CN105079873B - 一种医用钛合金及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种医用钛合金，包括铝钒钛合金和结合在所述铝钒钛合金表面的多孔涂层；所述多孔涂层包括羟基磷灰石和二氧化钛。本发明提供的医用钛合金表面有二氧化钛涂层，能够牢固的将钛合金和羟基磷灰石结合起来，能够提高钛材和骨之间的整合性。本发明还提供了一种医用钛合金的制备方法，本发明采用了微弧氧化法在钛合金表面生成的羟基磷灰石和二氧化钛的混合涂层不仅与钛材之间的结合更加牢固，并且还提高了钛材和骨之间的相容性，使得该医用钛合金植入体内后能够诱导新骨的生成，并于周围的骨组织形成牢固的、长期稳定的结合。

Description

一种医用钛合金及其制备方法

技术领域

本发明属于医疗器械领域，尤其涉及一种医用钛合金及其制备方法。

背景技术

目前，由创伤、骨折及骨质疏松症等疾病引起的骨缺损是临床面临的普遍问题，每年全球由数以百万计的硬组织植入体用于骨固定或功能性组织全置换。

钛及钛合金移植体，因为其出色的力学性质和良好的生物相容性，被广泛应用于骨修复等外科手术中，用于制作人工关节、骨内固定器材及骨重建材料等。但是，钛及钛合金材料本身缺乏生物活性，无诱导骨整合性能，用其制成的植入体植入体内后不能与周围骨组织形成牢固的、长期稳定的结合。若将其与骨以机械整合的方式结合，这种被动的方式将会引发炎症、移位，最终导致移植失败。因此，如何改善钛及钛合金材料与骨之间的结合，是一个亟需解决的问题。

发明内容

本发明提供一种医用钛合金及其制备方法，本发明提供的医用钛合金能够改善钛材与骨之间的结合，提高整合性。

本发明提供一种医用钛合金，包括铝钒钛合金和结合在所述铝钒钛合金表面的多孔涂层；

所述多孔涂层包括羟基磷灰石和二氧化钛；

所述多孔涂层的孔径为3～8μm。

优选的，所述铝钒钛合金为Al6V4Ti。

本发明提供一种医用钛合金的制备方法，包括以下步骤：

A)以铝钒钛合金为阳极，在第一电解液中进行微弧氧化，得到医用钛合金中间体，所述第一电解液由包括K₂SiO₃、Na₂O₂、NaF、CH₃COONa和Na₃VO₃的混合物和水配制得到；

B)以医用钛合金中间体为阳极，在第二电解液中进行微弧氧化，得到医用钛合金，所述第二电解液为包括Ca²⁺和PO₄ ^3-的水溶液。

优选的，所述步骤A)中阳极氧化电压为250～500V；

所述步骤A)中阳极氧化电流为0.5～2A/dm²。

优选的，以每升水计，所述第一电解液配制原料包括：

K₂SiO₃：5～10g/L，Na₂O₂：4～6g/L，NaF：0.5～1g/L，CH₃COONa：2～3g/L，Na₃VO₃：1～3g/L；

所述第一电解液的pH值为11～13。

优选的，所述步骤A)中微弧氧化的温度为20～50℃；

所述步骤A)中微弧氧化的时间为4～11min。

优选的，所述步骤B)中微弧氧化的温度为20～50℃；

所述步骤B)中微弧氧化的时间为10～20min。

优选的，所述步骤B)中阳极氧化电压为220V；

所述步骤B)中阳极氧化电流为0.5～2A/dm²。

优选的，所述第二电解液中Ca²⁺和PO₄ ^3-的摩尔比为(1～2)：1；

所述第二电解液的质量浓度为50～80g/L。

优选的，所述步骤B)后还包括：

采用激光对所述医用钛合金的表面进行处理，得到具有血管网络结构的医用钛合金。

本发明提供了一种医用钛合金，包括铝钒钛合金和结合在所述铝钒钛合金表面的多孔涂层；所述多孔涂层包括羟基磷灰石和二氧化钛。本发明提供的医用钛合金表面有二氧化钛涂层，能够牢固的将钛合金和羟基磷灰石结合起来，能够提高钛材和骨之间的整合性。

本发明还提供了一种医用钛合金的制备方法，本发明采用了微弧氧化法在钛合金表面生成羟基磷灰石和二氧化钛的混合涂层，不仅与钛材之间的结合更加牢固，并且还提高了钛材和骨之间的相容性，使得该医用钛合金植入体内后能够诱导新骨的生成，并于周围的骨组织形成牢固的、长期稳定的结合。

进一步的，本发明还可以根据不同部位所具有的不同形态的血管网络，在得到的医用钛合金表面采用激光雕刻的方法构建出血管网络图案，使得本发明提供的医用钛合金移植不同的部位时，能够使血管能够按照既定的图案生长，形成相应的血管网络，进一步提高医用钛合金和骨组织间的整合性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1得到的医用钛合金表面的扫描电镜图；

图2为本发明实施例1得到的医用钛合金表面涂层的XRD图；

图3为本发明实施例4得到的具有图案的医用钛合金的扫描电镜图片；

图4为本发明实施例5得到的具有图案的医用钛合金的扫描电镜图片；

图5为本发明实施例6～8得到的具有血管网络结构的医用钛合金的扫描电镜图片；

图6为本发明实施例6～8得到的具有血管网络结构的医用钛合金的细胞活性图；

图7为本发明实施例6～8得到的具有血管网络结构的医用钛合金上成骨细胞OPN的mRNA的相对表达量。

具体实施方式

本发明提供一种医用钛合金，包括铝钒钛合金和结合在所述铝钒钛合金表面的多孔涂层；

所述多孔涂层包括羟基磷灰石和二氧化钛；

所述多孔涂层的孔径为3～8μm。

本发明提供的医用钛合金包括铝钒钛合金，所述铝钒钛合金为医用钛合金的基体，优选为Al6V4Ti。所述铝钒钛合金采用普通市售商品即可。

本发明提供的医用钛合金包括结合在所述铝钒钛合金表面的多孔涂层，所述多孔涂层的成分为羟基磷灰石(HA)和二氧化钛，为HA/TiO₂的混合涂层，所述多孔涂层的孔径优选为3～8μm，更优选为4～7μm，最优选为5～6μm；所述多孔涂层的厚度优选为10～90μm，更优选为30～70μm，最优选为40～60μm。

本发明还提供了一种医用钛合金的制备方法，包括以下步骤：

A)以铝钒钛合金为阳极，在第一电解液中进行微弧氧化，得到医用钛合金中间体，所述第一电解液由包括K₂SiO₃、Na₂O₂、NaF、CH₃COONa和Na₃VO₃的混合物和水配制得到；

B)以医用钛合金中间体为阳极，在第二电解液中进行微弧氧化，得到医用钛合金，所述第二电解液为包括Ca²⁺和PO₄ ^3-的水溶液，所述Ca²⁺和PO₄ ^3-的的摩尔比为(1～2)：1。

本发明以铝钒钛合金为阳极，在第一电解液中进行微弧氧化，得到医用钛合金中间体，本发明优选以不锈钢、碳钢或镍为阴极材料，铝钒钛合金为阳极，在第一电解液中进行微弧氧化，得到医用钛合金中间体，得到的医用钛合金中间体为表面覆盖有微孔二氧化钛涂层的铝钒钛合金。在本发明中，所述铝钒钛合金优选为Al6V4Ti；所述阴极材料优选为不锈钢板；以每升水计，所述第一电解液的配制原料优选包括：K₂SiO₃：5～10g/L，Na₂O₂：4～6g/L，NaF：0.5～1g/L，CH₃COONa：2～3g/L，Na₃VO₃：1～3g/L，更优选包括K₂SiO₃：6～9g/L，Na₂O₂：5g/L，NaF：0.6～0.8g/L，CH₃COONa：2.5g/L，Na₃VO₃：2～2.5g/L。所述第一电解液的pH值优选为11～13，更优选为11.5～12.5，最优选为12。本发明对所述铝钒钛合金、不锈钢的来源没有特殊的限制，采用其市售商品即可。

在本发明中，在所述第一电解液中微弧氧化的阳极氧化电压优选为250～500V，更优选为300～450V，最优选为350～400V；阳极氧化电流优选为0.5～2A/dm²，更优选为1～1.5A/dm²；所述微弧氧化的时间优选为4～11min，更优选为5～10min，最优选为6～9min；所述微弧氧化的温度优选为20～50℃，更优选为25～45℃，最优选为30～40℃。本发明优选先将阳极氧化电压迅速上升至250～350V，优选上升至300V，并保持5～10s，然后再将阳极氧化电压上升至400～500V，优选上升至450V，电解4～11min，使铝钒钛合金表面生成牢固的、具有微孔的二氧化钛涂层，得到医用钛合金中间体。

本发明优选对所述医用钛合金中间体进行水洗，以去除其表面可能附着的杂质离子。

得到医用钛合金中间体后，本发明以医用钛合金中间体为阳极，在第二电解液中进行微弧氧化，得到医用钛合金，所述第二电解液为包括Ca²⁺和PO₄ ^3-的水溶液；本发明优选以不锈钢、碳钢或镍为阴极材料，以所述医用钛合金中间体为阳极，在第二电解液中进行微弧氧化，在二氧化钛涂层上在生成羟基磷灰石涂层，得到医用钛合金中间体。在本发明中，所述阴极材料优选为不锈钢板，所述第二电解液为包括Ca²⁺和PO₄ ^3-的水溶液，所述Ca²⁺和PO₄ ^3-的摩尔比优选为(1～2)：1，更优选为(1.2～1.8)：1，最优选为1.67:1；本发明对所述Ca²⁺和PO₄ ^3-的来源没有特殊的限制，具体的，在本发明的实施例中，可采用磷酸二氢钠和乙酸钙来提供Ca²⁺和PO₄ ^3-。在本发明中，所述第二电解液的质量浓度优选为50～80g/L，更优选为60～70g/L。

在本发明中，在所述第二电解液中微弧氧化的温度优选为20～50℃，更优选为25～45℃，最优选为30～40℃；微弧氧化的时间优选为10～20min，更优选为12～18min，最优选为15～17min；所述微弧氧化的阳极氧化电压优选为220V；所述微弧氧化的阳极氧化电流优选为0.5～2A/dm²，更优选为1～1.5A/dm²。

得到医用钛合金后，本发明优选采用双蒸水和丙酮对其进行清洗，本发明优选对所述医用钛合金清洗5～6次，每次10～15min。

本发明采用微弧氧化技术对钛合金基体进行表面处理，微弧氧化技术对钛种植体的合金成分要求不高。对种植体表面状态也要求不高，无需进行表面抛光处理。

微弧氧化电解液是获到合格膜层的技术关键。不同的电解液成分及氧化工艺参数，所得膜层的性质也不同。本发明采用特定成分以及配比的电解液对钛合金基体进行两次电解，使钛合金基体表面能够形成HA/TiO₂的混合涂层，并能够与钛合金基体牢固结合。

微弧氧化电压和电流密度的控制对获取合格膜层同样至关重要。在第一电解液中电解时，本发明在一开始以较快的速度上升阳极氧化电压，使钛合金表面快速形成一定厚度的二氧化钛涂层，达到微弧放电时，电压上升缓慢，使表面的二氧化钛涂层不断形成与完善。

与常规的钛阳极氧化不同，微弧氧化电解液的温度允许范围较宽，可在10～90℃条件下进行。但温度越高，钛合金与溶液界面的水气化越厉害，涂层的形成速度越快，但其粗糙度也随之增加。同时温度越高，电解液蒸发也越快，所以，本发明将微弧氧化电解液的温度控制在20～50℃范围内。

微弧氧化的电解时间越长，涂层的致密性越好，但其粗糙度也增加。本发明将时间控制在4～11min内，使其同时具有较好的致密性和表面性能。

在上述的微弧氧化过程中，本发明对所述微弧氧化的设备没有特殊的限制，采用常用的微弧氧化设备即可，具体的，本发明采用的微弧氧化设备包括微弧氧化电源设备、槽组部分、热交换和制冷设备。

微弧氧化电源设备是一种高压大电流输出的特殊电源设备，输出电压范围一般为0～600V；输出电流的容量视加工种植体的表面积而定，一般要求6～10A/dm²。电源要设置恒电压和恒电流控制装置，输出波形视工艺条件可为直流、方波、锯齿波等波形。

热交换和制冷设备。由于微弧氧化过程中种植体表面具有较高的氧化电压并通过较大的电解电流，使产生的热量大部分集中于膜层界面处，而影响所形成膜层的质量，因此微弧氧化必须使用配套的热交换制冷设备，使电解液及时冷却，保证微弧氧化在设置的温度范围内进行。可将电解液采用循环对流冷却的方式进行，既能控制溶液温度，又达到了搅拌电解液的目的。

在得到医用钛合金后，本发明优选在其表面进行激光处理，得到具有不同形态的血管网络结构的医用钛合金。本发明优选将医用钛合金表面涂覆石蜡，采用激光按照血管网络图案熔掉石蜡，露出医用钛合金表面的涂层，然后采用氢氟酸腐蚀所述医用钛合金的表面涂层，露出铝钒钛合金，得到具有血管网络结构的医用钛合金。

具体的，通过上述技术方案中微弧氧化法制备得到的医用钛合金表面的HA/TiO2混合涂层具有良好的耐磨性和耐腐蚀性。利用TiO2溶于HF溶液这一特性，在钛材表面涂层上覆盖一层不溶于HF的石蜡(石蜡厚度优选为500～1500μm，更优选为700～1000μm)。通过激光雕刻机依照设计的图案在石蜡上雕刻，由于激光的强度和停留时间可以控制，因此可以按照预先设计的图案熔掉石蜡，暴露出混合涂层。然后在体积浓度为0.5％的氢氟酸中进行腐蚀，暴露出的混合涂层被HF腐蚀，露出钛合金基材，从而形成图案。制备图案后的钛合金材最终在70～75℃的纯水中清洗五次，除去表面残留的石蜡，得到具有血管网络图案的医用钛合金。利用这一方法，本发明能够在钛材表面制备出具有规整形态的图案和模拟不同的血管构建不同的血管网络图案。在本发明中，所述激光的强度和停留时间可根据实际需要进行相应的调整，具体的，在本发明的实施例中，首先在coreldraw软件里面绘制出所要雕刻的不同宽度的血管网络图案，将绘制的图案导入激光雕刻机自带软件，采用40W的激光强度和1mm/sec的速度进行雕刻。

本发明提供了一种医用钛合金，包括铝钒钛合金和结合在所述铝钒钛合金表面的多孔涂层；所述多孔涂层包括羟基磷灰石和二氧化钛。本发明提供的医用钛合金表面有二氧化钛涂层，能够牢固的将钛合金和羟基磷灰石结合起来，能够提高钛材和骨之间的整合性。

本发明还提供了一种医用钛合金的制备方法，本发明采用了微弧氧化法在钛合金表面生成羟基磷灰石和二氧化钛的混合涂层，不仅与钛材之间的结合更加牢固，并且还提高了钛材和骨之间的相容性，使得该医用钛合金植入体内后能够诱导新骨的生成，并于周围的骨组织形成牢固的、长期稳定的结合。

进一步的，本发明还可以根据不同部位所具有的不同形态的血管网络，在得到的医用钛合金表面采用激光雕刻的方法构建出血管网络图案，使得本发明提供的医用钛合金移植不同的部位时，能够使血管能够按照既定的图案生长，形成相应的血管网络，进一步提高医用钛合金和骨组织间的整合性。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种医用钛合金及其制备方法进行详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1医用钛合金的制备

将5g K₂SiO₃、4g Na₂O₂、0.5g NaF、2g CH₃COONa和1g Na₃VO₃与1L水配制成电解液，pH为11。

以Al6V4Ti为阳极，不锈钢板为阴极，在上述电解液中以1A/dm²的阳极电流进行微弧氧化，温度为20℃；电解方式为先将阳极氧化电压迅速上升至300V，并保持10s，然后再将阳极氧化电压上升至450V，电解5min，使Al6V4Ti的表面生成牢固并有微孔的二氧化钛涂层，得到医用钛合金中间体。

以不锈钢板作为阴极，将经上述微弧氧化后的钛种植体作为阳极，水洗后在70g/L的含有Ca²⁺和PO₄ ^3-的水溶液(Ca²⁺和PO₄ ^3-的摩尔比为1.67)中以1A/dm²的阳极电流氧化15min，溶液温度为20℃，在二氧化钛涂层上生成羟基磷灰石涂层，得到医用钛合金。

对本实施例得到的医用钛合金进行扫描电镜检测，结果如图1所示，图1为本发明实施例1得到的医用钛合金表面的扫描电镜图，由图1可以看出，本实施例制得的医用钛合金表面形成了孔径5微米左右的微孔。

对本实施例得到的医用钛合金进行XRD检测，结果如图2所示，图2为本发明实施例1得到的医用钛合金表面涂层的XRD图，由图2可以看出，该涂层是含有羟基磷灰石和二氧化钛的混合涂层。

实施例2医用钛合金的制备

将20g K₂SiO₃、12g Na₂O₂、2g NaF、6g CH₃COONa和6g Na₃VO₃与2L水配制成电解液，pH为12。

以Al6V4Ti为阳极，不锈钢板为阴极，在上述电解液中以1.5A/dm²的阳极电流进行微弧氧化，温度为40℃；电解方式为先将阳极氧化电压迅速上升至300V，并保持5s，然后再将阳极氧化电压上升至450V，电解10min，使Al6V4Ti的表面生成牢固并有微孔的二氧化钛涂层，得到医用钛合金中间体。

以不锈钢板作为阴极，将经上述微弧氧化后的钛种植体作为阳极，水洗后在75g/L的含有Ca²⁺和PO₄ ^3-的水溶液(Ca²⁺和PO₄ ^3-的摩尔比为1.5)中以1.5A/dm²的阳极电流氧化15min，溶液温度为50℃，在二氧化钛涂层上生成羟基磷灰石涂层，得到医用钛合金。

实施例3医用钛合金的制备

将15g K₂SiO₃、10g Na₂O₂、1g NaF、5g CH₃COONa和5g Na₃VO₃与2L水配制成电解液，pH为12。

以Al6V4Ti为阳极，不锈钢板为阴极，在上述电解液中以1A/dm²的阳极电流进行微弧氧化，温度为30℃；电解方式为先将阳极氧化电压迅速上升至300V，并保持8s，然后再将阳极氧化电压上升至450V，电解8min，使Al6V4Ti的表面生成牢固并有微孔的二氧化钛涂层，得到医用钛合金中间体。

以不锈钢板作为阴极，将经上述微弧氧化后的钛种植体作为阳极，水洗后在70g/L的含有Ca²⁺和PO₄ ^3-的水溶液(Ca²⁺和PO₄ ^3-的摩尔比为2)中以1A/dm²的阳极电流氧化15min，溶液温度为30℃，在二氧化钛涂层上生成羟基磷灰石涂层，得到医用钛合金。

实施例4制备具有图案的医用钛合金

将实施例1制备得到的医用钛合金表面涂覆一层700μm厚的石蜡，然后采用激光雕刻机进行雕刻，激光强度40W，速度1mm/Sec，熔掉石蜡层，形成图案，将具有图案的医用钛合金使用体积浓度5％的氢氟酸溶液进行腐蚀，腐蚀掉钛合金表面的涂层，然后在70℃的水中洗去石蜡层，得到具有图案的医用钛合金。

对制得的具有图案的医用钛合金进行扫描电镜检测，结果如图3所示，图3为本发明实施例4得到的具有图案的医用钛合金的扫描电镜图片。

实施例5制备具有图案的医用钛合金

将实施例1制备得到的医用钛合金表面涂覆一层700μm厚的石蜡，然后采用激光雕刻机进行雕刻，激光强度40W，速度1mm/Sec，熔掉石蜡层，形成图案，将具有图案的医用钛合金使用体积浓度5％的氢氟酸溶液进行腐蚀，腐蚀掉钛合金表面的涂层，然后在70℃的水中洗去石蜡层，得到具有图案的医用钛合金。

对制得的具有图案的医用钛合金进行扫描电镜检测，结果如图4所示，图4为本发明实施例5得到的具有图案的医用钛合金的扫描电镜图片。由图4可见，本实施例制备的医用钛合金表面的图案为直径为200微米的圆形凹孔。

实施例6制备具有血管网络图案的医用钛合金

将实施例1制备得到的医用钛合金表面涂覆一层700μm厚的石蜡，然后采用激光雕刻机进行雕刻，激光强度40W，速度1mm/Sec，熔掉石蜡层，形成图案，将具有图案的医用钛合金使用体积浓度5％的氢氟酸溶液进行腐蚀，腐蚀掉钛合金表面的涂层，然后在70℃的水中洗去石蜡层，得到具有图案的医用钛合金。

对制得的具有图案的医用钛合金进行扫描电镜检测，结果如图5所示，图5为本发明实施例6～8得到的具有血管网络结构的医用钛合金的扫描电镜图片。图5中，a为本发明实施例6得到的具有血管网络结构的医用钛合金的扫描电镜图片(模拟人体小动脉，直径1mm)。

实施例7制备具有血管网络图案的医用钛合金

将实施例1制备得到的医用钛合金表面涂覆一层700μm厚的石蜡，然后采用激光雕刻机进行雕刻，激光强度40W，速度1mm/Sec，熔掉石蜡层，形成图案，将具有图案的医用钛合金使用体积浓度5％的氢氟酸溶液进行腐蚀，腐蚀掉钛合金表面的涂层，然后在70℃的水中洗去石蜡层，得到具有图案的医用钛合金。

对制得的具有图案的医用钛合金进行扫描电镜检测，结果如图5所示，图5为本发明实施例6～8得到的具有血管网络结构的医用钛合金的扫描电镜图片。图5中，b为本发明实施例7得到的具有血管网络结构的医用钛合金的扫描电镜图片(模拟人体肌肉动脉，直径3mm)。

实施例8制备具有血管网络图案的医用钛合金

将实施例1制备得到的医用钛合金表面涂覆一层700μm厚的石蜡，然后采用激光雕刻机进行雕刻，激光强度40W，速度1mm/Sec，熔掉石蜡层，形成图案，将具有图案的医用钛合金使用体积浓度5％的氢氟酸溶液进行腐蚀，腐蚀掉钛合金表面的涂层，然后在70℃的水中洗去石蜡层，得到具有图案的医用钛合金。

对制得的具有图案的医用钛合金进行扫描电镜检测，结果如图5所示，图5为本发明实施例6～8得到的具有血管网络结构的医用钛合金的扫描电镜图片。图5中，c为本发明实施例8得到的具有血管网络结构的医用钛合金的扫描电镜图片(模拟人体股动脉，直径5mm)。

实施例9生物活性评价

将成骨细胞接种到经过表面改性的钛种植体表面，以MTT法考察了钛种植体上成骨细胞的活性，进一步通过细胞电镜和免疫荧光染色，观察了细胞在不同基底表面的形貌，以说明成骨细胞在经过表面改性的钛种植体表面的粘附以及铺展情况。

主要试剂：

DMEM高糖培养基(美国Gibico公司)；碳酸氢钠(NaHCO3)(纯度99％，重庆东方化玻有限责任公司)；谷氨酰胺(纯度98.5％，美国Sigma公司)；氢氧化钠(NaOH)(纯度99％，重庆东方化玻有限责任公司)；准胎牛血清(美国Hyclone公司)；胰蛋白酶(美国Hyclone公司)；双抗(美国Hyclone公司)；PBS(美国Hyclone公司)；MTT(美国Sigma公司)；二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma公司)；对硝基苯磷酸(美国Sigma公司)；AMP(美国Sigma公司)；EDTA(重庆东方化玻有限责任公司)；氯化镁(纯度98％，重庆东方化玻有限责任公司)；硫酸锌(纯度99％，重庆东方化玻有限责任公司)；BCA试剂盒(碧云天)；TritonX-100(美国Sigma-Aldrich公司)；罗丹明-鬼笔环肽(美国Invitrogen公司)；Hoechst-33258(美国Sigma-Aldrich公司)戊二醛(纯度25％，重庆东方化玻有限责任公司)；氯仿(重庆东方化玻有限责任公司)；异丙醇(重庆东方化玻有限责任公司)。

主要设备：

pH计(PHS-3C，上海雷磁仪器厂)；超净工作台(上海博讯实业有限公司医疗仪器设备厂)；CO2培养箱(德国SHELLAB公司)；倒置相差显微镜(IX71型，美国OLYMPUS公司)；激光共聚焦显微镜(TCS-NT,德国Leica公司)；场发射扫描电镜(FE-SEM)EINova 400Nano SEM，荷兰Phillips公司)；Model 550酶标仪(美国Bio-RAD公司)；体式显微镜(MVX10，美国OLYMPUS公司)；摇床(华利达ZD-9556水平摇床)；水浴锅(江苏省金坛市环宇科学仪器厂)；DU640型紫外分光光度计(美国贝克曼库尔特公司)；移液枪(2、10、50、200μL，1mL)(大龙医疗设备有限公司)。

(1)DMEM高糖培养基的配置

1)将0.33g谷氨酸，1.5g NaHCO3，以及一包DMEM培养基粉末同时溶于适量三蒸水中，并定容至1L；

2)以稀盐酸调节培养基pH至7.2，4℃静置过夜；

3)滤器分别以二蒸水、三蒸水清洗烘干后，121℃灭菌30min，烘干备用；

4)以滤器过滤培养基，分别分装至无菌的100mL玻璃瓶中，90mL/瓶，保存于4℃冰箱，备用。

(2)成骨细胞原代培养

取初生SD乳鼠(三天以内)头盖骨，将头盖骨剪成1mm2的小块，均匀分布于培养瓶底面，将培养瓶倒置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中，过夜后正置，使培养液与骨片接触，每2天换新鲜的培养液，至细胞爬满大部分瓶壁。胰酶消化，将细胞吹散，并以差时贴壁法(10min)纯化细胞。细胞传至第三代可用于实验。

(3)细胞活性检测(MTT法)

用MTT法检测成骨细胞在普通钛片以及铺膜后的钛片上的活性，以表征相应钛基底的生物相容性。铺膜后的钛片，为消除壳聚糖组分中少量醋酸的影响，接种细胞前，浸泡于过滤除菌的0.1M的NaOH溶液15min，PBS清洗3次，15min/次。

将第三代成骨细胞分别接种至实施例6～8得到的具有血管网络结构的医用钛合金表面，接种浓度为1×104/孔。培养4天，7天后，分别更换1mL新鲜培养基(未添加血清)，按10％体积加入100μL MTT溶液(5mg/mL，过滤除菌)。细胞培养箱培养4h后，吸弃含MTT溶液的培养液，加入500μL二甲基亚砜(DMSO)溶解结晶物甲臜。充分溶解后，吸取200μL溶液加入96孔板中，测定其在490nm处的吸光值。结果如图6所示，图6为本发明实施例6～8得到的具有血管网络结构的医用钛合金的细胞活性图。图6中，(a)为培养4天后的细胞活性，(b)为培养7天后的细胞活性；TCPS为空白对照组，1mm为实施例6制得的具有血管网络结构的医用钛合金的成骨细胞活性；3mm为实施例7制得的具有血管网络结构的医用钛合金的成骨细胞活性；5mm为实施例8制得的具有血管网络结构的医用钛合金的成骨细胞活性。

由图6可以看出，当材料表面接种成骨细胞，在与细胞共培养4天后，与空白对照组(无钛合金材料组)对比，钛材表面构建的小动脉与对照组无差异。而空白对照组和小动脉组的细胞活性显著优于肌肉动脉组和股动脉组(P<0.05)。与成骨细胞共培养7天后，空白对照组、小动脉组、肌肉动脉组和股动脉组之间细胞活性无差异。

实施例10

将实施例9中得到的第三代成骨细胞分别接种至实施例6～8得到的具有血管网络结构的医用钛合金表面，采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)来表征。RT-PCR即在传统PCR反应体系中引入荧光，利用荧光信号积累实时监控整个扩增过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

将成骨细胞以初始密度为2×10⁴/孔接种于实施例6～8得到的具有血管网络结构的医用钛合金表面，培养7天和14天后，分别提取总RNA，反转录成cDNA，用于RT-PCR。PCR扩增所用的目的基因引物片段序列如下：

β-actin：5'-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC-3'，以及5'-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3'；

OPN：5'-CCTCTGAAGAAACGGATGACT-3'，以及5'-CTGTGTGTTTCCACGCTT-3'；

OC：5'-GAGGGCAGTAAGGTGGTGAA-3'及5'-CGTCCTGGAAGCCAATGTG-3'。

1)总RNA的提取

①吸弃细胞培养液，PBS清洗3次，2min/次，每个样品中加入200μL预冷的Tripure提取液，枪头反复吹打基底表面，使细胞充分裂解，收集裂解液于EP管中；

②向裂解液中加入200μL氯仿，剧烈震荡，室温下静置消化5min；

③4℃，12000g，离心15min，吸取上清液并转移至新的EP管中；

④向上述离心管中加入500μL异丙醇，轻轻晃动数次，使之混匀，消化10min；

⑤4℃，12000g，离心10min，管底会有白色沉淀出现，小心吸弃上清液；

⑥加入1mL75％乙醇溶液(Millipure水现配现用)，用移液枪轻轻吹打管底白色沉淀；

⑦4℃，7500g，离心5min，小心吸弃上清液；

⑧将EP管倒置于新的滤纸上，室温干燥15～20min；

⑨根据不同样品的沉淀量，选取适当体积的灭菌水溶解沉淀，并用紫外分光光度计测定RNA浓度。

2)反转录

①基因组DNA的消除反应

在PCR管中配制反应液：

上述各组提取的总RNA溶液，最大1.0μg

2号液：5×gDNA Eraser缓冲液，2.0μL

1号液：gDNA Eraser，1.0μL

用DEPC水将溶液总体积调至10.0μL

于PCR仪上进行基因组DNA的去除反应：42℃反应2min；反应完成后将样品立即置于冰上。

②反转录

在上述去除基因组DNA的PCR管中配置反应液：

上述去除基因组DNA的总RNA溶液，10.0μL

4号液：缓冲液2(for Real Time)，4.0μL

3号液：反转录酶MIX I，1.0μL

5号液：反转录引物MIX，1.0μL

用DEPC水将溶液总体积调至20.0μL

于PCR仪上进行反转录反应：37℃反应15min；85℃反应5s；4℃保温；将反转得到的cDNA于-20℃条件下贮存。

③定量PCR

荧光定量PCR反应体系：

SYBR-Green Realtime PCR Master Mix，12.5μL

前引物(10μmol/L)，1.0μL

后引物(10μmol/L)，1.0μL

cDNA模板，1.0μL

用DEPC水将溶液体积调至20μL

本文采用三步法进行扩增，扩增体系为98℃、3min，1个循环；98℃、10s，58℃、15s，72℃、10s，45个循环；98℃、1min，1个循环。溶解曲线的绘制：58℃，80个循环，每个循环升高0.5℃。

④定量数据处理

定量数据处理采用Pfaffl等的方法，即根据定量PCR每个样品所对应的Ct值(每个反应管内开始指数扩增时对应的循环数)，通过实时荧光曲线得到目的基因和内参基因的Ct值均一化校准，计算出同一个样品中目的基因与内参基因Ct值的差值，即△Ct＝Ct_目的基因-Ct_内参基因。计算样品与相应对照之间△△Ct值，即：△△Ct＝△Ct_处理-△Ct_对照，计算基因差异表达的倍数＝2^-△△Ct，即目的基因在样品中的表达是对照样品的2^-△△Ct倍。)

结果如图7所示，图7为本发明实施例6～8得到的具有血管网络结构的医用钛合金上成骨细胞OPN的mRNA的相对表达量。图7中，TCPS为空白组的OPN的相对表达量，1mm为本发明实施例6得到的具有血管网络结构的医用钛合金上OPN的相对表达量，3mm为本发明实施例7得到的具有血管网络结构的医用钛合金上OPN的相对表达量，5mm为本发明实施例7得到的具有血管网络结构的医用钛合金上OPN的相对表达量，**表示差异性极显著，p＜0.01。

在成骨细胞分化发育的不同阶段中，会表达大量特异性基因(Cbfa1、Osterix、OC)与非特异性基因(Coll-I、ALP、OPN、BSP)。本研究选取骨桥蛋白(OPN)作为研究对象。OPN是SIBLING家族的一种非胶原性蛋白，含有HA的结合域，在成骨细胞矿化的前期有重要的调节作用。图7中培养7天后，1mm、3mm和5mm组的OPN表达水平与空白组相比，分别上调1.9、2.2和2.6倍。说明培养7天后，改性后的钛材表面能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。在培养14天后，1mm、3mm和5mm组OPN水平的上调倍数分别为2.1、2.87和3.16倍。由于OPN是在矿化早期表达的蛋白，经过14天的培养，本发明实施例6～8提供的具有血管网络图案的医用钛合金的矿化程度比较完全，OPN表达含量有所下降。从OPN的mRNA相对表达水平，我们可以发现本发明实施例6～8提供的具有血管网络图案的医用钛合金能有效地促进成骨细胞的分化和矿化，有利于成骨细胞发挥其生物学功能。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种医用钛合金的制备方法，包括以下步骤：

A)以铝钒钛合金为阳极，在第一电解液中进行微弧氧化，得到医用钛合金中间体，所述第一电解液由包括K₂SiO₃、Na₂O₂、NaF、CH₃COONa和Na₃VO₃的混合物和水配制得到；

B)以医用钛合金中间体为阳极，在第二电解液中进行微弧氧化，得到医用钛合金，所述第二电解液为包括Ca²⁺和PO₄ ^3-的水溶液。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A)中阳极氧化电压为250～500V；

所述步骤A)中阳极氧化电流为0.5～2A/dm²。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，以每升水计，所述第一电解液包括：

K₂SiO₃：5～10g/L，Na₂O₂：4～6g/L，NaF：0.5～1g/L，CH₃COONa：2～3g/L，Na₃VO₃：1～3g/L；

所述第一电解液的pH值为11～13。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A)中微弧氧化的温度为20～50℃；

所述步骤A)中微弧氧化的时间为4～11min。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B)中微弧氧化的温度为20～50℃；

所述步骤B)中微弧氧化的时间为10～20min。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B)中阳极氧化电压为220V；

所述步骤B)中阳极氧化电流为0.5～2A/dm²。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第二电解液中Ca²⁺和PO₄ ^3-的摩尔比为(1～2)：1；

所述第二电解液的质量浓度为50～80g/L。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B)后还包括：

采用激光对所述医用钛合金的表面进行处理，得到具有血管网络结构的医用钛合金。