CN105085257B - 一种从紫茎泽兰中提取重绿原酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及天然产物化学技术领域，尤其涉及一种从紫茎泽兰中提取重绿原酸的方法，包括以下步骤：将紫茎泽兰用甲醇溶液浸泡，然后破壁浸提后过滤，将滤液浓缩得到提取物；随后用乙醚对提取物进行初次纯化；接着采用钙沉法得初提物；最后用乙酸乙酯对初提物进行萃取，收集有机层溶液，浓缩脱溶剂得重绿原酸。本发明制备工艺简单、成本低廉，能快速、高效的提取紫茎泽兰中的重绿原酸，且制得的重绿原酸含量高，适合工业化生产。

Description

一种从紫茎泽兰中提取重绿原酸的方法

技术领域

本发明涉及天然产物化学技术领域，尤其涉及一种从紫茎泽兰中提取重绿原酸的方法。

背景技术

紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum Spreng.)隶属于菊科(Compositae)泽兰属，为多年生、丛生状常绿半灌木植物，原产于中北美洲墨西哥、哥斯达黎加等地，19世纪曾作为观赏植物引种到欧洲，后来传入澳洲和亚洲，现广泛分布于热带、亚热带的多个国家和地区，是一种世界性入侵杂草，其抗逆性强、生态适应广、传播速度快、且群体自然繁殖与演替能力极强。在我国，紫茎泽兰现已蔓延到云南、贵州、四川等省市区，其入侵给蔓延区的农林牧副业和原有的自然生态系统造成了严重危害，是我国外来入侵物种中危害最为严重的植物之一；有鉴于此，各地在控制紫茎泽兰蔓延的同时，纷纷开展对其综合利用的研究，力图变废为宝。

现有文献(廖兴举.紫茎泽兰抑芽活性物质提取分离及鉴定[D].四川农业大学.2013)研究表明，紫茎泽兰能应用在马铃薯的贮藏上，并已从紫茎泽兰中提取到抑芽活性物质重绿原酸。重绿原酸是紫荆泽兰中的有效活性成分之一，其为单咖啡酰奎尼酸混合物的总称，是通过酚类代谢形成的咖啡酸和奎宁酸复合物。根据咖啡酰在奎尼酸的结合部位不同，单咖啡酰奎尼酸又分为绿原酸(3-咖啡酰奎尼酸)、隐绿原酸(4-咖啡酰奎尼酸)及新绿原酸(5-咖啡酰奎尼酸)。已经证实，重绿原酸具有多种潜在的治疗生物活性，包括抗炎活性、抗氧化活性、抗病毒活性、抗肿瘤活性和神经保护效应等，对消化系统、血液系统和生殖系统均有药理作用，具有较广泛的抗菌、利胆、止血及增高白血球数量的作用。现代科学对重绿原酸的药理活性研究已深入到食品、功能食品、医药和日化等多个领域中。

现有的重绿原酸提取工艺多以金银花和鱼腥草等为原料，采用水煎煮法、水提醇沉法和超临界CO₂萃取法等，前两者耗时较长，提取物中重绿原酸含量较少、产率低，能耗大、经济效益不高，且造成了资源的大量浪费；后者产率稍高，但成本高，不适于大规模应用于工业化生产。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种从紫荆泽兰中快速提取高纯重绿原酸的方法，该方法以紫茎泽兰为原料，快速、高效的提取紫茎泽兰中的重绿原酸，成本低廉、且重绿原酸产率高。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种从紫茎泽兰中提取重绿原酸的方法，包括以下步骤：

1)预处理：将所述紫茎泽兰粉碎或磨浆后，按料液比1∶10与体积分数为60％-80％的甲醇溶液混合，浸泡24-72h，破壁浸提后过滤，滤液浓缩脱去溶剂，得到提取物；

2)用乙醚对所述提取物进行初次纯化，并收集水层溶液；

3)钙沉法处理所述水层溶液得初提物；

4)用乙酸乙酯对所述初提物进行二次纯化，得所述重绿原酸。

较优地，所述紫茎泽兰为鲜样，未经任何干燥处理，所述紫茎泽兰粉碎后的平均粒度为400-600um。

较优地，步骤1)中，所述破壁浸提具体为将浸泡后的所述紫茎泽兰与甲醇的混合液超声提取，且所述破壁浸提(即超声提取)重复2-4次，每次超声20-30min；此外，超声抽提后的滤渣用大约5-7倍滤渣体积且体积分数为60％-80％的甲醇溶液洗涤，随后过滤，重复洗涤3-6次，最后将所有的滤液一起混合后，浓缩脱去溶剂(甲醇溶液)后得到膏状固体。

较优地，步骤2)中，所述初次纯化具体为取所述提取物复溶于水中，制成悬浊液，用乙醚萃取所述悬浊液，收集水层溶液；具体地，所述乙醚萃取重复3-6次，每次所述乙醚的添加量为所述悬浊液体积的1/3-1/2，用以更好的脱去提取物中的能溶于乙醚的杂质。

较优地，所述钙沉法具体为采用醋酸钙和/或碳酸钙进行沉淀得沉淀物，后对所述沉淀物采用稀硫酸进行脱钙，收集滤液，即得所述初提物。

较优地，所述沉淀物在脱钙之前还包括依次用水、甲醇洗涤所述沉淀物，用以洗去沉淀物中的醋酸钙和其他能溶于水、甲醇的杂质，以提高产物纯度。

较优地，所述二次纯化具体为用乙酸乙酯萃取所述初提物，收集有机层溶液，将所述有机层溶液浓缩脱溶剂得浓缩液，即得所述重绿原酸。

较优地，步骤4)中，所述乙酸乙酯萃取所述初提物重复3-6次，具体地，每次所述乙酸乙酯的添加量为所述水层溶液体积的1/3-1/2，直至将提取物完全从水层溶液中萃取出来，用以提高提取物的的产量。

较优地，步骤4)中，所述有机层溶液在浓缩脱溶剂之前还包括对所述有机层溶液除杂，具体地采用活性炭进行除杂，用以纯化提取物。

本发明在提取时将紫茎泽兰粉碎，增大了提取的表面积，有利于充分提取，提高提取率，提取过程中采用超声破壁辅助甲醇提取，提高了提取的效率。综上所述，本发明提取工艺简单、提取成本低廉，能快速、高效的提取紫茎泽兰中的重绿原酸，且制得的重绿原酸含量高，适合工业化生产；另外，本发明利用了紫茎泽兰作为原料，有效利用了资源，达到了变废为宝的目的。

附图说明

图1、本发明实施例3提取出来的重绿原酸的HPLC图；

图2、新绿原酸标准品的HPLC图；

图3、绿原酸标准品的HPLC图。

具体实施方式

下面对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明，以下实施例具体说明了紫茎泽兰提取重绿原酸的方法。

实施例1

1)首先取适量紫茎泽兰叶鲜样1kg，切碎后加入液氮研磨至粉末(粉末颗粒平均粒度为400-600um)，按料液比1∶10，将粉末与体积分数为70％的甲醇溶液混合，装入带塞棕色玻璃瓶中，在常温下浸泡24h；然后开塞后放入超声波清洗仪中超声20min，重复3次左右，辅助提取；随后使用布氏漏斗进行抽滤，并将滤渣放入滤渣6倍体积(可选5-7倍体积)的体积分数为70％的甲醇溶液中清洗后抽提，重复三次；随后合并所有的滤液，使用旋转蒸发仪在35℃，110mbar下旋蒸浓缩，回收甲醇溶液后得到褐色膏状物，即为分离的初始材料，可放入4℃冰箱中储存备用；

2)初次纯化，具体为：将褐色的膏状物复溶到适量的温水中溶解，制成悬浊液后，倒入分液漏斗中，同时向其中加入约为悬浊液1/2体积的乙醚与其混合，密封分液漏斗后，剧烈震荡，其混合液充分接触后，静置半小时后分层，放出有机层，继续用乙醚进行悬浊液的洗涤，重复洗涤至水层溶液为无色；

3)钙沉法提取，具体为：向水层溶液中加入过量醋酸钙直至出现沉淀，收集沉淀物，随后依次用水、甲醇洗涤沉淀物，最后加体积分数为5％的稀硫酸脱钙，收集滤液；

4)二次纯化，具体为：将步骤3中收集的滤液与约滤液1/3体积的乙酸乙酯一起放入分液漏斗中，密封震荡后静置2h，待水层与有机层充分分离后，将有机层溶液放出，继续向水层中加入乙酸乙酯萃取，重复3次左右直至水层为无色，最后合并收集所有的有机层溶液；随后向有机层溶液加入活性炭进行除杂，接着旋蒸浓缩脱去乙酸乙酯；即得产物1.7680g，低温干燥后-20℃冰箱保存，HPLC检测沉淀的纯度为89.9488％-95.6748％。

实施例2：

本实施例与实施例1的区别在于采用了紫茎泽兰叶鲜样及其处理方法，其具体操作步骤与实施例1大体相同，现陈述如下。

1)取适量紫茎泽兰叶鲜样1kg，切碎后加入榨汁机磨碎出浆，按料液比为1∶10，将浆液和滤渣与体积分数为70％的甲醇溶液混合，在常温下浸泡24h后；放入超声波清洗仪中超声25min，重复超声2-4次，辅助提取；随后用漏斗进行过滤，并将滤渣放入大约为滤渣5-7倍体积(优选6倍)的体积分数为70％的甲醇溶液中清洗后抽提，重复三次；随后合并所有的滤液，使用旋转蒸发仪在35℃，110mbar下旋蒸浓缩，回收甲醇溶液后得到褐色膏状物，即为分离的初始材料，可放入4℃冰箱中储存备用；

2)初次纯化：将褐色的膏状物复溶到适量的温水中溶解，制成悬浊液后，倒入分液漏斗中，同时向其中加入约为悬浊液1/2体积的乙醚与其混合，密封分液漏斗后，剧烈震荡，其混合液充分接触后，静置半小时后分层，放出有机层，继续用乙醚进行悬浊液的洗涤，重复洗涤3-6次至水层溶液为无色；

3)钙沉法提取：向水层溶液中加入过量碳酸钙沉淀，过滤收集沉淀物；随后依次用水、甲醇洗涤沉淀物，最后用稀硫酸脱钙，收集滤液；

4)二次纯化：将步骤3中收集的滤液与约滤液1/2体积的乙酸乙酯一起放入分液漏斗中，密封震荡后静置2h左右，待水层与有机层充分分离后，将有机层溶液放出，继续向水层中加入乙酸乙酯萃取，重复3次直至水层为无色，最后合并收集到的所有有机层溶液；随后向该有机层溶液加入活性炭除杂，旋蒸浓缩脱去乙酸乙酯；随后向浓缩后的浓缩液中加入氯仿进行沉淀，最后离心，得沉淀4.7582g，低温干燥后-20℃冰箱保存，HPLC检测产物沉淀的纯度93.6709％-96.6430％。

实施例3：

本实施例与实施例2的区别在于采用了紫茎泽兰地上部分茎叶鲜样，其具体操作步骤与实施例2大体相同，现陈述如下。

1)取适量紫茎泽兰地上部分鲜样1kg，切碎后加入榨汁机磨碎出浆，按料液比为1∶10，将浆液和滤渣与体积分数为70％的甲醇溶液混合，在常温下浸泡24h后；放入超声波清洗仪中超声30min，重复3次，辅助提取；随后使用布氏漏斗进行抽滤，并将滤渣放入滤渣6倍体积的体积分数为70％的甲醇溶液中清洗后抽提，重复3次；随后合并所有的滤液，使用旋转蒸发仪在35℃，110mbar下旋蒸浓缩，回收甲醇溶液后得到褐色膏状物，即为分离的初始材料，可放入4℃冰箱中储存备用；

2)初次纯化：具体为将褐色的膏状物复溶到适量的温水中溶解，制成悬浊液后，倒入分液漏斗中，同时向其中加入约为悬浊液1/3体积的乙醚与其混合，密封分液漏斗后，剧烈震荡，其混合液充分接触后，静置半小时后分层，放出有机层，继续用乙醚进行悬浊液的洗涤，重复洗涤多次至水层溶液为无色；

3)钙沉法提取：向水层溶液中加入过量醋酸钙沉淀，过滤收集沉淀物，随后向沉淀物中加入稀硫酸脱钙，收集滤液；

4)二次纯化：具体为将步骤3中收集的滤液与约滤液体积1/3的乙酸乙酯一起放入分液漏斗中，密封震荡后静置2h，待水层与有机层充分分离后，将有机层溶液放出，继续向水层中加入乙酸乙酯萃取，重复3次直至水层为无色，最后合并收集所有的有机层溶液；随后向有机层溶液加入活性炭除杂，接着旋蒸浓缩脱去乙酸乙酯；浓缩后向浓缩液中加入氯仿进行沉淀，离心，得沉淀5.3350g，低温干燥后-20℃冰箱保存，后进行产物检测。

其中产物检测(HPLC成分分析)时，具体采用如下参数，

流动相：甲醇-水体系，等度洗脱程序为30min，甲醇体积分数为60％；

检测波长：254nm、280nm、338nm，参比为600nm；

流速：0.5ml/min；

柱温箱温度：25℃；

单次上样量20μl；

色谱柱为Inertsil ODS-2151，4.6×250mm i.d，填充密度为5μm；

检测时，选取了三个波段进行检测，并同时对三个波段的检测结果进行了比较，图中B为Sig＝254nm，C为Sig＝280nm，E为Sig＝338nm。

检测结果，该提取物中重绿原酸的含量为95％以上，提取率为5.335mg/g(鲜样)，纯度为99.0014％-100％，且多次提取实验比较，上述提取条件下提取效果最佳。

上述实施例，只是本发明的较佳实施例，并非用来限制本发明实施范围，故凡以本发明权利要求所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括在本发明权利要求范围之内。

Claims (4)

1.一种从紫茎泽兰中提取重绿原酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)首先取适量紫茎泽兰叶鲜样1kg，切碎后加入液氮研磨至粉末，按料液比1∶10，将粉末与体积分数为70％的甲醇溶液混合，装入带塞棕色玻璃瓶中，在常温下浸泡24h；然后开塞后放入超声波清洗仪中超声20min，重复3次，辅助提取；随后使用布氏漏斗进行抽滤，并将滤渣放入滤渣5-7倍体积的体积分数为70％的甲醇溶液中清洗后抽提，重复三次；随后合并所有的滤液，使用旋转蒸发仪在35℃，110mbar下旋蒸浓缩，回收甲醇溶液后得到褐色膏状物，即为分离的初始材料，可放入4℃冰箱中储存备用；

2)初次纯化，具体为：将褐色的膏状物复溶到适量的温水中溶解，制成悬浊液后，倒入分液漏斗中，同时向其中加入约为悬浊液1/2体积的乙醚与其混合，密封分液漏斗后，剧烈震荡，其混合液充分接触后，静置半小时后分层，放出有机层，继续用乙醚进行悬浊液的洗涤，重复洗涤至水层溶液为无色；

3)钙沉法提取，具体为：向水层溶液中加入过量醋酸钙直至出现沉淀，收集沉淀物，随后依次用水、甲醇洗涤沉淀物，最后加体积分数为5％的稀硫酸脱钙，收集滤液；

4)二次纯化，具体为：将步骤3中收集的滤液与约滤液1/3体积的乙酸乙酯一起放入分液漏斗中，密封震荡后静置2h，待水层与有机层充分分离后，将有机层溶液放出，继续向水层中加入乙酸乙酯萃取，重复3次左右直至水层为无色，最后合并收集所有的有机层溶液；随后向有机层溶液加入活性炭进行除杂，接着旋蒸浓缩脱去乙酸乙酯；即得产物1.7680g，低温干燥后-20℃冰箱保存，HPLC检测沉淀的纯度为89.9488％-95.6748％。

2.根据权利要求1所述从紫茎泽兰中提取重绿原酸的方法，其特征在于：步骤1)中，将所述滤渣放入所述滤渣6倍体积的体积分数为70％的甲醇溶液中清洗后抽提。

3.一种从紫茎泽兰中提取重绿原酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取适量紫茎泽兰叶鲜样1kg，切碎后加入榨汁机磨碎出浆，按料液比为1∶10，将浆液和滤渣与体积分数为70％的甲醇溶液混合，在常温下浸泡24h后；放入超声波清洗仪中超声25min，重复超声2-4次，辅助提取；随后用漏斗进行过滤，并将滤渣放入滤渣5-7倍体积的体积分数为70％的甲醇溶液中清洗后抽提，重复三次；随后合并所有的滤液，使用旋转蒸发仪在35℃，110mbar下旋蒸浓缩，回收甲醇溶液后得到褐色膏状物，即为分离的初始材料，可放入4℃冰箱中储存备用；

2)初次纯化：将褐色的膏状物复溶到适量的温水中溶解，制成悬浊液后，倒入分液漏斗中，同时向其中加入约为悬浊液1/2体积的乙醚与其混合，密封分液漏斗后，剧烈震荡，其混合液充分接触后，静置半小时后分层，放出有机层，继续用乙醚进行悬浊液的洗涤，重复洗涤3-6次至水层溶液为无色；

3)钙沉法提取：向水层溶液中加入过量碳酸钙沉淀，过滤收集沉淀物；随后依次用水、甲醇洗涤沉淀物，最后用稀硫酸脱钙，收集滤液；

4)二次纯化：将步骤3中收集的滤液与约滤液1/2体积的乙酸乙酯一起放入分液漏斗中，密封震荡后静置2h，待水层与有机层充分分离后，将有机层溶液放出，继续向水层中加入乙酸乙酯萃取，重复3次直至水层为无色，最后合并收集到的所有有机层溶液；随后向该有机层溶液加入活性炭除杂，旋蒸浓缩脱去乙酸乙酯；随后向浓缩后的浓缩液中加入氯仿进行沉淀，最后离心，得沉淀4.7582g，低温干燥后-20℃冰箱保存，HPLC检测产物沉淀的纯度93.6709％-96.6430％。

4.一种从紫茎泽兰中提取重绿原酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取适量紫茎泽兰地上部分鲜样1kg，切碎后加入榨汁机磨碎出浆，按料液比为1∶10，将浆液和滤渣与体积分数为70％的甲醇溶液混合，在常温下浸泡24h后；放入超声波清洗仪中超声30min，重复3次，辅助提取；随后使用布氏漏斗进行抽滤，并将滤渣放入滤渣6倍体积的体积分数为70％的甲醇溶液中清洗后抽提，重复3次；随后合并所有的滤液，使用旋转蒸发仪在35℃，110mbar下旋蒸浓缩，回收甲醇溶液后得到褐色膏状物，即为分离的初始材料，可放入4℃冰箱中储存备用；

2)初次纯化：具体为将褐色的膏状物复溶到适量的温水中溶解，制成悬浊液后，倒入分液漏斗中，同时向其中加入约为悬浊液1/3体积的乙醚与其混合，密封分液漏斗后，剧烈震荡，其混合液充分接触后，静置半小时后分层，放出有机层，继续用乙醚进行悬浊液的洗涤，重复洗涤多次至水层溶液为无色；

3)钙沉法提取：向水层溶液中加入过量醋酸钙沉淀，过滤收集沉淀物，随后向沉淀物中加入稀硫酸脱钙，收集滤液；

4)二次纯化：具体为将步骤3中收集的滤液与约滤液体积1/3的乙酸乙酯一起放入分液漏斗中，密封震荡后静置2h，待水层与有机层充分分离后，将有机层溶液放出，继续向水层中加入乙酸乙酯萃取，重复3次直至水层为无色，最后合并收集所有的有机层溶液；随后向有机层溶液加入活性炭除杂，接着旋蒸浓缩脱去乙酸乙酯；浓缩后向浓缩液中加入氯仿进行沉淀，离心，得沉淀5.3350g，低温干燥后-20℃冰箱保存，对HPLC成分进行检测，具体采用如下参数：

流动相：甲醇-水体系，等度洗脱程序为30min，甲醇体积分数为60％；

检测波长：254nm、280nm、338nm，参比为600nm；

流速：0.5ml/min；

柱温箱温度：25℃；

单次上样量20μl；

色谱柱为Inertsil ODS-2151，4.6×250mm i.d，填充密度为5μm；

检测结果如下：该提取物中重绿原酸的含量为95％以上，提取率为5.335mg/g，纯度为99.0014％-100％。