CN105087622A

CN105087622A - 提高人胱抑素c蛋白在大肠杆菌中可溶性表达量的方法

Info

Publication number: CN105087622A
Application number: CN201510398984.8A
Authority: CN
Inventors: 李小红; 孔毅荣; 刘强; 于海双
Original assignee: Beijing Jiawan Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Jiawan Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-07-08
Filing date: 2015-07-08
Publication date: 2015-11-25

Abstract

本发明公开了一种提高人胱抑素C蛋白在大肠杆菌中可溶性表达量的发酵方法，该编码基因的核苷酸序列SEQ？ID？NO：1，重组人胱抑素C的表达方法，包括以下步骤：直接合成并优化密码子，将重组人胱抑素C插入到原核表达载体的多克隆位点，构建重组表达质粒，将重组表达质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌，筛选阳性克隆，得工程菌，工程菌经发酵、诱导、分离、纯化，得重组人胱抑素C。通过优化发酵罐的溶氧，pH，搅拌速率，补料条件，使蛋白的产量可以达到0.4g/L，且活性和天然胱抑素C蛋白相近。本发明提供的重组胱抑素C发酵放大生产方法，操作简单，且表达的胱抑素C产量高达0.4g/L，纯度达到95％以上，同时利用重组人胱抑素C蛋白制备多抗血清和标准品，目前未见表达效率更好的报道。

Description

提高人胱抑素C蛋白在大肠杆菌中可溶性表达量的方法

技术领域

本发明属于生物医学工程领域，特别涉及一种提高人胱抑素C蛋白在大肠杆菌中可溶性表达量的方法。

背景技术

胱抑素C即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白，1983年Anastasi等首次在鸡蛋清中分离纯化得到高纯度的半胱氨酸酶抑制剂，后被命名为胱抑素C，也被称为γ-微量蛋白及γ-后球蛋白，广泛存在于各种组织的有核细胞和体液中，是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质，分子量为13.3KD，由122个氨基酸残基组成，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除，是一种反映肾小球滤过率变化的内源性标志物，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代谢分解，不返回血液，因此，其血中浓度由肾小球滤过决定，而不依赖任何外来因素，如性别、年龄、饮食的影响，是一种反映肾小球滤过率变化的理想标志物，可作为肾小球滤过功能指标，比目前常用的肾功能检测项目有更高的灵敏度和特异性，其血清浓度是替代传统的血尿素和内生肌酐清除率测定的首选功能评价指标。

由于胱抑素C及抗体的来源受限，现有胱抑素C的试剂盒价格昂贵，妨碍其在国内推广应用。目前，通常采用PCR技术调取胱抑素C编码基因，克隆后进行重组表达，但表达效率极低，难以满足市场需求，为此我们通过优化胱抑素C的编码基因，建立了重组胱抑素C蛋白的制备体系，以期解决胱抑素C的来源问题，同时经过发酵罐优化发酵条件，大量提高胱抑素C的表达量，为胱抑素C检测试剂盒的研发提供优质原料。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人胱抑素C蛋白在大肠杆菌中可溶性表达量的方法。

重组胱抑素C表达方法包括如下步骤：

1.将目的基因的5′端加入NcoI酶切位点，3′加入XhoI酶切位点酶切位点，进行全序列合成，获得合成序列；

2.将合成的序列从puc57载体切下，插入至原核表达载体的多克隆位点，构建重组表达质粒，将重组表达质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌，筛选出阳性克隆菌，获得工程菌；

3.原核表达载体为pET22b(+)，表达宿主为DE3(E.coliRosetta)。

提高重组胱抑素C可溶性表达量的步骤

1.为了实现本发明目的，一种提高人胱抑素C蛋白在大肠杆菌中可溶性表达量的方法，将CYS-C-PET22b(+)转化大肠杆菌DE3(E.coliRosetta)，在诱导后的上清中，重组人胱抑素C呈可溶性表达。通过发酵罐放大优化提高了可溶性蛋白的表达量。

2.利用单因子实验确定最佳IPTG、溶氧、pH及温度。

3.具体可采用以下方法验证实际发酵过程中IPTG、溶氧、pH和转速。

4.利用100L发酵罐，以工程菌进行发酵实验，在初始培养基中添加10g/L葡萄糖，在发酵过程中用氨水控制pH在6.5-8.0，温度控制在25-38℃，通过调整搅拌和通气量控制溶氧在20％以上，通过调整补加葡萄糖液和酵母提取液速度控制发酵液中剩余葡萄糖的量为0.1-0.6g/L，发酵周期为25-30h，实验结果表明发酵过程中控制葡萄糖的量，可以有效提高胱抑素C的产量。

5.通过补料批式发酵，使得胱抑素C产量可以达到0.4g/L，成本低廉，适于大规模生产，降低胱抑素C试剂盒成本，因而具有较好的产业价值。

6.经已获得注册号的进口体外诊断试剂盒于BECKMAN全自动生化分析仪检测，活性达90％以上。制备重组胱抑素C多抗血清的方法

1.为了更好地利用重组胱抑素C蛋白制备抗血清，本发明免疫动物制备血清。

2.前述的方法，选用的动物优选为新西兰兔。

3.本发明还公开了利用上述血清制备重组人胱抑素C蛋白制备诊断试剂标准品。

4.所述的合适浓度为10-200ng/ml，以此标准品按梯度稀释，在10ng/mL-200ng/mL范围内，线性偏差＜5％。

附图说明

图1为制备重组胱抑素C的流程示意图

图2为重组人胱抑素C表达产物的SDS-PAGE分析，其中M：Marker，1：破碎菌体包涵体，2：破碎菌体上清

图3为发酵时间对胱抑素C可溶性表达量的影响，其中M：Marker，1：诱导前，2：诱导后1h，3：诱导后2h，4：诱导后4h，5：诱导后8h

图4为胱硫醚beta合酶纯化后的SDS-PAGE分析，其中M：Marker，1：纯化后的胱抑素C蛋白

图5为制备胱抑素C诊断标准品评价结果

图6为发酵策略对产胱抑素C细胞产量的影响

具体实施方案

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

重组胱抑素C表达方法如下步骤

1)将目的基因的5′端加入NcoI酶切位点(CCATGG)，3′加入XhoI酶切位点(CTCGAG)；通过全序列合成获得目的序列。

2)将获得序列用NcoI和XhoI进行双酶切，纯化得到目的基因，原核表达载体pET22b(+)经相同的酶切处理，纯化大片段基因，并与双酶切后得到的目的基因连接，转入感受态细胞DH5a，测序确定成功，抽提质粒，获得重组表达质粒CYS-C-pET22b(+)。

3)将重组表达质粒CYS-C-pET22b(+)；转入感受态表达宿主菌DE3(E.coliRosetta)中，涂布于LB固体培养基(含100μg/ml硫酸卡那霉素)上，37℃培养16h，筛选出阳性克隆菌为工程菌。

4)将工程菌接种至LB培养液(含50μg/ml硫酸卡那霉素)中，37℃培养，待菌液OD_600nm至0.5时，加入终浓度为0.5mmol/l的IPTG，37℃培养4h。4℃，12000rpm离心10min分离得到诱导表达上清液和菌体。

5)将菌体用BindingBuffer洗涤1次后，冰上超声破菌，离心收集上清液，12％SDS-GAGE检测蛋白表达量。

6)将超声破菌，离心收集上清液，将上清液加入镍层析柱，依次加入BindingBuffer，WashBuffer，最后EluteBuffer进行目的蛋白洗脱，收集EluteBuffer洗脱蛋白，得重组胱抑素C蛋白，采用12％SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的纯度(如图2)。

7)从图中可以看出，纯化后的蛋白纯度大于95％。

实施例2

优化发酵条件提高重组胱抑素C可溶性表达产量

1)100L发酵罐，以工程菌进行发酵实验，在初始培养基中添加glucose10％，在发酵过程中用氨水控制pH在6.5-8.0，温度在25-38℃，通过调整搅拌和通气量控制溶氧在20％以上，通过调整补加葡萄糖液和酵母提取液速度控制发酵液中剩余葡萄糖的量在0.1-1g/L，发酵周期为25-30h，实验结果表明发酵过程中控制葡萄糖的量可以有效提高菌体的量(如图6)和可溶性蛋白的产量(如图3)。

2)前述的方法，所述的培养液中连续补加的酵母提取液和glucose。

3)前述的方法，所述的培养基配方为：Tryptone12g/L、YeastExtract12g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸镁2mmol/L、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钠15g/L、微量元素母液1mL/L、葡萄糖10g/L。

4)所述微量元素的组成为：FeSO₄·H₂O32.0g/L，Zn8O₄4.0g/L，CuSO₄·5H₂O4.0g/L，H₃BO₄0.6/L，MnSO₄·H₂O8.0g/L，CaCl₂0.7g/L，Na₂MoO₄·2H₂O10.0g/L，CoCl₂·6H₂O4.0g/L，以水配制。

5)前述的方法，其中补料所用的培养基为50％-70％葡萄糖溶液和40％-50％酵母提取液，其中所述的发酵温度30-38℃，pH6.5-7.5，溶氧为0-100％，批式发酵过程中，发酵液中葡萄糖的含量维持在0.1-1g/L，发酵25-30h。

实施例3重组胱抑素C蛋白活性验证

实施例2中纯化的胱抑素C蛋白进行免疫双扩散实验，即在6孔琼脂板上，中央孔加入兔抗人胱抑素C血清(Dako公司)，将纯化好的重组人胱抑素C和天然胱抑素C以起始浓度0.8mg/ml，由1∶2开始对倍稀释加入周围5孔，最后一孔加入生理盐水。

上述琼脂板放入密封袋中，置于37℃反应4-6小时，取出观察结果(表一)：

表一：重组胱抑素C蛋白与天然胱抑素C蛋白活性比较

蛋白	免疫双扩散
		天然胱抑素C蛋白	1∶32
重组胱抑素C蛋白	1∶32

上述结果显示，重组胱抑素C蛋白与天然胱抑素C蛋白活性一致。

实施例4人胱抑素C诊断标准品制备

将纯化好的重组人胱抑素C蛋白用PBS稀释成10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、150ng/ml和200ng/ml，送医院在进口自动生化分析仪用进口试剂盒评价结果如图5。

从图中可得回归方程R²＝0.9993，说明重组胱抑素C活性非常接近天然蛋白。

实施例5免疫兔子制备多抗血清

采用10只体重为2公斤健康的新西兰兔为免疫动物：以实施例1制备的充足人胱抑素C蛋白为免疫原，对照免疫原为新鲜血清中提取的天然人胱抑素C蛋白，各免疫5只。免疫剂量：基础免疫为500ug/只，加强免疫剂量为500ug/只。免疫的具体步骤如下：用稀释液稀释适量免疫原，加入等体积弗氏完全佐剂，充分乳化，在兔子背部皮内多点注射进行初次免疫；3周后，取适量免疫原加弗氏不完全佐剂乳化后进行背部皮下多点注射，每2周加强免疫一次。从加强免疫第2次开始，在每次免疫后第七天采血检测效价，在第三次免疫后获得了高效价的抗体，重组蛋白免疫的抗血清滴度为1∶1800*10⁴，对照天然蛋白免疫的抗血清滴度为1∶900*10⁴。在6孔琼脂板上，中央孔加入天然人胱抑素C蛋白(Dako)，将纯化好的重组人胱抑素C和对照天然抗兔抗血清(Dako公司)以起始浓度1mg/ml，由1∶2开始对倍稀释加入周围5孔，最后一孔加入生理盐水，结果如表二。

表二：重组胱抑素C蛋白兔抗血清与天然胱抑素C蛋白兔抗血清效价比较

抗体	免疫双扩散
		天然胱抑素C兔抗	1∶32
重组胱抑素C兔抗	1∶16

上还结果显示，重组胱抑素C蛋白兔多抗效价高于天然胱抑素C兔多抗。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。

Claims

1.一种提高人胱抑素C蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法，其特征在于，通过分子操作构建获得表达载体CYS-C-pPET22b(+)，转化宿主DE3(E.coliRosetta)，获得工程菌。

2.权利要求1所述工程菌经发酵罐连续补加yeastextract和glucose的补料批式发酵。

3.权利要求2所述的培养液中连续补加50％-70％glucose和40％-50％yeastextract。

4.权利要求2所述的培养基的配方为：Tryptone12g/L、YeastExtract12g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸镁2mmol/L、磷酸二氢钾3g/L、磷酸氢二钠15g/L、微量元素母液1mL/L、葡萄糖10g/L。

5.权利要求2所述微量元素的组成为：FeSO₄·H₂O20.0g/L，ZnSO₄4.0g/L，CuSO₄·5H₂O4.0g/LH₃BO₄0.6/L，MnSO₄·H₂O4.0g/L，CaCl₂0.7g/L，Na₂MoO₄·2H₂O5.0g/L，CoCl₂·6H₂O2.0g/L，以水配制。

6.权利要求2所述的发酵温度为30-38℃，pH6.5-7.5，溶氧为10-100％，批式发酵过程中，发酵液中葡萄糖的含量维持在0.1-0.6g/L，发酵30-35h。

7.根据权利1-6所述的制备方法制备得到的重组人胱抑素C蛋白。

8.根据权利要求7所得的重组人胱抑素C蛋白在制备多抗血清和标准品方面的应用。