有扩增曲线，无融解曲线；从实验结果图3可以看出，HIV融解曲线单重体系只有融解曲线，无扩增曲线。

(2)从实验结果图4可以看出，在同时含有HCV实时荧光探针及HIV融解曲线探针体系内，既有扩增曲线，又有融解曲线。扩增曲线代表HCV、融解曲线代表HIV。

综合以上两点表明，在同一反应体系内同时含有实时荧光探针及融解曲线探针的情况下，二者之间不相互干扰。

灵敏度结果分析

(1)从实验结果图1和图4中可以看出，通过比较HCV单重实时荧光探针扩增体系和同时含有HCV实时荧光探针及HIV融解曲线探针的体系，HCV的检测灵敏度都能稳定检测出E3、E2和E1三个浓度。说明在多重PCR体系中，在含有融解曲线探针的情况下，不影响正常实时荧光探针的灵敏度。

(2)从实验结果图2、图3、图4中可以可以看出，通过比较HIV单重实时荧光探针扩增体系和同时含有HCV实时荧光探针及HIV融解曲线探针的体系,HIV的检测灵敏度一致，能稳定检测出E3和E2二个浓度，但E1浓度都各自检测出1个。说明在多重PCR体系中，在含有实时荧光探针的情况下，不影响融解曲线的的灵敏度。

特异性能分析

从实验结果图5中可以看出，HIV实时荧光单重体系、同时含有HCV实时荧光探针及HIV融解曲线探针二重体系和HIV融解曲线单重体系在检测阴性样本时荧光强度依次降低，但都无融解曲线峰，可以明显的作为背景，判为阴性。这表明该探针融解曲线法具有良好的特异性性能。

结论：

本发明建立了实时荧光PCR技术和融解曲线联合分析方法，能在同一反应体系内既有扩增曲线又有融解曲线，且二者间不相互干扰，同时具有与实时荧光PCR法一样的灵敏度及特异性。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (14)

1.基于探针法融解曲线技术进行多重核酸检测的探针，其特征在于，该探针不能被DNA聚合酶水解，并且该探针与核酸结合的退火温度比同一反应体系中实时荧光探针与核酸结合的退火温度低3-20℃。

2.权利要求1的探针，其中所述DNA聚合酶具有5’-3’外切酶活性。

3.权利要求1的探针，其5’端的五碳糖、碱基或者报告荧光基团被基团修饰，所述基团例如为氨基、甲基、硫基、生物素等。

4.权利要求1的探针，所述探针与核酸结合的退火温度比同一反应体系中实时荧光PCR中探针与核酸结合的退火温度低5-15℃。

5.权利要求1-4任一项的探针，所述探针的长度为10-40bp，例如为16-21bp。

6.基于探针法融解曲线技术进行多重核酸检测的反应体系，其包含权利要求1-5任一项的探针。

7.一种多重PCR反应体系，其包括基于实时荧光PCR技术的反应体系以及权利要求6的基于探针法融解曲线技术进行多重核酸检测的反应体系。

8.基于实时荧光PCR和探针法融解曲线技术相结合的多重核酸检测方法，所述检测方法包括使用权利要求1-5任一项的探针、权利要求6或7的反应体系的步骤。

9.权利要求8的检测方法，所述方法包括以下步骤：

(1)在基于实时荧光PCR的基本反应体系中，另外加入一种或多种待测核酸样本，以及与该待测核酸样本对应的一个或多个权利要求1-5任一项的探针；

(2)同时设定实时荧光PCR反应程序以及探针法融解曲线反应程序，所述融解曲线反应程序的起始温度与权利要求1-5的探针的退火温度相比，低3-20℃，例如低5-15℃；

(3)反应程序结束后，对得到的基于实时荧光PCR技术的扩增曲线和基于探针法融解曲线技术的融解曲线进行分析。

10.权利要求9的检测方法，其中步骤(1)中所述的另外加入的核酸样本数或权利要求1-5的探针的个数最多与同一反应体系中基于实时荧光PCR技术可检测的样本或探针数相同。

11.权利要求9的检测方法，其中步骤(1)中的权利要求1-5任一项的探针还连接有报告荧光基团，当该探针的数目为多个(例如为2、3、4、5个)时，这些探针之间的报告荧光基团不同。

12.权利要求9的检测方法，其中步骤(1)中还加入与另外加入的核酸样本相适应的扩增引物。

13.权利要求9的检测方法，其中所述的融解反应程序为，从比权利要求1-5任一项的探针与核酸的退火温度低5-15℃开始，例如从40℃开始，逐渐升温至90-99℃，每秒钟升温0.1℃左右。

14.权利要求1-5任一项的探针、权利要求6或7的反应体系或权利要求8-13任一项的检测方法用于检测核酸的用途。