CN105087391A

CN105087391A - 一种樟芝菌丝体粉的制备方法

Info

Publication number: CN105087391A
Application number: CN201510513081.XA
Authority: CN
Inventors: 袁兵兵; 史劲松; 龚劲松; 董彩虹; 徐国华; 曾化伟
Original assignee: JIANGSU SHENHUA PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: JIANGSU SHENHUA PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2015-08-19
Filing date: 2015-08-19
Publication date: 2015-11-25
Anticipated expiration: 2035-08-19
Also published as: CN105087391B

Abstract

本发明公开了一种樟芝菌丝体粉的制备方法，该方法是由樟芝菌种经深层液体发酵培养，发酵结束后收集樟芝菌丝体，菌丝体经真空干燥和粉碎得樟芝菌丝体粉，其中，所述的深层液体发酵采用发酵滤液循环利用和分批补料的发酵方式获得。该樟芝菌丝体粉制备方法简单，有效成分含量高，不经过复杂的提取程序，很好地保留了樟芝的有效成分。

Description

一种樟芝菌丝体粉的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种樟芝菌丝体粉的制备方法。

背景技术

樟芝，学名为AntrodiaCamphorata，俗名牛樟菇、红樟芝、樟内菇、樟菇等，因其疗效特殊神奇、活人无数，在民间甚至有“阴阳对口菇”之称。因樟芝具有解毒保肝、抗癌、强化免疫、抗过敏、降血脂等神奇功效，素有“药芝之王”、“中国台湾森林中之红宝石”的美誉。

樟芝中含有多种生理活性成分，如多糖、三萜类化合物、SOD腺苷、蛋白质、多种维生素、微量元素等。其具备的生理活性功能为抗肿瘤、增强免疫力、抗病毒、抗过敏、抗高血压、降低胆固醇等。

樟芝中含有的三萜类化合物种类是所有真菌产品中最多的，一般认为樟芝萃取物中苦味成分的主要来源。其中多达10多种新发现三萜类为樟芝所独有，试验证实：这些三萜类化合物能抑制肝癌细胞的增殖、毒杀老鼠血癌细胞活性、抗副交感神经作用、抗血清素活性、活化神经细胞生长能力等功能；比樟芝多糖扮演着更重要的活性调节角色。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：采用发酵滤液循环利用的发酵工艺生产樟芝菌丝体粉，利用发酵滤液中的有效成分等微量因子刺激樟芝菌快速合成有效成分，显著缩短发酵周期，由原来的7天缩短到5-6天，并提高有效成分的含量，樟芝三萜由原来的4％提高到7％，樟芝多糖由原来的2％提高到4％，樟芝菌粉不经过复杂的提取工艺，节约了劳动时间且减少了有效成分的流失。

本发明的目的是通过以下方式实现的：

一种樟芝菌丝体粉的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

樟芝菌种经液体深层发酵，发酵结束后收集樟芝菌丝体，菌丝体再经真空干燥和超微粉碎得樟芝菌丝体粉；其中，所述的液体深层发酵采用发酵滤液循环利用和分批补料的发酵方式获得。

所述的发酵滤液循环利用和分批补料的发酵方式为：发酵2天后，樟芝菌球增多，此时加入上批樟芝发酵滤液，加入量占发酵液总体积的10％-12％，继续发酵3-4天，待发酵液pH降到2.7-3.3，发酵液残糖＜0.5，还原糖＜0.3时，结束发酵。

樟芝菌种摇瓶培养后再经液体深层发酵，所述的摇瓶培养是将樟芝菌株以常规方法活化后，用接种环取樟芝菌株2-3环接种于种子液培养基摇瓶，培养温度26-27℃，培养时间为6-8天，转速为120rpm，种子培养基组成为葡萄糖5％-6％、酵母粉1.5％-2％、蛋白胨3％-4％、磷酸二氢钾0.2％-0.3％、硫酸镁0.02％-0.03％、消泡剂0.1％，pH调至4.5；优选种子培养基组成为葡萄糖6％、酵母粉2％、蛋白胨4％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.03％、消泡剂0.1％，pH调至4.5。

所述的深层发酵是指摇瓶培养结束后，将樟芝种子液接种到发酵培养基中，接种量5％-6％；发酵培养基组成为葡萄糖4％-5％、酵母粉2％-3％、蛋白胨5％-6％、磷酸二氢钾0.2％-0.3％、硫酸镁0.02％-0.03％、消泡剂0.1％，调pH至4.5；培养温度26-28℃，通气比1:0.4。优选将樟芝种子液接种到发酵培养基中，接种量6％；发酵培养基组成为葡萄糖4％、酵母粉2％、蛋白胨5％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.03％、消泡剂0.1％，调pH至4.5；培养温度26-28℃，通气比1:0.4。

发酵结束后，发酵液进行离心分离得樟芝菌丝体，离心转速3000rpm，离心时间20-30min。

离心分离得到的樟芝菌丝体进行低温真空干燥，干燥时控制真空度0.08-0.09MPa，温度70℃以下，干燥时间15-18h。

所述的上批樟芝发酵滤液为：将樟芝菌株以常规方法活化后，用接种环取樟芝菌株2-3环接种于种子液培养基摇瓶，培养温度26-27℃，培养时间为6-8天，转速为120rpm，种子培养基组成为葡萄糖5％-6％、酵母粉1.5％-2％、蛋白胨3％-4％、磷酸二氢钾0.2％-0.3％、硫酸镁0.02％-0.03％、消泡剂0.1％，pH调至4.5；摇瓶培养结束后，将樟芝种子液接种到发酵培养基中，接种量5％-6％；发酵培养基组成为葡萄糖4％-5％、酵母粉2％-3％、蛋白胨5％-6％、磷酸二氢钾0.2％-0.3％、硫酸镁0.02％-0.03％、消泡剂0.1％，调pH至4.5；培养温度26-28℃，通气比1:0.4，待发酵液pH降到2.7-3.3，发酵液残糖＜0.5，还原糖＜0.3时，结束发酵。发酵液进行离心分离得樟芝菌丝体和发酵滤液，离心转速3000rpm，离心时间20-30min；或者是在深层液体发酵过程中已经采用过发酵滤液循环利用和分批补料的发酵方式得到的发酵滤液。

本发明樟芝菌丝体粉的制备方法可具体包括以下步骤：

将樟芝菌株以常规方法活化后，用接种环取樟芝菌株2-3环接种于种子液培养基摇瓶，每个5L摇瓶种子培养瓶装培养基的量为2L，培养温度26-27℃，培养时间为6-8天，转速为120rpm，培养基组成为葡萄糖6％、酵母粉2％、蛋白胨4％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.03％、消泡剂0.1％，pH调至4.5。

摇瓶培养结束后，将樟芝种子液接种到发酵培养基中，接种量6％；发酵培养基组成为葡萄糖4％、酵母粉2％、蛋白胨5％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.03％、消泡剂0.1％，调pH至4.5；培养温度26-28℃，通气比1:0.4。

发酵2天后，樟芝菌球增多，此时加入上批樟芝发酵滤液，加入量为总发酵液体积的10％-12％，继续发酵3-4天，待发酵液pH降到2.7-3.3，发酵液残糖＜0.5，还原糖＜0.3时，结束发酵。

本发明可使用市售的樟芝菌株。

发酵结束后，发酵液经卧式螺旋卸料沉降离心机进行分离得樟芝菌丝体，离心转速3000rpm，离心时间20-30mins。

离心分离得到的樟芝菌丝体经低温真空干燥箱进行干燥，干燥时控制真空度0.08-0.09MPa，控制温度70℃以下，烘干时间15-18h。

樟芝菌丝体粉碎过80目筛即得樟芝菌粉。

以下通过实验例，对本发明主要参数筛选进行进一步说明：

1.不同樟芝滤液流加量对发酵周期和产品指标的营养如表1：

表1

流加量	总发酵周期(d)	总三萜(％)	樟芝多糖(％)
				3％	7.0	4.3	2.1
5％	6.5	4.8	2.5
				8％	6.0	5.9	3.2
10％	5.0	6.8	3.8
				12％	5.5	7.1	4.3
15％	6.0	6.5	3.9
				20％	7.0	6.2	4.0

从上表可以看出，樟芝发酵滤液添加量较少作用不大，当添加量在占本批发酵液总体积的10％-12％之间时，其发酵周期最短，总三萜和多糖含量最多，当樟芝发酵滤液添加量高于12％时，由于发酵滤液添加量过高，导致对发酵罐中发酵营养物质，如葡萄糖、蛋白胨、酵母粉等的稀释，使其营养浓度降低，反而不利于菌体的生长和有效成分的合成。

2.取本发明实施例樟芝菌丝体粉与市售牛樟芝子实体粉比较其保肝作用，有显著性差异，结果见表1。

本试验共分4组，每组20只小鼠。试验分正常对照组(No.0，喂普通饲料)，高脂对照组(No.1，喂高脂饲料)，实验组No.2(喂高脂饲料的同时，并每日灌胃1g本发明实施例樟芝菌粉)，实验组No.3(喂高脂饲料的同时，并每日灌胃1g市售牛樟芝子实体粉)。

普通饲料：玉米料78.8％，麦麸20％，鱼粉5％，谷粉1％，食盐0.5％；

高脂饲料：基础饲料78.8％，胆固醇1％，牛胆盐0.2％，蛋黄粉10％，猪油10％；

分笼饲养，内垫消毒木屑，饮用自来水，喂养天数都是20d，20d后检测肝脏中TC、TG、FFA、MDA和SOD的浓度。

试验结果见表2：

表2本菌粉与市售牛樟芝菌粉保肝试验结果

从表2中可以看出，高脂饲料组中TC、TG、FFA、MDA的含量显著高于空白组(P＜0.05)，而SOD含量显著低于空白组(P＜0.05)，说明高脂喂养对小鼠肝脏造成损伤，同时减弱了小鼠肝脏的抗氧化能力；

本菌粉组和市售子实体菌粉组TC、TG、FFA、MDA的含量显著低于高脂组(P＜0.05)，SOD含量显著高于高脂组(P＜0.05)，说明本发酵菌粉和市售子实体菌粉都有保肝的作用；本菌粉组TC、TG、FFA、MDA的含量显著低于市售子实体菌粉组(P＜0.05)，SOD含量显著高于市售菌粉组(P＜0.05)，说明在保肝功能方面本发明菌粉比市售牛樟芝菌粉效果显著。

与现有技术比较本发明的有益效果：本发明采用发酵滤液循环利用的发酵工艺生产樟芝菌丝体粉，发酵滤液中的有效成分等微量因子刺激樟芝菌快速合成有效成分，显著缩短发酵周期，由原来的7天缩短到5-6天，并提高有效成分的含量，樟芝三萜由原来的4％提高到7％以上，樟芝多糖由原来的2％提高到4％以上，且樟芝菌粉不经过复杂的提取工艺，节约了劳动时间且减少了有效成分的流失，同时还能显著增强保肝作用。

具体实施方式

以下通过具体实施例进一步说明本发明。但实施例的具体细节仅用于解释本发明，不应理解为对本发明总的技术方案的限定。本发明使用的樟芝菌株(JNPF-AC01)由江南大学提供，经中国科学院微生物研究所菌种保藏中心鉴定。

对比例1

摇瓶培养结束后，将樟芝种子液接种到发酵培养基中，接种量6％；发酵培养基组成为葡萄糖4％、酵母粉2％、蛋白胨5％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.03％、消泡剂0.1％，调pH至4.5；培养温度26-28℃，通气比1:0.4，待发酵液pH降到2.7-3.3，发酵液残糖＜0.5，还原糖＜0.3时，结束发酵。

发酵结束后，发酵液经卧式螺旋卸料沉降离心机进行分离得樟芝菌丝体和发酵滤液，离心转速3000rpm，离心时间20-30mins。

离心分离得到的樟芝菌丝体经低温真空干燥箱进行干燥，干燥时控制真空度0.08到0.09MPa，控制温度70℃以下，烘干时间15-18h。

樟芝菌丝体经粉碎过80目筛后即得樟芝菌粉，质量检测结果见表3

表3樟芝菌丝体粉质量检测结果

实施例1

将樟芝菌株以常规方法活化后，用接种环取樟芝菌株2-3环接种于种子液培养基摇瓶，每个5L摇瓶种子培养瓶装培养基的量为2L，培养温度26-27℃，培养时间为6-8天，转速为120rpm，培养基组成为葡萄糖5％、酵母粉1.5％、蛋白胨3％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.02％、消泡剂0.1％，pH调至4.5。

摇瓶培养结束后，将樟芝种子液接种到发酵培养基中，接种量6％；发酵培养基组成为葡萄糖5％、酵母粉3％、蛋白胨6％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.02％、消泡剂0.1％，调pH至4.5；培养温度26-28℃，通气比1:0.4。

发酵2天后，樟芝菌球增多，此时加上批樟芝发酵滤液(即对比例1结束发酵后得到的发酵滤液)，加入量占本批发酵液总体积的12％。继续发酵3天，待发酵液pH降到2.7-3.3，发酵液残糖＜0.5，还原糖＜0.3时，结束发酵。

樟芝菌丝体经粉碎过80目筛后即得樟芝菌粉。质量检测结果见表4：

表4樟芝菌丝体粉质量检测结果

实施例2

发酵2天后，樟芝菌球增多，此时加上批樟芝发酵滤液(即实施例1结束发酵后得到的发酵滤液)，加入量占本批发酵液总体积的10％。继续发酵3-4天，待发酵液pH降到2.7-3.3，发酵液残糖＜0.5，还原糖＜0.3时，结束发酵。

樟芝菌丝体经粉碎过80目筛后即得樟芝菌粉。质量检测结果见表5：

表5樟芝菌丝体粉质量检测结果

附一：总三萜检测方法

标准品溶液的配制：

精密称取0.0040g标准品熊果酸，用无水乙醇溶解并定容至10ml，得熊果酸标准液。(5％)香草醛-冰醋酸溶液的配制：

准确称取0.5g香草醛，用冰醋酸溶解并定容至10ml，得(5％)香草醛-冰醋酸溶液。样品处理：

精确称取样品0.150g，置圆底烧瓶中，加无水乙醇40ml，加热回流提取2h，取出，离心(3000转/min)15min，收集上清液。上清液加无水乙醇定容至50ml，得样品待测液。标准曲线的制备：

准确吸取熊果酸标准液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于具塞试管中，在通风柜内水浴挥尽溶剂；分别加入0.4ml(5％)香草醛-冰醋酸，再加入0.8ml高氯酸；置60℃水浴中加热15min，取出在4℃水浴中冷却2min(避光)；加入5ml冰醋酸，摇匀，静置10min(避光)；以试剂空白液为参比调零，于550nm波长测定吸光度，制得标准曲线。

总三萜的测定：

精确吸取样品待测液1ml，按标准曲线绘制步骤与550nm波长下测定吸光度值，并求出样品总三萜含量。

计算：

式中：m样──由回归方程计算得到的供试品相当于熊果酸标准品的质量(mg)；

W样──供试品的称样量(g)；

附二：总多糖检测方法

对照品溶液的制备：

精密称取1.0000g经过98～100℃干燥至恒重的分析纯葡萄糖，加水溶解后以水稀释至1000ml，此溶液1ml含1mg葡萄糖，用前稀释10倍(0.1mg/ml)，现用现配。

硫酸蒽酮溶液：

精密称取0.05g蒽酮置于50ml容量瓶中，缓慢加入硫酸溶液(取98％浓硫酸38ml，用水稀释至50ml)至刻度并摇匀，冷却至室温，现用现配。

样品处理：

准确称取样品1.00g，加水约80ml，加热回流2h，取出，离心(3000转/min)15min，收集上清液，加水定容至100ml，摇匀。取溶液10ml，加无水乙醇40ml，摇匀，冷藏放置过夜。将沉淀离心(3000转/min)15min后取出，将沉淀用水溶解至100ml，备用。

标准曲线的绘制：

准确吸取葡萄糖标准液(0.1mg/ml)0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于10ml具塞比色管中，加水至1.0ml，加入蒽酮硫酸溶液5ml充分混匀，在沸水浴中加热7min，取出在流水中冷却20min后，在625nm波长下，以试剂空白调零，测定各管的吸收值绘制标准曲线。

粗多糖的测定：

准确吸取样品待测液1ml，按标准曲线绘制步骤，于625nm波长下测定吸光度值，并求出样品含糖量。

计算：

式中：V样──为回归方程计算得到的供试品相当于葡萄糖对照品溶液的体积(ml)；

C对──为葡萄糖对照品溶液的浓度(0.1mg/ml)；

W样──供试品的称样量(g)。

Claims

1.一种樟芝菌丝体粉的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

樟芝菌种经液体深层发酵，发酵结束后收集樟芝菌丝体，菌丝体再经真空干燥和超微粉碎得樟芝菌丝体粉；其中，所述的深层液体发酵采用发酵滤液循环利用和分批补料的发酵方式获得。

2.根据权利要求1所述的樟芝菌丝体粉的制备方法，其特征在于所述的发酵滤液循环利用和分批补料的发酵方式为：发酵2天后，樟芝菌球增多，此时加入上批樟芝发酵滤液，加入量占发酵液总体积的10％-12％，继续发酵3-4天，待发酵液pH降到2.7-3.3，发酵液残糖＜0.5，还原糖＜0.3时，结束发酵。

3.根据权利要求1所述的樟芝菌丝体粉的制备方法，其特征在于樟芝菌种摇瓶培养后再经液体深层发酵，所述的摇瓶培养是将樟芝菌株以常规方法活化后，用接种环取樟芝菌株2-3环接种于种子液培养基摇瓶，培养温度26-27℃，培养时间为6-8天，转速为120rpm，种子培养基组成为葡萄糖5％-6％、酵母粉1.5％-2％、蛋白胨3％-4％、磷酸二氢钾0.2％-0.3％、硫酸镁0.02％-0.03％、消泡剂0.1％，pH调至4.5。

4.根据权利要求3所述的樟芝菌丝体粉的制备方法，其特征在于樟芝菌种摇瓶培养后再经液体深层发酵，所述的摇瓶培养是将樟芝菌株以常规方法活化后，用接种环取樟芝菌株2-3环接种于种子液培养基摇瓶，培养温度26-27℃，培养时间为6-8天，转速为120rpm，种子培养基组成为葡萄糖6％、酵母粉2％、蛋白胨4％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.03％、消泡剂0.1％，pH调至4.5。

5.根据权利要求1所述的樟芝菌丝体粉的制备方法，其特征在于所述的深层发酵是指摇瓶培养结束后，将樟芝种子液接种到发酵培养基中，接种量5％-6％；发酵培养基组成为葡萄糖4％-5％、酵母粉2％-3％、蛋白胨5％-6％、磷酸二氢钾0.2％-0.3％、硫酸镁0.02％-0.03％、消泡剂0.1％，调pH至4.5；培养温度26-28℃，通气比1:0.4。

6.根据权利要求5所述的樟芝菌丝体粉的制备方法，其特征在于所述的深层发酵是指摇瓶培养结束后，将樟芝种子液接种到发酵培养基中，接种量6％；发酵培养基组成为葡萄糖4％、酵母粉2％、蛋白胨5％、磷酸二氢钾0.3％、硫酸镁0.03％、消泡剂0.1％，调pH至4.5；培养温度26-28℃，通气比1:0.4。

7.根据权利要求1所述的樟芝菌丝体粉的制备方法，其特征在于发酵结束后，发酵液进行离心分离得樟芝菌丝体，离心转速3000rpm，离心时间20-30min。

8.根据权利要求1所述的樟芝菌丝体粉的制备方法，其特征在于离心分离得到的樟芝菌丝体进行低温真空干燥，干燥时控制真空度0.08-0.09MPa，温度70℃以下，干燥时间15-18h。

9.根据权利要求2所述的樟芝菌丝体粉的制备方法，其特征在于所述的上批樟芝发酵滤液为将樟芝菌株以常规方法活化后，用接种环取樟芝菌株2-3环接种于种子液培养基摇瓶，培养温度26-27℃，培养时间为6-8天，转速为120rpm，种子培养基组成为葡萄糖5％-6％、酵母粉1.5％-2％、蛋白胨3％-4％、磷酸二氢钾0.2％-0.3％、硫酸镁0.02％-0.03％、消泡剂0.1％，pH调至4.5；摇瓶培养结束后，将樟芝种子液接种到发酵培养基中，接种量5％-6％；发酵培养基组成为葡萄糖4％-5％、酵母粉2％-3％、蛋白胨5％-6％、磷酸二氢钾0.2％-0.3％、硫酸镁0.02％-0.03％、消泡剂0.1％，调pH至4.5；培养温度26-28℃，通气比1:0.4，待发酵液pH降到2.7-3.3，发酵液残糖＜0.5，还原糖＜0.3时，结束发酵，发酵液进行离心分离得樟芝菌丝体和发酵滤液，离心转速3000rpm，离心时间20-30min，取发酵滤液；或者是在深层液体发酵过程中已经采用过发酵滤液循环利用和分批补料的发酵方式得到的发酵滤液。