CN105085500B - 同时提取分离广金钱草中三种黄酮碳苷化合物单体的方法和系统 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种从广金钱草中同时提取分离三种黄酮碳苷化合物单体的方法，所称化合物单体为夏佛塔苷、木犀草素‑6‑C‑β‑D‑吡喃葡萄糖‑8‑C‑β‑吡喃木糖苷和Vicenin‑2，该方法包括以下步骤：利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物；利用醇体系对所述提取物进行多级色谱分离，其中包括，利用第一醇体系对提取物进行第一色谱分离，获得第一分离部分，利用第二醇体系对第一分离部分进行第二色谱分离，按照检测峰的出现顺序依次获得上述三种化合物单体。本发明还提供一种实施上述方法的系统。利用本发明的方法和/或系统从广金钱草中同时分离提取三种黄酮碳苷化合物单体，工艺操作简单、生产时间短，产品收率高、纯度高。
Description
技术领域
本发明属于植物化学技术领域，涉及一种植物中多种单体化合物的同时提取分离的方法和系统，具体的，本发明涉及从广金钱草中提取分离三种黄酮碳苷化合物单体的方法和系统。
背景技术
广金钱草为豆科山蚂蝗属植物Desmodium styracifolium(Osbeck)Merr.，其药用部位为干燥地上部分，主要化学成分为黄酮、皂苷、多糖、生物碱等化合物。具有清热除湿，利尿通淋之功效。用于热淋、沙淋、石淋、小便涩痛、水肿尿少、黄疸尿赤、尿路结石。
夏佛塔苷(Schaftoside)也称为6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖洋芹素，为黄色结晶性粉末；分子式：C26H28O14；分子量：564；图1显示其化学结构式。作为广金钱草及其相关药品质量控制用的夏佛塔苷(Schaftoside)对照品，系供中国药典2010版一部广金钱草项下鉴别和含量测定用，含量以92.5％计，而且本品有引湿性，打开包装后需要一次使用完毕。因此由于夏佛塔苷为药典标准检测所需对照品，市场需求量较大。因此，现有提取分离夏佛塔苷的方法、以及提高夏佛塔苷的含量和纯度的纯化技术和系统亟待改进。
木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷，其结构式如图2所示，为黄色粉末；分子式：C26H28O15；分子量：580。该化合物存在于广金钱草药材中，作为广金钱草鉴别和含量测定用的对照品，以及广金钱草及其相关药物制剂如广金钱草总黄酮胶囊的质量控制用。现有提取分离图2所示化合物的方法和系统亟待改进。
Vicenin-2也叫6,8-二-C-葡萄糖基芹菜素，为黄色粉末；分子式：C27H30O15；分子量：594；图3显示其化学结构式。Vicenin-2存在于广金钱草药材中，作为广金钱草鉴别和含量测定用的对照品，以及广金钱草及其相关药物制剂如广金钱草总黄酮胶囊的质量控制用。现有提取分离Vicenin-2的方法和系统亟待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中的技术问题至少之一或者提出一种商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种从广金钱草中同时提取分离多种黄酮碳苷类化合物单体的方法和系统，利用该提取分离方法和系统得到的夏佛塔苷、木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷和Vicenin-2，含量高、纯度高，有利于作为广金钱草及其相关药品的质量控制。
依据本发明的一方面，本发明提供一种从广金钱草中同时提取分离三种黄酮碳苷化合物单体的方法，该方法包括以下步骤：利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物；利用醇体系对所述提取物进行多级色谱分离，其中包括，利用第一醇体系对所述提取物进行第一色谱分离，获得第一分离部分，利用第二醇体系对所述第一分离部分进行第二色谱分离，按照检测峰的出现顺序依次获得第二分离部分-1、第二分离部分-2和第二分离部分-3，所述第二分离部分-1包括所述夏佛塔苷，所述第二分离部分-2包括所述木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷，所述第二分离部分-3包括所述Vicenin-2。
本发明的该方法，利用多级色谱分离，包括组合利用大孔树脂纯化技术和中压制备，采用醇-水体系，从广金钱草提取物中同时分离提取广金钱草中的三种黄酮碳苷类化合物单体，工艺操作简单、生产时间短，产品收率高、纯度高，能够获得HPLC纯度达到98％以上的夏佛塔苷和Vicenin-2，以及纯度达93％的木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷，获得的夏佛塔苷、木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷和Vicenin-2都可作为广金钱草鉴别和含量测定用的化学对照品。该工艺步骤以及各个步骤的参数条件，是发明人综合考虑、多次调整试验大孔树脂色谱和反相中压色谱的组合及其各自的洗脱条件对广金钱草中的三种目标化合物的分离纯化效果的影响而确定下来的，该提取纯化过程不涉及毒性相对强的有机溶剂，提取分离操作过程及提取物都安全可靠。
图4显示本发明的一个实施例中的同时提取分离广金钱草中的图1-3所示化合物的方法的步骤流程图。根据本发明的实施例，上述本发明一方面的同时提取分离三种黄酮碳苷化合物单体的方法，还可以具有以下技术特征至少之一：
根据本发明的一个实施例，如图5所示，所述利用醇体系对所述提取物进行多级色谱分离，还包括：利用第三醇体系对所述第二分离部分-2和所述第二分离部分-3分别进行第三色谱分离，以对应获得第三分离部分-2和第三分离部分-3，所述第三分离部分-2包括所述木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷，所述第三分离部分-3包括所述Vicenin-2；以进一步提高获得的产物中的木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷或Vicenin-2的纯度。在本发明的一个实施例中，所述第三醇体系为纯甲醇，所述第三色谱为凝胶色谱，较佳的为葡聚糖凝胶色谱Sephadex G-50，能够明显提高获得的木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷和Vicenin-2的纯度，其中前者的纯度可提高至93％以上，后者的纯度可提高至98％以上。
根据本发明的一个实施例，所述利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物，包括：利用浓度50-95％的乙醇对所述广金钱草进行两次回流提取，合并两次回流提取所得的提取液，获得合并提取液，除去所述合并提取液中的乙醇，和/或除去所述合并提取液中的乙醇和离子，以及任选的，进行干燥，以获得所述提取物。两次浓度为50-95％乙醇回流提取获得提取物，是发明人经过多次试验摸索确定的，既能充分利用原料也能节省时间，利于规模化生产制备；去除提取液中的乙醇和/或离子，利于排除它们对后续分离纯化的干扰。
根据本发明的一个实施例，所述两次回流提取，其中一次的乙醇和广金钱草的重量比为12:1，回流提取的时间为1.5h-3h，任选的为2h，另一次的乙醇和广金钱草的重量比为10:1，回流提取的时间为1h-2h，任选的为1.5h。回流时，浓度为50-95％乙醇和广金钱草的比例以及回流时间，是发明人经过多次试验检测确定的，能够使原料得到高效提取。
根据本发明的一些实施例，所述第一醇体系为乙醇-水体系，该乙醇-水体系中的乙醇的浓度为30-35％，较佳的，所述乙醇-水体系中的乙醇的浓度为30％，所述第一色谱为大孔树脂。该乙醇-水洗脱体系中乙醇的浓度是发明人结合后续色谱分离条件、多次试验检测洗脱下来的峰中的目标单体的比例，经过多次调整优化确定的。在本发明的一个实施例中，所选用的为AB-8大孔树脂，三种目标化合物单体都主要存在于利用乙醇-水混合溶剂30/70～35/65梯度洗脱下来的分离部分中，其中以利用乙醇-水混合溶剂30/70梯度洗脱下来的分离部分中的三种目标化合物单体的总含量最高。
根据本发明的一些实施例，所述第二醇体系为乙醇-水体系，该乙醇-水体系中的乙醇的浓度为8-30％，较佳的，为10-30％。所述第二色谱为反向色谱，较佳的，选择的反向色谱为反向中压色谱，更佳的，选择C18柱，其柱压为1-20bar，优选的柱压为1-10bar。该反向色谱的类型、柱压以及乙醇-水洗脱体系中的乙醇浓度是发明人结合其对第一分离部分中三种目标成分各自的比例的影响，多次试验优化确定的，利于在简单操作和短时间内，同时收率高、纯度高的获得三种目标化合物单体。
根据本发明的一个实施例，所述利用第二醇体系对所述第一分离部分进行第二色谱分离，包括：利用乙醇浓度为a的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行等度洗脱25-40min，接着换用乙醇浓度为[a,b]的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行梯度洗脱180-250min，按检测峰的出现顺序分别收集，以依次获得所述第二分离部分-1、第二分离部分-2和第二分离部分-3，其中，a的取值范围为8-18％，b的取值范围为20-30％。先利用一个浓度的乙醇-水体系等度洗脱，再进行梯度洗脱，能够提高分离提取效率；等度洗脱和梯度洗脱的乙醇浓度或浓度范围，以及洗脱时间，是发明人考虑收率、时间、回收的分离部分的复杂度、分离部分中三种目标成分各自的比例等，多次试验确定下来的。
根据本发明的另一个实施例，如图6所示，所述利用第二醇体系对第一分离部分进行第二色谱分离，所述利用第二醇体系对第一分离部分进行第二色谱分离，包括：利用乙醇浓度为c的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行等度洗脱30min，接着换用乙醇浓度为[c,d]的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行梯度洗脱200min，按检测峰的出现顺序分别收集，以依次获得初级第二分离部分-1、初级第二分离部分-2和初级第二分离部分-3；利用乙醇浓度为e的乙醇-水体系分别对所述初级第二分离部分-1、初级第二分离部分-2和初级第二分离部分-3进行等度洗脱30min，接着分别换用乙醇浓度为[e,f]的乙醇-水体系进行梯度洗脱200min，按检测峰的出现顺序分别收集，以对应获得所述第二分离部分-1、第二分离部分-2和第二分离部分-3，其中，c和e的取值范围为8-18％，d和f的取值范围为20-30％，e>c，d≥f。前后两次，都先利用一个浓度的乙醇-水体系等度洗脱，再进行梯度洗脱，能够提高分离提取三种化合物单体的效率；前后两次的等度洗脱和梯度洗脱的乙醇浓度或浓度范围以及各自的洗脱时间，是发明人结合考虑两次等度-梯度洗脱的条件、收率、时间、回收的分离部分的复杂度、分离部分中三种目标成分各自的比例等，多次试验优化确定的，利于在简单操作和短时间内，同时获得相对高收率和高纯度的三种化合物单体。在本发明的一个较佳实施例中，c＝10％，e＝15％，d＝30％，f＝25％，能够使最终获得的夏佛塔苷的HPLC纯度达到98％以上，且同时使其它两种化合物单体的纯度达85％以上。
依据本发明的另一方面，本发明提供一种从广金钱草中同时提取分离三种黄酮碳苷化合物单体的方法，所述三种化合物单体为夏佛塔苷、木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷和Vicenin-2，该系统能够用以实施上述本发明一方面或者任一实施例中的同时提取分离三种化合物的方法，该系统包括：回流提取装置，用以利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物；色谱分离装置，用于利用醇体系对所述提取物进行多级色谱分离，其包括，第一色谱分离单元，与所述回流提取装置相连，用于利用第一醇体系对所述提取物进行第一色谱分离，获得第一分离部分，第二色谱分离单元，与所述第一色谱分离单元相连，用于利用第二醇体系对所述第一分离部分进行第二色谱分离，按照检测峰的出现顺序依次获得第二分离部分-1、第二分离部分-2和第二分离部分-3，所述第二分离部分-1包括所述夏佛塔苷，所述第二分离部分-2包括所述木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷，所述第二分离部分-3包括所述Vicenin-2。图7显示本发明的一个实施例中的提取分离系统1000的结构，包括回流提取装置100和色谱分离装置200，色谱分离装置包括第一色谱分离单元202和第二色谱分离单元204。上述对本发明一方面的同时提取分离三种化合物的方法的技术特征和优点的描述，同样适用本发明这一方面的系统，在此不再赘述。本领域技术人员可以理解，该系统还能包括其它的装置、子装置或者功能单元来实施上述相应的实施例中的方法中的步骤。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为夏佛塔苷的化学结构式；
图2为木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷的化学结构式；
图3为Vicenin-2的化学结构式；
图4为本发明的一个实施例中的从广金钱草中同时提取分离三种化合物单体的方法的步骤流程图；
图5为本发明的一个实施例中的从广金钱草中同时提取分离三种化合物单体的方法的步骤流程图；
图6为本发明的一个实施例中的从广金钱草中同时提取分离三种化合物单体的方法的步骤流程图；
图7为本发明的一个实施例中的从广金钱草中同时提取分离三种化合物单体的系统的示意图；
图8为本发明的一个实施例中的从广金钱草中同时提取分离三种化合物单体的方法的步骤流程图；
图9为本发明一个实施例中的提取纯化产物夏佛塔苷的ESI-MS质谱图；
图10为本发明一个实施例中的提取纯化产物夏佛塔苷的H1-NMR谱图；
图11为本发明一个实施例中的提取纯化产物夏佛塔苷的C13-NMR谱图；
图12为本发明一个实施例中的提取纯化产物图2所示化合物的ESI-MS质谱图；
图13为本发明一个实施例中的提取纯化产物图2所示化合物的H1-NMR谱图；
图14为本发明一个实施例中的提取纯化产物图2所示化合物的C13-NMR谱图；
图15为本发明一个实施例中的提取纯化产物Vicenin-2的ESI-MS质谱图；
图16为本发明一个实施例中的提取纯化产物Vicenin-2的H1-NMR谱图；以及
图17为本发明一个实施例中的提取纯化产物Vicenin-2的C13-NMR谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行，例如选择了某种型号的色谱柱，可根据该型号色谱柱的说明或推荐，选用相应的洗脱速度/流速。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
图8显示本发明方法的一般流程，包括以下：
1、原料处理：选用豆科植物广金钱草45000-50000重量份，切成5-10cm小段，饮用水清洗掉泥沙，沥干，投料。
2、乙醇提取：80％乙醇回流提取两次，第一次12倍量2h，第二次10倍量1.5h；合并两次醇提液，回收乙醇至无醇味。
3、减压浓缩：提取浓缩液加水稀释至药材重量的5倍体积；200目滤布过滤；得上柱液；将事先用95％乙醇处理过的净品树脂装柱，纯化水替换；将上柱液用泵打入柱中，吸附，控制流速0.5-1倍BV/h，吸附完毕后，静置2h；用纯化水冲洗，洗脱流速3-4BV/h，洗脱量10BV；再用60％乙醇洗脱，洗脱流速2-3BV/h，洗脱量5BV；60％洗脱液合并，打入浓缩罐，回收乙醇至无醇味，至真空干燥箱中50-70℃干燥，得广金原料药300-400重量份。
4、多级色谱分离
(1)将广金原料药300-400重量份用AB-8大孔树脂色谱分离，即色谱分离I，乙醇-水混合溶剂20：80,30:70,40:60,60:40梯度洗脱，每个梯度冲到无颜色即可，合并各流份得20％，30％，40％，60％共四个部位。
(2)将色谱I得到的30％部位用ODS反相中压色谱分离，即色谱分离Ⅱ，具体的：用乙醇-水，条件为10％等度30min，10-30％梯度200min洗脱，按照色谱图出峰顺序，分份收集，每100-150体积份收集一份，共收集40-50个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份，按照3个主要出峰时间段，获得3个合并流份；分别将色谱分离Ⅱ得到的3个合并流份，进一步用ODS反相中压色谱分离，即色谱分离Ⅲ，用乙醇-水，条件为15％等度30min，15-25％梯度200min洗脱，按照色谱图出峰顺序，分份收集，每100-150体积份收集一份，共收集35-45个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份，对应获得三个合并流份。
(3)分别将上述对3各合并流份进行色谱分离Ⅲ得到的第30-35流份(第一合并份)、第25-32流份(第二合并份)和第25-35流份(第三合并份)合并，减压浓缩回收溶剂，至溶剂中有少量沉淀物析出即可停止浓缩。
对第一合并份进一步放置至析出沉淀，过滤，以丙酮100ml淋洗，即得到目标提取物-1，为淡黄色粉末，纯度达98％以上。分别对第二合并份和第三合并份进一步放置至析出沉淀，分别过滤得到目标提取物粗品-2和目标提取物粗品-3，纯度均达85％以上。
(4)任选的，分别用葡聚糖凝胶色谱Sephadex G-50对目标提取物粗品-2和3进行分离，即色谱分离Ⅳ：
将目标提取物粗品-2加入至甲醇-水(体积比为2:1)中，超声溶解，进样体积为10毫升，用纯甲醇冲柱，分份收集，每5体积份收集一份，共收集20-30个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份；色谱分离Ⅳ得到的第12-20流份合并，回收溶剂得到黄色粉末目标提取物-2。
将目标提取物粗品-3加入至甲醇-水(体积比为1:1)中，超声溶解，进样体积为10毫升，用纯甲醇冲柱，分份收集，每5体积份收集一份，共收集20-30个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份；色谱分离Ⅳ得到的第10-22流份合并，回收溶剂得到黄色粉末目标提取物-3。
5、结构鉴定
(1)经电喷雾电离质谱(ESI-MS)和光谱法(H1-NMR和C13-NMR)对得到的目标提取物-1淡黄色粉末进行鉴定，结合ESI-MS、H1-NMR和C13-NMR信息推断该化合物的分子式为C26H28O14，确定本发明所述从广金钱草中提取分离出的淡黄色粉末为夏佛塔苷。经HPLC纯度检验，纯度达到98％以上，可作为广金钱草鉴别和含量测定用的化学对照品。
图9显示夏佛塔苷的电喷雾电离质谱的质谱图，显示夏佛塔苷中各成分的分子量，主成分的分子量为ESI-MS m/z:565[M+H]+。
图10显示夏佛塔苷的H1-NMR谱图，H1-NMR(DMSO，600HZ)δ：13.82(5-OH),8.10(2H,d,J＝8.4Hz,H-2’,6’),6.92(2H,d,J＝8.4Hz,H-3’,5’),6.82(1H,s,H-3)。
图11显示夏佛塔苷的C13-NMR谱图，C13-NMR(DMSO，125HZ)δ:163.9(C-2),102.3(C-3),182.3(C-4),161.0(C-5),108.4(C-6)，159.9(C-7),104.3(C-8),154.3(C-9),103.5(C-10),121.2(C-1’),128.9(C-2’6’),116.0(C-3’5’),161.2(C-4’),74.6(C-1”of Ara)，68.6(C-2”of Ara)，75.0(C-3”of Ara)，68.8(C-4”of Ara)，70.5(C-5”of Ara)，73.6(C-1”’ofGlc)，70.8(C-2”’of Glc)，78.6(C-3”’of Glc)，70.2(C-4”’of Glc)，81.4(C-5”’of Glc)，60.8(C-6”’of Glc)。其中Ara代表阿拉伯糖，Glc代表葡萄糖。
(2)经电喷雾电离质谱(ESI-MS)和光谱法(H1-NMR和C13-NMR)对得到黄色粉末目标提取物-2进行鉴定，结合ESI-MS、H1-NMR和C13-NMR谱图信息推断该化合物的分子式为C26H28O15，确定本发明所述从广金钱草中提取分离出的该黄色粉末为木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷，经HPLC纯度检验，纯度达到93％以上，作为广金钱草鉴别和含量测定用的对照品，以及广金钱草及其相关药物制剂如广金钱草总黄酮胶囊的质量控制用。
图12为图2所示化合物进行电喷雾电离质谱的质谱图，显示黄色粉末中各成分的分子量，主成分分子量为ESI-MS m/z:581[M+H]+。
图13显示图2所示化合物的H1-NMR谱图，H1-NMR(DMSO，400HZ)δ：13.75(5-OH),6.91(1H,d,J＝8.3Hz,H-5’),7.45(1H,dd,J＝8.3,2.0Hz,H-6’),7.41(1H,d,J＝2.0Hz,H-2’),6.70(1H,s,H-3)。
图14显示图2所示化合物的C13-NMR谱图，C13-NMR(DMSO，100HZ)δ:164.1(C-2),102.7(C-3),182.2(C-4),161.2(C-5),108.3(C-6),163.9(C-7),93.5(C-8),156.3(C-9),103.6(C-10),121.4(C-1’),113.9(C-2’),145.7(C-3’),149.8(C-4’),115.8(C-5’),119.0(C-6’),73.9(C-1”of Glc)，70.5(C-2”of Glc)，78.9(C-3”of Glc)，69.9(C-4”of Glc)，81.2(C-5”of Glc)，60.1(C-6”of Glc),74.8(C-1”’of Xyl)，71.6(C-2”’of Xyl)，78.1(C-3，”of Xyl)，70.6(C-4”’of Xyl)，69.4(C-5”’of Xyl)。其中所述Xyl代表木糖，Glc代表葡萄糖。
(3)经电喷雾电离质谱(ESI-MS)和光谱法(H1-NMR和C13-NMR)对得到黄色粉末目标提取物-3进行鉴定，结合ESI-MS、H1-NMR和C13-NMR谱图信息推断该化合物的分子式为C27H30O15，确定上述从广金钱草中分离提取的该黄色粉末为Vicenin-2，经HPLC纯度检验，纯度达到98％以上，可作为广金钱草鉴别和含量测定用的对照品，以及广金钱草及其相关药物制剂如广金钱草总黄酮胶囊的质量控制用。
图15为对上述黄色粉末Vicenin-2进行电喷雾电离质谱的质谱图，显示黄色粉末中各成分的分子量，主成分分子量为ESI-MS m/z:595[M+H]+。
图16显示上述黄色粉末Vicenin-2的H1-NMR谱图，H1-NMR(DMSO，400HZ)δ：13.72(5-OH),8.01(2H,d,J＝8.4Hz,H-2’,6’),6.91(2H,d,J＝8.4Hz,H-2’,6’),6.79(1H,s,H-3)。
图17显示上述黄色粉末Vicenin-2的C13-NMR谱图，C13-NMR(DMSO，100HZ)δ:164.1(C-2),102.5(C-3),182.2(C-4),158.7(C-5),107.6(C-6),160.7(C-7),105.3(C-8),155.1(C-9),104.1(C-10),121.6(C-1’),128.9(C-2’6’),115.9(C-3’5’),161.2(C-4’),73.4(C-1-Glc)，71.0(C-2-Glc)，77.9(C-3-Glc)，69.1(C-4-Glc)，80.9(C-5-Glc)，59.8(C-6-Glc)，74.1(C-1-Glc)，71.9(C-2-Glc)，78.9(C-3-Glc)，70.5(C-4-Glc)，81.9(C-5-Glc)，61.3(C-6-Glc)，其中Glc代表葡萄糖。
实施例2
1、按照实施例1的步骤1-3进行，获得广金原料药。
2、多级色谱分离及鉴定
(1)将广金原料药300-400重量份用AB-8大孔树脂色谱分离，即色谱分离I，乙醇-水混合溶剂25:75，35:65，45:55，65:35梯度洗脱，每个梯度冲到无颜色即可，合并各流份得25％，35％，45％，65％共四个部位。
(2)将色谱I得到的35％部位用ODS反相中压色谱分离，即色谱分离Ⅱ，具体的：条件为8％等度30min，8-30％梯度200min洗脱，按照色谱图出峰顺序，分份收集，每100-150体积份收集一份，共收集40-50个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份，按照3个主要出峰时间段，获得3个合并流份；分别将色谱分离Ⅱ得到的3个合并流份，进一步用ODS反相中压色谱分离，即色谱分离Ⅲ，用乙醇-水，条件为12％等度30min，12-25％梯度200min洗脱，按照色谱图出峰顺序，分份收集，每100-150体积份收集一份，共收集35-45个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份，对应获得三个合并流份。
(3)分别将上述对3各合并流份进行色谱分离Ⅲ得到的第27-40流份(第一合并份)、第22-35流份(第二合并份)和第23-37流份(第三合并份)合并，减压浓缩回收溶剂，至溶剂中有少量沉淀物析出即可停止浓缩。
对第一合并份进一步放置至析出沉淀，过滤，以丙酮100ml淋洗，即得到目标提取物-1，为淡黄色粉末。利用电喷雾电离质谱(ESI-MS)和光谱法(H1-NMR和C13-NMR)对得到黄色粉末进行鉴定，鉴定其为夏佛塔苷，纯度小于等于93％。
分别对第二合并份和第三合并份进一步放置至析出沉淀，分别过滤得到目标提取物粗品-2和目标提取物粗品-3，纯度均约为80％。
(4)任选的，分别用葡聚糖凝胶色谱Sephadex G-50对目标提取物粗品-2和3进行分离，即色谱分离Ⅳ：
将目标提取物粗品-2加入至甲醇-水(体积比为2:1)中，超声溶解，进样体积为10毫升，用纯甲醇冲柱，分份收集，每5体积份收集一份，共收集20-30个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份；色谱分离Ⅳ得到的第12-20流份合并，回收溶剂得到黄色粉末目标提取物-2。利用电喷雾电离质谱(ESI-MS)和光谱法(H1-NMR和C13-NMR)对该处得到黄色粉末进行鉴定，鉴定黄色粉末为木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷，纯度为85％。
将目标提取物粗品-3加入至甲醇-水(体积比为1:1)中，超声溶解，进样体积为10毫升，用纯甲醇冲柱，分份收集，每5体积份收集一份，共收集20-30个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份；色谱分离Ⅳ得到的第10-22流份合并，回收溶剂得到黄色粉末目标提取物-3。利用电喷雾电离质谱(ESI-MS)和光谱法(H1-NMR和C13-NMR)对该处得到黄色粉末进行鉴定，鉴定黄色粉末为Vicenin-2，纯度为92％。
实施例3
1、按照实施例1的步骤1-3进行，获得广金原料药。
2、多级色谱分离及鉴定
(1)将广金原料药300-400重量份用AB-8大孔树脂色谱分离，即色谱分离I，乙醇-水混合溶剂20:80，30:70，40:60，60:40梯度洗脱，每个梯度冲到无颜色即可，合并各流份得20％，30％，40％，60％共四个部位。
(2)将色谱I得到的30％部位用ODS反相中压色谱分离，即色谱分离Ⅱ，具体的：用乙醇-水，条件为12％等度30min，12-30％梯度200min洗脱，按照色谱图出峰顺序，分份收集，每100-150体积份收集一份，共收集40-50个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份，按照3个主要出峰时间段，获得3个合并流份；
分别将色谱分离Ⅱ得到的3个合并流份，进一步用ODS反相中压色谱分离，即色谱分离Ⅲ，用乙醇-水，条件为18％等度30min，18-30％梯度200min洗脱，按照色谱图出峰顺序，分份收集，每100-150体积份收集一份，共收集35-45个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份，对应获得三个合并流份。
(3)分别将上述对3个合并流份进行色谱分离Ⅲ得到的第28-40流份(第一合并份)、第23-35流份(第二合并份)和第25-37流份(第三合并份)合并，减压浓缩回收溶剂，至溶剂中有少量沉淀物析出即可停止浓缩。
对第一合并份进一步放置至析出沉淀，过滤，以丙酮100ml淋洗，即得到目标提取物-1，为淡黄色粉末。利用电喷雾电离质谱(ESI-MS)和光谱法(H1-NMR和C13-NMR)对得到黄色粉末进行鉴定，鉴定其为夏佛塔苷，纯度小于等于90％。
分别对第二合并份和第三合并份进一步放置至析出沉淀，分别过滤得到目标提取物粗品-2和目标提取物粗品-3，纯度均约为80％。
(4)任选的，分别用葡聚糖凝胶色谱Sephadex G-50对目标提取物粗品-2和3进行分离，即色谱分离Ⅳ：
将目标提取物粗品-2加入至甲醇-水(体积比为2:1)中，超声溶解，进样体积为10毫升，用纯甲醇冲柱，分份收集，每5体积份收集一份，共收集20-30个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份；色谱分离Ⅳ得到的第12-20流份合并，回收溶剂得到黄色粉末目标提取物-2。利用电喷雾电离质谱(ESI-MS)和光谱法(H1-NMR和C13-NMR)对该处得到黄色粉末进行鉴定，鉴定黄色粉末为木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷，纯度为86％。
将目标提取物粗品-3加入至甲醇-水(体积比为1:1)中，超声溶解，进样体积为10毫升，用纯甲醇冲柱，分份收集，每5体积份收集一份，共收集20-30个流份，高效液相色谱检识后合并相同流份；色谱分离Ⅳ得到的第10-22流份合并，回收溶剂得到黄色粉末目标提取物-3。利用电喷雾电离质谱(ESI-MS)和光谱法(H1-NMR和C13-NMR)对该处得到黄色粉末进行鉴定，鉴定黄色粉末为Vicenin-2，纯度为90％。
实施例2和3的工艺条件生产出的不管是夏佛塔苷还是其它两种黄酮碳苷类化合物单体，纯度都明显低于实施例1中的同时分离提取的三种化合物的纯度。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (12)
1.一种从广金钱草中同时提取分离三种黄酮碳苷化合物单体的方法，所述三种黄酮碳苷化合物单体为夏佛塔苷、木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷和Vicenin-2，其特征在于，包括以下步骤：
利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物；
利用醇体系对所述提取物进行多级色谱分离，其中包括，
利用第一醇体系对所述提取物进行第一色谱分离，获得第一分离部分，所述第一醇体系为乙醇-水体系，所述乙醇-水体系中的乙醇的浓度为30-35％，第一色谱采用AB-8大孔树脂；
利用第二醇体系对所述第一分离部分进行第二色谱分离，按照检测峰的出现顺序依次获得第二分离部分-1、第二分离部分-2和第二分离部分-3，
所述第二分离部分-1包括所述夏佛塔苷，
所述第二分离部分-2包括所述木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷，
所述第二分离部分-3包括所述Vicenin-2，
其中，利用第二醇体系对所述第一分离部分进行第二色谱分离进一步包括：
利用乙醇浓度为a的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行等度洗脱25-40min，接着换用乙醇浓度为[a,b]的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行梯度洗脱180-250min，按检测峰的出现顺序分别收集，以依次获得所述第二分离部分-1、第二分离部分-2和第二分离部分-3，其中，
a的取值范围为8-18％，b的取值范围为20-30％，
第二色谱采用反相中压色谱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用醇体系对所述提取物进行多级色谱分离，还包括：
利用第三醇体系对所述第二分离部分-2和所述第二分离部分-3分别进行第三色谱分离，以对应获得第三分离部分-2和第三分离部分-3，
所述第三分离部分-2包括所述木犀草素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖-8-C-β-吡喃木糖苷，
所述第三分离部分-3包括所述Vicenin-2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第三醇体系为纯甲醇，所述第三色谱为凝胶色谱。
4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物，包括：
利用浓度50-95％的乙醇对所述广金钱草进行两次回流提取，合并两次回流提取所得的提取液，获得合并提取液，
除去所述合并提取液中的乙醇，和/或除去所述合并提取液中的乙醇和离子，以获得所述提取物。
5.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述利用乙醇对广金钱草进行回流提取，获得广金钱草提取物，包括：
利用浓度50-95％的乙醇对所述广金钱草进行两次回流提取，合并两次回流提取所得的提取液，获得合并提取液，
除去所述合并提取液中的乙醇，和/或除去所述合并提取液中的乙醇和离子，以及进行干燥，以获得所述提取物。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述两次回流提取，其中
一次的乙醇和广金钱草的重量比为12:1，回流提取的时间为1.5h-3h，
另一次的乙醇和广金钱草的重量比为10:1，回流提取的时间为1h-2h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述一次的乙醇和广金钱草的重量比为12:1，回流提取的时间为2h。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述另一次的乙醇和广金钱草的重量比为10:1，回流提取的时间为1.5h。
9.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述第一醇体系为乙醇-水体系，所述乙醇-水体系中的乙醇的浓度为30％。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反相中压色谱为C18柱，其柱压为1-20bar。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反相中压色谱为C18柱，其柱压为1-10bar。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用第二醇体系对第一分离部分进行第二色谱分离，包括：
利用乙醇浓度为c的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行等度洗脱30min，接着换用乙醇浓度为[c,d]的乙醇-水体系对所述第一分离部分进行梯度洗脱200min，按检测峰的出现顺序分别收集，以依次获得初级第二分离部分-1、初级第二分离部分-2和初级第二分离部分-3，
利用乙醇浓度为e的乙醇-水体系分别对所述初级第二分离部分-1、初级第二分离部分-2和初级第二分离部分-3进行等度洗脱30min，接着分别换用乙醇浓度为[e,f]的乙醇-水体系进行梯度洗脱200min，按检测峰的出现顺序分别收集，以对应获得所述第二分离部分-1、第二分离部分-2和第二分离部分-3，其中，
c和e的取值范围为8-18％，d和f的取值范围为20-30％，e>c，d≥f。
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