CN105087737A - 一种利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法与应用。本发明通过将菊芋的块茎和茎叶干燥、粉碎、过筛,得到菊芋粉;将水和菊芋粉混合均匀,于80~90℃下浸提后离心,得到菊芋提取液;将菊芋粉或菊芋提取液作为培养基碳源,加入氮源配制成发酵培养基;将红发夫酵母种子液接入灭菌后的发酵培养基,进行发酵,收集菌体,对菌体进行干燥、破壁、提取、浓缩,得到虾青素。该方法的发酵培养基主要成分为菊芋,成本低,且得到的虾青素产量高。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域,特别涉及一种利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法与应用。
背景技术
虾青素是一种红色的酮式类胡萝卜素,是甲壳类动物鲑鱼和各种鸟类的主要色素,分子结构中含有非常长的共轭双键和α-羟基酮,由于此种特殊结构能够向自由基供应电子,从而使其极易和自由基反应,清除自由基,具有极强的生物抗氧化性,在食品,医药,化妆品及水产业等方面有着广阔的应用前景。目前,生产利用酵母发酵生产虾青素的常用底物是碳水化合物,最主要的是葡萄糖,另外还有木糖、果糖、蔗糖等,而使用葡萄糖又存在价格较高且与人争粮、与粮争地等问题,使虾青素的生产无法达到工业化的要求,因此寻找一种廉价的可再生的原料来发酵生产虾青素,降低生产成本,已成为目前函待解决的问题。
菊芋粉,又名菊糖,由呋喃构型的D-果糖经β-(2,1)糖苷键脱水聚合而成的链状果聚糖混合物,其还原端接一个葡萄糖基,聚合度一般在2~60。在自然界中大约有36000种植物含有丰富的菊芋粉,其中菊芋作为一种富含菊糖的可再生资源,广泛分布于在我国各地。菊糖是大分子糖类,可以通过菊芋粉酶或者酸水解成小分子的低聚果糖、蔗糖、果糖和葡萄糖,供微生物利用来生产高附加值产物。自然界中也存在一些生物能够直接转化菊糖来得到产物。蔗糖、葡萄糖和果糖是生产虾青素的优质碳源,因此直接以价廉的富含果糖聚合物的菊芋为原料,在降低原料成本上具有非常大的优势。另外菊芋中还含有一定数量的蛋白质、脂肪、维生素、淀粉、尼克酸、粗纤维、硒、铁、钙等各种营养成分,这些成分的存在很可能对发酵生产虾青素起到促进作用。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法。
本发明的另一目的在于提供所述利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:一种利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法,包括如下步骤:
(1)原料准备:将菊芋的块茎和茎叶干燥、粉碎、过筛,得到菊芋粉;
(2)菊芋提取液的提取:将水和菊芋粉混合均匀,于80~90℃下浸提,得到菊芋浆;将菊芋浆离心,得到菊芋提取液;
(3)发酵培养基的制备:将步骤(1)得到的菊芋粉或步骤(2)得到的菊芋提取液作为培养基碳源,加入氮源配制成发酵培养基,灭菌;
(4)种子液的制备及发酵:将红发夫酵母种子液接入步骤(3)得到的灭菌发酵培养基,进行发酵;
(5)虾青素的提取:收集菌体,对菌体进行干燥、破壁、提取、浓缩,得到虾青素。
步骤(1)中所述的筛为40~200目筛。
步骤(2)中所述的水的体积用量(mL)优选为相当于所述菊芋粉质量(g)的10~20倍。
所述的水为去离子水。
步骤(2)中所述的浸提的温度优选为85℃。
步骤(2)中所述的浸提的时间优选为至少1小时,更优选为90~120min,最优选为110min。
步骤(2)中所述的离心的条件优选为30℃、4000rpm离心10分钟。
步骤(3)中所述的氮源为有机氮源和无机氮源中的一种或两种。
所述的有机氮源优选为蛋白胨和酵母粉。
所述的无机氮源优选为硫酸铵、氯化铵、醋酸钠和硝酸铵中的至少一种。
步骤(3)中所述的发酵培养基的组成优选如下:含总糖浓度为20~30g/L的菊芋提取液或菊芋粉、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠0.1g/L、硫酸镁0.5g/L、酵母粉0.2g/L、氯化钙0.1g/L;或是含总糖浓度为20~30g/L的菊芋提取液或菊芋粉、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L。
步骤(3)中所述的灭菌的条件优选为115~130℃下灭菌20~40分钟。
步骤(4)中所述的红发夫酵母优选为红发夫酵母为As2.1557菌株或ATCC66270菌株。
所述的ATCC66270菌株优选为通过驯化后再用于发酵。
所述的驯化为将所述ATCC66270菌株置于含菊芋成分的培养基中培养。
步骤(4)中所述的红发夫酵母的接种量为发酵培养基体积的5~10%,优选为体积百分比8~10%。
步骤(4)中所述的发酵的条件为红发夫酵母常用的发酵条件,优选为在20~25℃下于摇瓶或生物反应器下培养72~300小时;更优选为在22℃下发酵。
所述的摇瓶的培养条件优选为转速150~220rpm。
所述的生物反应器的培养条件优选为溶解氧浓度控制在10~80%,优选20~50%。
步骤(4)中所述的发酵的方式为分批发酵、连续发酵和流加发酵中的一种。
步骤(5)中所述的菌体的收集可通过离心或过滤方法实现。
步骤(5)中所述的菌体的破壁可采用酸热法、高压均质或者酶法破壁。
步骤(5)中所述的提取为通过有机溶剂对破壁菌体进行提取虾青素。
所述的有机溶剂优选为食用乙醇。
所述的浓缩的方法优选为真空浓缩。
所述利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法可应用于工业化生成虾青素。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
(1)菊芋作为可再生资源,具有来源广,廉价等优点。
(2)发酵培养基非常简单,只有菊芋粉或者菊芋提取液和无机氮源或者有机氮源,如酵母粉、蛋白胨、氯化铵等。
(3)无需添加任何酶或者采用酸或碱水解菊糖,就可以实现直接发酵菊芋原料生产虾青素,而且其菌体量以及虾青素的产量明显高于葡萄糖底物。这可能是菊芋中的某些成分对发酵生产虾青素起到促进作用。
(4)通过连续补料发酵,延长红发夫酵母的对数期,大大提高红发夫酵母菌体的积累以及虾青素的产量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1:利用菊芋提取液摇瓶发酵生产虾青素的方法
(1)红发夫酵母种子液的制备:将一环红发夫酵母为As2.1557菌苔(于22℃培养3~4天得到的斜面种)接种于装有25mL种子培养基的250mL三角瓶,22℃、220rpm培养36小时。其中种子液培养基采用YPD培养基,培养基主要成份为葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L,溶剂为去离子水。
(2)发酵培养基的制备:其中含总糖浓度为20g/L的菊芋提取液、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L,于115℃下灭菌20分钟。菊芋提取液的制备步骤如下:将菊芋的块茎和茎叶干燥、粉碎、过200目筛,得到菊芋粉;将得到的菊芋粉与去离子水按固液比1:10(g/mL)混合,调制成菊芋浆,在85℃下浸提110分钟,将菊芋浆趁热于30℃,4000rpm离心10分钟,得到菊芋提取液,通过硫酸蒽酮法测定总糖浓度,约为75~80g/L。
(3)利用菊芋提取液发酵生产虾青素:将步骤(1)制备好的种子液以10%(v/v)的接种量接入步骤(2)得到的的发酵培养基中,好氧发酵,培养温度为22℃,摇床转速为220rpm,发酵120小时后终止。通过分光光度计法测定类胡萝卜素量,测得类胡萝卜素产量为4.5mg/L;通过干重法测得酵母生物量为12.3g/L。
实施例2:利用菊芋提取液摇瓶发酵生产虾青素的方法
(1)红发夫酵母种子液的制备:
①驯化:将一环红发夫酵母为ATCC66270菌苔(于22℃培养3~4天得到的斜面种)接种于装有5mL种子培养基的试管中,22℃、220rpm培养36小时,转接0.5mL至装有5mL种子培养基的试管中,22℃、220rpm培养36小时,连续转接10次;
②种子液的制备:最后取2.5mL接种于装有25mL种子培养基的250mL三角瓶,22℃、220rpm培养36小时,作为种子液。
其中种子液培养基采用菊粉培养基,培养基主要成份为总糖浓度为20g/L的菊芋提取液、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠0.1g/L、硫酸镁0.5g/L、酵母粉0.2g/L、氯化钙0.1g/L,于115℃下灭菌20分钟。菊芋提取液的制备同实施例1步骤(2)。
(2)发酵培养基的制备:总糖浓度为20g/L的菊芋提取液、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠0.1g/L、硫酸镁0.5g/L、酵母粉0.2g/L、氯化钙0.1g/L,于115℃下灭菌20分钟。菊芋提取液的制备同实施例1步骤(2)。
(3)利用菊芋提取液发酵生产虾青素:将制备好的种子液以10%(v/v)的接种量接入上述发酵培养基中,培养温度为22℃,摇床转速为220rpm,发酵120小时后终止。色素产量为45.45mg/L;酵母生物量为5.16g/L。
实施例3:利用菊芋提取液反应器分批发酵生产虾青素的方法
(1)红发夫酵母(ATCC66270)种子液的制备同实施例2。
(2)发酵培养基的制备:含总糖浓度为30g/L的菊芋提取液,8.6g/L蛋白胨,3.0g/L磷酸二氢钾,0.5g/L磷酸氢二钠,0.5g/L硫酸镁,溶质为去离子水。
(3)利用菊芋提取液发酵生产虾青素的反应器培养在3L(NewBrunswick,Scientific,BiofLo300,USA)生物反应器中进行的,装液量1000mL。接种量10%,培养温度为22℃,溶氧控制在30%以上,pH=5.0,发酵120小时后终止。色素产量为101.78mg/L;酵母生物量为12.26g/L。
实施例4:利用菊芋提取液反应器恒速流加发酵生产虾青素的方法
(1)红发夫酵母(ATCC66270)种子液的制备同实施例2。
(2)发酵培养基的制备同实施例3。
(3)流加培养基的制备:含总糖浓度为80g/L的菊芋提取液。
(4)流加方式:分批发酵进行至残糖浓度低于10g/L,约43小时,开始流加以按总糖量计为2.4克/小时流加菊芋提取液,一定时间后停止流加菊芋提取液,共约40小时,继续发酵生产虾青素。
(5)利用菊芋提取液发酵生产虾青素的反应器培养在3L(NewBrunswick,Scientific,BiofLo300,USA)生物反应器中进行的,装液量1000mL。接种量10%,培养温度为22℃,溶氧控制在30%以上,pH=5.0,发酵180小时终止。色素产量为179mg/L;通过干重法测得酵母生物量为22.26g/L。
实施例5:利用菊芋提取液反应器糖反馈变速流加发酵生产虾青素的方法
(1)红发夫酵母(ATCC66270)种子液的制备同实施例2。
(2)发酵培养基的制备同实施例3。
(3)流加培养基的制备:总糖浓度为400g/L菊芋提取液,100g/L氯化铵,于115℃下灭菌20分钟。
(4)流加方式:分批发酵进行至残糖浓度低于10g/L,约43小时,开始流加以1克/小时流加糖液,每隔一定时间测定残糖,当残糖降低则加大流速,当残糖升高则降低流速,直至发酵结束。
(5)利用菊芋提取液发酵生产虾青素的反应器培养在3L(NewBrunswick,Scientific,BiofLo300,USA)生物反应器中进行的,装液量1000mL。接种量10%,培养温度为22℃,溶氧控制在30%以上,pH=5.0,发酵300小时后终止。色素产量为383.25mg/L;通过干重法测得酵母生物量为35g/L。
实施例6:利用菊芋粉发酵生产虾青素的方法
(1)红发夫酵母(As.21557)种子液的制备同实施例1。
(2)发酵培养基的制备:总糖浓度为20g/L的菊芋粉作为发酵培养基,溶剂为去离子水,于115℃下灭菌20分钟。菊芋粉的制备:将菊芋的块茎和茎叶干燥、粉碎、过200目筛,得到菊芋粉。
(3)利用菊芋粉发酵生产虾青素:同实施例2,色素产量为3.58mg/L。
实施例7:利用菊芋粉的反应器分批发酵生产虾青素的方法
(1)红发夫酵母(ATCC66270)种子液的制备同实施例2。
(2)发酵培养基的制备:总糖浓度为33g/L的菊芋粉,酵母粉1.469g/L,溶剂为去离子水,于115℃下灭菌20分钟。
(3)利用菊芋粉发酵生产虾青素:同实施例3,发酵180小时终止。色素产量为104mg/L。
对比例1
(1)红发夫酵母种子液的制备同实施例1。
(2)发酵培养基的制备:果糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L,于115℃下灭菌20分钟。
(3)利用果糖发酵生产虾青素:其他发酵条件同实施例2。培养72小时后,收集菌体。色素产量为3.42mg/L,细胞干重达到4.98g/L。
对比例2
(1)红发夫酵母(ATCC66270)种子液的制备同实施例2。
(2)发酵培养基的制备:葡萄糖20g/L、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠0.1g/L、硫酸镁0.5g/L、酵母粉0.2g/L、氯化钙0.1g/L,于115℃下灭菌20分钟。
(3)利用葡萄糖发酵生产虾青素:其他发酵条件同实施例2。培养180小时后,收集菌体。色素产量为35.25mg/L,细胞干重达到3.23g/L。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)原料准备:将菊芋的块茎和茎叶干燥、粉碎、过筛,得到菊芋粉;
(2)菊芋提取液的提取:将水和菊芋粉混合均匀,于80~90℃下浸提,得到菊芋浆;将菊芋浆离心,得到菊芋提取液;
(3)发酵培养基的制备:将步骤(1)得到的菊芋粉或步骤(2)得到的菊芋提取液作为培养基碳源,加入氮源配制成发酵培养基,灭菌;
(4)种子液的制备及发酵:将红发夫酵母种子液接入步骤(3)得到的灭菌发酵培养基,进行发酵;
(5)虾青素的提取:收集菌体,对菌体进行干燥、破壁、提取、浓缩,得到虾青素。
2.根据权利要求1所述利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法,其特征在于:
步骤(1)中所述的筛为40~200目筛;
步骤(2)中所述的水的体积用量为相当于所述菊芋粉质量的10~20倍;
步骤(2)中所述的浸提的温度为85℃;
步骤(2)中所述的离心的条件为30℃、4000rpm离心10分钟;
步骤(3)中所述的灭菌的条件为115~130℃下灭菌20~40分钟。
3.根据权利要求1所述利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法,其特征在于:步骤(2)中所述的浸提的时间为至少1小时。
4.根据权利要求1所述利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法,其特征在于:步骤(3)中所述的氮源为有机氮源和无机氮源中的一种或两种。
5.根据权利要求4所述利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法,其特征在于:所述的有机氮源为蛋白胨和酵母粉;
所述的无机氮源为硫酸铵、氯化铵、醋酸钠和硝酸铵中的至少一种。
6.根据权利要求1所述利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法,其特征在于:步骤(3)中所述的发酵培养基的组成如下:含总糖浓度为20~30g/L的菊芋提取液或菊芋粉、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾1g/L、氯化钠0.1g/L、硫酸镁0.5g/L、酵母粉0.2g/L、氯化钙0.1g/L;或是含总糖浓度为20~30g/L的菊芋提取液或菊芋粉、蛋白胨20g/L、酵母粉10g/L。
7.根据权利要求1所述利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法,其特征在于:步骤(4)中所述的红发夫酵母为红发夫酵母为As2.1557菌株或ATCC66270菌株。
8.根据权利要求1所述利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法,其特征在于:
步骤(4)中所述的红发夫酵母的接种量为发酵培养基体积的5~10%;
步骤(4)中所述的发酵的条件为在20~25℃下于摇瓶或生物反应器下培养72~300小时;
步骤(4)中所述的发酵的方式为分批发酵、连续发酵和流加发酵中的一种。
9.根据权利要求1所述利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法,其特征在于:
步骤(5)中所述的菌体的收集通过离心或过滤方法实现;
步骤(5)中所述的菌体的破壁采用酸热法、高压均质或者酶法破壁;
步骤(5)中所述的提取为通过有机溶剂对破壁菌体进行提取虾青素。
10.权利要求1~9任一项所述利用菊芋为原料发酵生产虾青素的方法在工业化制备虾青素中的应用。
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