CN105085584A

CN105085584A - 精氨酸果糖苷(af)制备方法及其医用用途

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Publication number: CN105085584A
Application number: CN201410305612.1A
Authority: CN
Inventors: 郑毅男; 赵婷; 胡同童; 丁传波; 张晶; 李伟
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-06-28
Filing date: 2014-06-28
Publication date: 2015-11-25

Abstract

本发明公开了精氨酸果糖苷的制造方法及在预防治疗糖尿病中的医用用途，精氨酸果糖苷对2型糖尿病具有预防治疗作用，对于2型糖尿病患者具有降低空腹血糖和餐后血糖的作用，并具有降低血脂、总胆固醇，提高高密度脂蛋白的作用,改善糖尿病患者多饮、多食症状。利用精氨酸果糖苷具有降血糖、改善葡萄糖耐量、调节血脂的作用制成药物，用于预防及治疗2型糖尿病。精氨酸果糖苷对酒精肝损伤具有预防治疗作用，对酒精造成的肝损伤具有修复作用。

Description

精氨酸果糖苷(AF)制备方法及其医用用途

技术领域

本发明涉及精氨酸衍生物类的化合物，具体的说是精氨酸果糖苷，并公开了该化合物在医疗领域的新用途。

背景技术

糖尿病（diabetesmellitus）是一种体内胰岛素相对或绝对不足或靶细胞对胰岛素敏感性降低或胰岛素本身存在结构上的缺陷而引起的碳水化合物、脂肪和蛋白质代谢紊乱的一种慢性疾病。它不是单一的疾病，而是复合病因引起的综合征，是包括遗传及环境因素在内的多种因素共同作用的结果。亚洲糖尿病学会披露，截至2012年中国患糖尿病的总人数已达到9240万，其糖尿病发病率高达9.7%。糖尿病患者平均可减少十年寿命，且可能发生的并发症遍及全身。视网膜症、肾病和神经障碍的发病率最高，被称为糖尿病的三大并发症。目前，糖尿病的分类主要有四类：1型糖尿病又称为胰岛素依赖性糖尿病（insulin-dependentdiabetesmellitus）、2型糖尿病又称为非胰岛素依赖性糖尿病（non-insulin-dependentdiabetesmellitus）、妊娠糖尿病及其他特殊类型的糖尿病。在糖尿病的患者中，2型糖尿病所占的比例约为95%。它是成人发病型糖尿病，多在于35-40岁之后发病，但是现在青年发病率明显增多。目前，我国20岁以上人群中男性和女性糖尿病的患病率分别达10.6%和8.8%。

精氨酸单糖苷（AF），又称为精氨酸果糖苷，其化学名为1-（精氨酸-N^α基）-1-去氧-D果糖。它是人参加工过程中的初产物，是由鲜人参中的葡萄糖与精氨酸经加热后发生美拉德反应所生成的。1996年研究者报告^[1]，从红参中分离并鉴定了该化合物，并进行了化学合成，其简单合成路线：精氨酸与葡萄糖的比例为1:2，在溶媒冰醋酸的条件下，温度80℃下反应1小时，即可获得AF合成物。2009年LeeJung-Sook等^[2]报告了AF体外抗氧化作用；2009年Jang,HaeDong^[3]报告，精氨酸衍生物制备及改善男性性功能；JP2010090076^[4]公开了AFG与AF的制造方法及其在化妆品中的应用；KR10-0966613^[5]专利指出,采用发酵法制备精氨酸衍生物,并应用健康大鼠观察了AFG与AF对餐后血糖的作用，AFG与AF有降低餐后血糖的作用，但是没有观察AF对2型糖尿病大鼠或小鼠的空腹血糖以及餐后血糖的作用，CN102178687^[6]公开了AFG对2型糖尿病大鼠的治疗作用，可明显降低大鼠空腹血糖，餐后血糖以及血液生化指标。本发明以链脲佐菌素（STZ）诱导2型糖尿病动物模型，观察AF对2型糖尿病小鼠的作用，发现AF在糖尿病的治疗方面具有很好的疗效。因此，AF在作为预防和治疗糖尿病药物方面有着可观的开发和应用价值。

众所周知饮酒过量会造成各种肝脏疾病。饮酒量与肝硬化的发病率存在一定的联系^[7]。Mandayam^[8]等调查发现，如果男人平均每日摄入乙醇量超过80g，女人平均每日摄入乙醇量超过20g，以此方式饮酒达10年以上者，其患肝硬化的几率会大大增加。每日饮酒超过30g的人与不饮酒的相比肝硬化的几率要大10%左右^[9]。此外，一次性大剂量的饮酒也会增加酒精性肝病的发病率^[10,11]。酒的类别对酒精性肝病的影响在于烈酒更容易造成肝损伤，调查发现，白酒和啤酒比葡萄酒更容易损伤肝脏^[12]。另有报道指出在进餐时间以外饮酒的患酒精性肝病的风险比进餐时饮酒的要高2.7倍^[13]。与男人相比，女人的肝脏更容易收到酒精的伤害，因女性肝脏对酒精的敏感程度高，导致肝损伤所需的酒精量比男性要少^[14]。此外，蛋白质及一些微量营养元素的缺失，也会增加酒精对肝脏的损伤程度^[15]。就个体差异而言，遗传对酒精的代谢起到很大的影响，因酒精在肝脏中代谢需要酶的参与，遗传是造成个体间酒精代谢酶含量多少的主要原因^[16,17]。这也就说同等剂量的酒精，对不同人造成的损伤的是有差异的，也解释了为什么喝一样多的酒，有人没事，有的人就会喝醉。黄种人的乙醇脱氢酶就有异于白种人，其活性较低，所以其酒精性肝病患病率较西方人低。对已感染肝炎病毒的患者，饮酒会增加肝硬化的风险^[18]，患有酒精性肝病的患者一旦感染上肝炎病毒，也会加重酒精性肝损伤的程度^[19]。乙醇进入肝脏时破坏了肝细胞膜脂质双分子层，改变了包膜的通透性，从而影响了其结构和功能。大量的乙醇迅速损害可以帮助人体吸收脂肪的甲基供体，从而使脂肪在肝脏积蓄，造成肝脏损伤^[20]。乙醇还能造成体内半胱氨酸积蓄，损伤内质网，破坏线粒体功能紊乱。线粒体功能的紊乱就大大降低了氧化乙醛的能力，进而使毒性更强的乙醇代谢中间产物—乙醛在肝脏内的含量增加。它与体内多种蛋白共价结合，形成不稳定的乙醛蛋白加合物^[21]，不但破坏原有蛋白质结构与功能，而且还会刺激机体产生抗体，引起免疫应答，对肝细胞造成伤害^[22]。

酒精性肝病是一类危害大但又不易察觉的疾病，临床表现主要包括酒精性脂肪肝，酒精性肝炎，酒精性肝硬化三类。若不及时治疗，任其发展，可发生很多并发症，严重者会导致肝癌。近十年来，随着人们生活水平的不断提高和社交圈的扩大，全球酒的消费量也在迅速递增。同时，酒精性肝病的病发率也呈明显上升趋势。对于肝脏疾病的治疗，选择合适的药物十分关键，可以很大程度上避免因药物对肝脏造成的二次伤害，应当选择毒副作用小的天然保肝药物。目前市场上使用的保肝药物有许多，联苯双酯是目前运用较为普遍的一种，另外从中药中提取的水飞蓟素也收到很好的效果。本专利公开了AF对酒精肝损伤的修复作用。

经检索未见关于AF在抗2型糖尿病及酒精肝损伤的修复作用的报道。

发明内容

本发明涉及精氨酸单糖苷(AF)在治疗2型糖尿病及酒精肝损伤修复作用的新用途。本发明所使用的化合物:1-（精氨酸-N^α基）-1-去氧-D果糖,简称AF，其化学结构是如下：

本发明所使用的AF具体制备方法：将L-精氨酸与葡萄糖以1:2-4的质量比，置入2-8倍量的冰醋酸中，待二者充分溶解后，在温度60-80℃的条件下反应10-60分钟，反应完成后，在40℃以下条件下除去醋酸，冷冻干燥，即得AF总合成物。将AF总合成物用硅胶干法拌样，过200-300目硅胶湿柱，70%乙醇洗脱，收集AF流份，真空低压浓缩，回收乙醇，冷冻干燥成粉末。将粉末溶于1-8倍量的0.2%的醋酸三重蒸馏水中，上聚丙烯酰胺凝胶柱，以0.2%的醋酸水溶液洗脱，再次收集AF流份，冷冻干燥即得AF纯品。

以下实验表明本发明提供的1、AF的制备及检测方法；2、AF在治疗2型糖尿病；3、酒精肝损伤的修复作用。

实验例1AF合成方法

将L-精氨酸与葡萄糖以1:2-4的质量比，置入4倍量的冰醋酸中，待二者充分溶解后，在温度80℃的条件下反应30分钟，反应完成后，在40℃以下条件下除去醋酸，冷冻干燥，即得AF粗合成物。将AF粗合成物用硅胶干法拌样，过200-300目硅胶湿柱，70%乙醇洗脱，收集AF流份，真空低压浓缩，回收乙醇，冷冻干燥成粉末。将粗合成物粉末溶于少量的0.2%的醋酸三重蒸馏水中，使其浓度达到0.6g/mL，然后上聚丙烯酰胺凝胶柱，以0.2%的醋酸水溶液洗脱，再次收集AF流份，冷冻干燥即得AF纯品。

实验例2AF测试方法

a）精密称取AF样品1.5mg，用蒸馏水溶解，使之浓度为1.5mg/mL，0.23μ滤膜过滤样品，HPLC分析备用。

b）HPLC分析条件：流动相A：醋酸钠缓冲溶液（pH6.5）-乙腈溶液；流动相B：乙腈-水（体积比为4:1）溶液。线性梯度洗脱：0min，0%B；4min，3%B；16min，10%B；流速1.0mL/min。检测波长254nm；柱温40℃；色谱柱Vnusil-AA氨基酸分析专用柱（5μm，4.8mm×250mm）；液相色谱分析仪为岛津LC-20A。

c）HPLC流动相溶液的配置

流动相A的配制方法：称取7.6g醋酸钠，加三重水925mL，溶解后用冰醋酸调pH至6.5，然后加乙腈70mL，混匀，用0.45μm滤膜过滤；

三乙胺、乙腈溶液：取三乙胺1瓶（1.4mL），加乙腈8.6ml，混匀；

异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取异硫氰酸苯酯1瓶（25μl），加乙腈2mL，混匀，4℃保存。

e）待测样品及标准品溶液的衍生

准确吸取精氨酸标准溶液、AF样品溶液200μL，置于2ml离心管中，再加入三乙胺乙腈溶液100μL，异硫氰酸苯酯乙腈溶液100μl，混匀，室温放置1h，然后加入正己烷400μL，振摇后放置10min，取下层溶液，0.45μm滤膜过滤，带进行液相分析。

f）将AF样品溶液和精氨酸标准品溶液进行液相分析，进样量为20μl，根据峰面积归一化法计算得到样品AF的纯度为96.7%。

实验例3精氨酸单糖苷（AF）对2型糖尿病的作用

1.实验材料、动物、仪器及试剂

动物系昆明种小鼠，体重20-22g，雄性，购自于吉林大学基础医学院实验动物中心。

5D血糖试剂盒，北京怡成电子技术有限公司；BP211D型电子天平（十万分之一），德国sartorius公司离心机，上海东方仪器厂；酶标仪，日本三洋公司；酸度计，上海虹易科技公司；。

精氨酸单糖苷(AF)：纯度96.7%，4℃保存，由实验室自制，用前用蒸馏水配制成所需浓度。

链脲佐菌素（STZ），sigma公司；葡萄糖，上海三浦化工有限公司；二甲双胍，北京京丰制药有限公司；生理盐水，长春豪邦药业有限公司；基础饲料，吉林大学基础医学院实验动物中心。

2.试验方法

2.1糖尿病小鼠模型的建立

取健康小鼠，随机取10只作为空白对照组，即正常组，其余小鼠自由饮食高糖高脂饲料，4周后，空腹12小时，腹腔注射STZ100mg/kg，2周后，测其空腹血糖（fastingbloodglucose）值，FBG≥8.0mmol/L的小鼠为糖尿病小鼠。

2.2动物分组及给药

将造模成功的糖尿病小鼠分为四组，每组10只，分组情况见表1。每天上午8:30灌胃一次，连续给药4周。

1）对STZ诱导2型糖尿病小鼠空腹血糖的影响

将造模成功的小鼠连续给药4周，分别在给药2周和4周后测其空腹12小时的血糖值。

2)对STZ诱导2型糖尿病小鼠糖耐量的影响

将造模成功的小鼠连续给药4周，最后一次给药一小时后灌胃2g/kg的葡萄糖溶液，尾静脉取血，用血糖仪测其0min、30min、60min及120min的血糖值。

3）对STZ诱导2型糖尿病小鼠体重的影响

将造模成功的小鼠，连续给药4周，每天记录小鼠给药前的体重，以观察糖尿病小鼠体重的变化。

4）对STZ诱导2型糖尿病小鼠脾指数、胰腺指数及胸腺指数的影响

将造模成功的小鼠，连续给药4周后，给药最后一次，将小鼠颈椎处死，取其脾脏、胰腺及胸腺，观察药物对糖尿病小鼠脾指数、胰腺指数和胸腺指数的影响。

表1糖尿病小鼠分组情况

2.3实验数据处理

各组实验数据以（X±S）表示，对实验各组动物数据进行t检验，P<0.05为具有统计学意义。

3.实验结果

3.1对STZ诱导2型糖尿病小鼠血糖的影响

分别在给药2周、4周后测定糖尿病小鼠的空腹血糖，血糖值见表2，附图1。

表2AF对2型糖尿病小鼠的空腹血糖值

注：相对模型对照组：“**”P<0.01,“*”P<0.05；与空白组比较，“##”P<0.01,“#”P<0.05

给药2周后，各给药组的血糖值都高于正常组、但低于模型组。高剂量和低剂量组分别降低了8.9%和8.0%。给药4周后，高剂量组血糖值未见降低，且略有升高。AF低剂量组血糖进一步降低，较模型组降低了39.2%。

3.2对STZ诱导2型糖尿病小鼠糖耐量的影响

给药4周后，对糖尿病小鼠进行了糖耐量测试见表3，附图2。各给药组的小鼠糖耐量较模型组都有所改善，AUC都有所降低。高剂量组降低了7.76%，低剂量组降低了19.33%。

表32型糖尿病小鼠的糖耐量情况（n=8）

对STZ诱导2型糖尿病小鼠饮水量的影响结果见附图3;对STZ诱导2型糖尿病小鼠摄食量的影响结果见附图4;对STZ诱导2型糖尿病小鼠脾指数、胰腺指数及胸腺指数的影响。

脾指数：脾是免疫器官，其指数增大说明其分泌的免疫因子增多，机体的免疫力增加。从表4中可以看出，模型组小鼠的脾指数低于其他实验组，且与空白组呈显著性差异；而AF高剂量组与模型组相比较，脾指数有所降低，没有显著性差异；阳性药、AF低剂量组与模型组之间有显著性差异，它们分别增加了38.6%、23.2%。

胰腺指数：模型组的胰腺指数值高于其他任一实验组的胰腺指数值，除阳性药组外，其余各组小鼠的胰腺指标与模型组之间无显著性差异，阳性药与模型组之间呈显著性差异，其胰腺指数值降低了23.1%（见表5）。

胸腺指数：胸腺也是机体的一个重要的免疫器官，其指数增大则免疫力增强。模型组的胸腺指数低于其他任一组小鼠的胸腺指标，与空白组之间有显著性的差异。其余各实验组小鼠的胸腺指数虽都高于模型组小鼠的胸腺指数，但与模型组而言，均无显著性差异（见表6，附图5）。

表4AF对2型糖尿病小鼠脾指数的影响

分组	脾指数（mg/kg）	S.D.
			正常组	10.16	1.97
模型组	6.52^#	1.11
			阳性药	9.04^*	1.71
高剂量	6.21	0.86
			低剂量	8.03^*	2.66

表5AF对2型糖尿病小鼠胰腺指数的影响

分组	胰腺指数（mg/kg）	S.D.
			正常组	4.86	1.27
模型组	6.03^#	1.06
			阳性药	4.64^*	0.83
高剂量	5.17	1.41
			低剂量	5.40	1.02

表6AF对2型糖尿病小鼠胸腺指数的影响

分组	胸腺指数(mg/kg)	S.D.
			正常组	1.1	0.35
模型组	0.82^#	0.26
			阳性药	0.96	0.41
高剂量	0.85	0.26
			低剂量	0.93	0.39

4讨论

有文献报道，应用健康大鼠观察了AFG与AF有降低餐后血糖的作用，但是AF对2型糖尿病大鼠或小鼠的空腹血糖以及餐后血糖是否有作用，并没有实验证明。本实验研究发现，AF低剂量具有明显的降糖效果，其葡萄糖耐量实验发现，AF低剂量的糖耐量AUC相对于模型组而言明显降低（P<0.05）。这就表明AF具有开发为抗糖尿病新药的潜力。

实验例4精氨酸单糖苷（AF）对2型糖尿病小鼠血液指标的作用

给药4周后，各小鼠眼球取血置于1.5ml的离心管中，在3500r/min的条件下离心10min，取其血清，依照高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇（TC）、甘油三酯(TG)试剂盒上的说明，点样于96孔板中，在一定的波长条件下，用酶标仪测定，最后计算小鼠血清中HDL-C、LDL-C、TC、TG的水平。

实验数据处理

实验结果

1.AF对2型糖尿病小鼠血脂指标的影响，如表7所示。

模型组小鼠的TC、TG均高于其他各实验组小鼠的TC和TG的指标，而HDL-C的指标则明显低于正常组。

就TC而言，与模型组相比较，阳性药降了35.83%，有极显著性差异；AF低剂量则降低了24.77%，与模型组有显著性的差异，而AF高剂量虽降低了8.4%，但其与模型组之间无显著性的差异。

各实验组小鼠的TG与模型组相比，都有所下降，阳性药、AF高、低剂量组分别降低了20%、13.3%、24.4%，但是与模型组之间无显著性的差异，所以，AF对2型糖尿病小鼠血清中的TG影响不明显。

模型组的高密度脂蛋白胆固醇为1.98，低于空白组和其他实验组，阳性药、AF高、低剂量组分别升高了17.6%、18.9%、26.9%；除AF低剂量外，其余两组与模型组相比，没有显著性的差异；而AF低剂量较模型组而言，有显著性的差异（p﹤0.05）。

表7AF对2型糖尿病小鼠血脂指标的影响（n=8）

组名	TC	TG	HDL-C
				空白组	3.08±0.71	0.30±0.13	3.83±0.25
阳性药	3.42±0.78**	0.36±0.10	2.80±0.13
				模型组	5.33±1.28	0.45±0.09	2.38±0.26
AF高剂量	4.88±1.84	0.39±0.25	2.83±0.19
				AF低剂量	4.01±1.01*.	0.34±0.12	3.02±0.32*

注：“#”和“##”分别表示与空白对照组相比较差异显著（P<0.05）和（P<0.01）；“*”和“**”表示与模型对照组相比较差异显著（P<0.05）和（P<0.01）

2.AF对2型糖尿病小鼠血清中SOD、MDA的影响

AF对STZ诱导的2型糖尿病小鼠的抗氧化能力，如附图6所示，由附图6可知：模型组小鼠体内的SOD明显低于其他各实验组，并且与正常组比较呈极显著性差异；相对于模型组而言，阳性药及AF高、低剂量组都有所升高，升高值分别为36.73%、18.85%、23.83；其中，阳性药与模型组之间呈极显著性差异，AF低剂量组与模型组之间则呈显著性差异。

MDA是体内自由基发生氧化后的最终产物，其含量越多，说明体内自由基氧化的程度越高。由附图7可知：模型组小鼠血清中的MDA明显高于其余各实验组，并且与空白对照组比较呈现极显著性差异；而其他各实验组与模型组相比，阳性药呈现极显著性差异，AF低剂量组则与模型组之间比较差异显著，但高剂量组差异不明显。与模型组比较，这三组小鼠血清内的MDA分别降低了45.09%、15.50%、18.78%。

实验例5精氨酸单糖苷（AF）对小鼠酒精肝损伤的修复作用

1材料与方法

1.1实验材料、仪器

红星二锅头56度，北京红星股份有限公司；HC-2517高速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司；DK-98-1型电热恒温水浴锅，天津泰斯特仪器有限公司；连续光谱扫描式酶标仪SpectraMaxPlus384美国分子生物仪器公司；

1.2实验试剂、药品

联苯双酯滴丸，浙江医药股份有限公司新昌制药厂，批号091103；水飞蓟；无水乙醇，北京化工厂；超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、考马斯亮蓝、丙二醛（MDA）试剂盒、丙氨酸转氨酶（ALT）试剂盒、天冬氨酸转氨酶（AST）试剂盒都购于南京建成生物工程研究所；甘油三酯试剂盒购于浙江东瓯诊断产品有限公司。

1.3实验动物

ICR雄性小鼠，购自吉林大学白求恩医学院动物实验中心，体重18-20g；合格证号：SCXK-（吉）2007-0003。

1.4动物实验

取健康ICR雄性小鼠80只，先适应性喂养1周，给予普通的小鼠饲料和洁净的水，适应期间让其自由摄食饮水。适应期过后将小鼠按体重随机平均分成8组，每组10只：Ⅰ组为正常对照组（空白组）；Ⅱ组为酒精肝损伤模型组；Ⅲ组为水飞蓟组（阳性对照组1），给予150mg·kg-1的水飞蓟素；Ⅳ联苯双酯组（阳性对照组2），给予150mg·kg-1的联苯双酯；Ⅴ为精氨酸对照组，给予20mg·kg-1的L-精氨酸；Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ组分别为精氨酸衍生物AF高、中、低剂量治疗组，分别给予30、50、100mg·kg-1，用生理盐水溶解所有药物，超声助溶。本实验采用灌胃给药，空白组和模型组灌胃等体积的生理盐水，其他给药组根据体重按0.01mL·g-1的剂量给予相应药物，每天上午灌胃1次，连续给药7天。在给药第6天晚上8点开始禁食不断水，次日上午末次给药1h后，除空白组外，其余各组按12ml·kg-1剂量灌胃56度红星二锅头造成急性酒精肝损伤。12h后，眼球取血，分离血清后放于4℃冰箱保存备用，测定血清中谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性及甘油三酯（TG）浓度。劲椎脱臼将小鼠处死，立即进行解剖取肝脏和脾脏，称重，将肝脏用液氮急冻处理，然后用锡纸包埋储藏于-80冰箱备用。取小鼠肝脏0.4g左右，按重量比1:9加生理盐水进行肝匀浆制成10%匀浆液备测；取少许10%的肝匀浆液，用冷生理盐水稀释成1%的肝匀浆液备测。按试剂盒说明测定10%肝组织中MDA含量和1%肝匀浆中SOD活性。

1.5统计学处理

数据使用SPSS软件进行统计学分析，运用比较均值中的单因素ANOVA方差分析处理数据，数据结果用平均值±标准偏差（M±SE）表示，P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有极显著性差异。

2.结果

2.1小鼠行为情况观察

小鼠在酒精灌胃后，约在5-20min内各组均出现了醉酒现象，小鼠表现症状为四肢瘫软无力，呼吸逐渐开始加重，心率加速，行为不成直线等现象。约30min后模型组的所有小鼠率先进入昏睡状态，翻正反射消失，进入深度醉酒状态。其他各组也相继进入深度醉酒状态。在此期间观察发现，各组小鼠中有个别出现口腔流唾液现象。

2.2精氨酸衍生物（AF）对小鼠体重的影响

计算了一周内小鼠的平均体重的增长，由附图8可以看到模型组与空白组体重增长最快，分别增长了2.5g和2.4g，其次就是水飞蓟组与L-精氨酸组分别增长了2.2g和1.9g，其他几组也都在增长，但是增长比较缓慢。

2.3精氨酸衍生物（AF）对小鼠饮食饮水的影响

在给药期间，每天检测各个小组的饮食饮水量，无异常情况。如表8为每日各组小鼠平均饮食量。表9为每日各组小鼠平均饮水量

表8各组小鼠平均饮食量

单位	空白组	模型组	水飞蓟组	联苯双酯组	L-精氨酸组	低剂量组	中剂量组	高剂量组
									g	49.02	47.95	49.71	41.84	49	45.36	42.66	42.91

表9各组小鼠平均饮水量

单位	空白组	模型组	水飞蓟组	联苯双酯组	L-精氨酸组	低剂量组	中剂量组	高剂量组
									ml	63.38	60.67	56.73	55.46	62.55	57.65	55.68	52.28

从表8、9中可以看到空白组与模型组的饮水与饮食量均比较多，其次是L-精氨酸组还有水飞蓟组，AF高剂量组与联苯双酯组的饮食与饮水量最少。

2.4精氨酸衍生物（AF）对小鼠血清ALT、AST活性及TG的影响

从附图9、10、11可以清楚看到模型组的ALT、AST、TG均远高于空白组，说明使用一次大剂量酒精冲击可以复制急性酒精肝损伤。与模型组相比较，两个阳性药组水飞蓟组与联苯双酯组均能显著降低TG浓度以及ALT、AST活性，并具有统计学意义。两个阳性药相比差别不大，但从数据来说，联苯双酯对降低TG浓度以及ALT活性较水飞蓟作用要更好。精氨酸衍生物（AF）的低剂量、中剂量、高剂量对ALT、AST、TG均有降低作用，且有显著性，其中中剂量要比其他两组剂量作用更好。另外L-精氨酸组对这三者也有降低作用，且效果显著。

2.5精氨酸衍生物（AF）对小鼠肝匀浆中SOD活性及MDA浓度的影响

从附图12、13可以看出，与正常对照组相比，模型组的SOD活性极显著降低（P＜0.01），而MDA浓度显著升高（P＜0.05），说明造模成功。给药的各组与模型组相比，结果显示：两组阳性药组水飞蓟组与联苯双酯组都能降低酒精造成的肝损伤，其中水飞蓟组能显著降低MDA浓度（P＜0.05），SOD活性得到升高，但无统计学意义；联苯双酯组极显著升高了SOD的活性（P＜0.01），使其趋于正常值，同时也能降低了肝脏中MDA的浓度，但无统计学意义；L-精氨酸组对

肝脏中MDA的降低有显著性（P＜0.05），但对SOD无统计学意义。精氨酸衍生物(AF)各组也均对酒精性肝损伤有作用，低剂量能显著降低MDA值（P＜0.01），升高SOD值（P＜0.05）；中剂量组能显著降低肝脏中MDA（P＜0.05），对升高SOD有极显著性（P＜0.01）；高剂量组能显著降低MDA（P＜0.05），对升高SOD无统计学意义。

2.6讨论

酒精对肝脏的损失的机理尚未完全明确，目前公认的是在饮用大量高浓度的酒精后，乙醇被胃肠系统吸收进入血液，然后90%以上的乙醇就进入肝脏的微粒体中进行代谢，其中代谢中产物为乙醛，而后被氧化为乙酸，进而使NADH/NAD⁺比率增大。代谢过程中P450被激活，进而产生大量的活性氧簇^[23,24]，因大量产生使体内的氧化平衡体系破坏，导致氧化应激。同时，某些自由基会与细胞膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，会使肝细胞膜的结构和功能受到损伤,使细胞膜通透性改变，导致肝细胞内的转氨酶大量进入血液中，会使血清中转氨酶含量增多，其中就以天门冬氨基转移酶（AST）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）为主，因此通过检测血清中的这两个指标，用来检查肝脏细胞是不是受到损伤^[25]。而甘油三酯也是检测酒精肝损伤的一个特征性指标，乙醇在肝脏的代谢过程中，会使NADH/NAD+比率发生失调，进而使脂肪酸的氧化以及甘油三酯的转运受到抑制，所以直接表现为血清中的甘油三酯含量升高。

从实验结果显示，各个剂量的AF治疗组与模型组比较，均能降低血清中的ALT和AST活性及TG浓度，综合三个指标，低剂量组与中剂量的效果要比高剂量组有显著性。说明精氨酸衍生物(AF)对肝脏细胞的细胞膜有一定的保护作用。

MDA是脂质过氧化反应的产物，MDA浓度的高低可以直接反映肝脏细胞膜受自由基损坏的程度。SOD是存在于细胞内的天然氧自由基清除剂，具有平衡氧化和抗氧化系统的作用，阻止氧化应激的发生，SOD活性的高低反映了机体清除自由基的能力大小。从实验结果显示，酒精会极显著降低肝脏中SOD的活性，显著升高MDA的浓度。而各给药组对SOD和MDA均有一定的作用，AF的中剂量组对增强SOD活性的作用要强于低剂量组与高剂量组，说明精氨酸衍生物（AF）对肝损伤的保护作用无明显的剂量依赖性。AF低剂量组相比中、高剂量组对MDA浓度的影响较突出。从目前实验结果来看，L-精氨酸组与精氨酸衍生物的各组都具有不同程度的保护肝损作用，其相关机制需要进一步深入研究。

本实验的研究结果探索了精氨酸衍生物（AF）对急性酒精肝损伤的作用。主要是从抵抗氧化应激以及脂质过氧化方面入手，但是具体的途径以及结果怎需要我们更进一步的探索。

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说明书附图说明

图1.AF对糖尿病小鼠血糖的影响

注：##表示与空白组比较，呈极显著性差异，P﹤0.01；**表示与模型组比较，呈极显著性差异P﹤0.01；*呈显著性差异，P﹤0.05；

图2.AF对糖尿病小鼠糖耐量的影响

图3.AF对糖尿病小鼠饮水量的影响

图4.AF对糖尿病小鼠摄食量的影响

图5.AF对糖尿病小鼠胸腺指数的影响：##表示与空白组比较，呈极显著性差异，P﹤0.01；**表示与模型组比较，呈极显著性差异P﹤0.01；*呈显著性差异，P﹤0.05；

图6AF对2型糖尿病小鼠血清中SOD的影响

图7AF对2型糖尿病小鼠血清中MDA的影响

图8一周内各组小鼠平均体重增长

图9AF对血清ALT的影响

注：^*代表与模型组相比，差异显著（P＜0.05），^**代表与模型组相比，差异极

显著(P＜0.01)。

图10AF对血清AST的影响

显著(P＜0.01)。

图11AF对血清TG的影响

注：^*代表与模型组相比，差异显著（P＜0.05），^**代表与模型组相比，差异极显著(P＜0.01)

图12AF对小鼠肝脏MDA的影响

显著(P＜0.01)。

图13AF对小鼠肝脏MDA的影响

显著(P＜0.01)。

具体实施方案

实施例1

取AF1g，加入注射用水100ml，制成针剂，每支1ml，含AF10mg。

实施例2

取AF1g，制成粉针剂针剂，每支含AF10mg。

实施例3

取AF1g，加入赋形剂药用环糊精9g，混合均匀，制粒，制得片剂，每片重0.1g，含AF10mg。

以上实验例可以更详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

Claims

1.精氨酸果糖苷（AF）具有预防治疗2型糖尿病以及预防治疗酒精肝损伤的作用,其制备方法，具体如下：将L-精氨酸与葡萄糖以1:2-4的质量比，置入2-8倍量的冰醋酸中，待二者充分溶解后，在温度60-80℃的条件下反应10-60分钟，反应完成后，在40℃以下条件下真空减压除去醋酸后，冷冻干燥，即得AF粗合成物；将AF粗合成物与硅胶混合均匀，上200-300目硅胶柱，70%乙醇洗脱，收集AF流份，真空低压浓缩，回收乙醇，冷冻干燥成粉末；将粉末溶于1-8倍量的0.2%的醋酸蒸馏水中，上聚丙烯酰胺凝胶柱，以0.2%的醋酸水溶液洗脱，再次收集AF流份，冷冻干燥即得AF纯品。

2.精氨酸果糖苷（AF）可明显的降低2型糖尿病小鼠的空腹血糖，可用于治疗2型糖尿病,控制病人的空腹血糖和提高糖耐量。

3.精氨酸果糖苷（AF）可明显的降低2型糖尿病小鼠的饮水量和摄食量，可用于改善糖尿病患者多饮、多食症状。

4.精氨酸果糖苷（AF）可明显降低2型糖尿病小鼠血液中的中性脂肪、总胆固醇，对于高密度脂蛋白有明显的提升作用，精氨酸果糖苷（AF）可明显降低2型糖尿病小鼠血液中的SOD酶有明显的提升作用，MDA酶有明显的降下作用，可以作为调节血脂的药物。

5.精氨酸果糖苷（AF）可明显改善酒精肝损伤小鼠血液各项指标，对肝脏具有明显的保护作用，可开发保肝药物。