CN105073116A - 治疗非小细胞肺癌的egfr t790m 抑制剂与egfr 抑制剂的组合 - Google Patents

治疗非小细胞肺癌的egfr t790m 抑制剂与egfr 抑制剂的组合 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种通过给予与低剂量panHER抑制剂组合的表皮生长因子受体(EGFR)T790M抑制剂的组合来治疗非小细胞肺癌的方法。本发明亦涉及一种通过给予与EGFR抑制剂组合的不可逆EGFR？T790M抑制剂的组合来治疗非小细胞肺癌的方法。

Description

治疗非小细胞肺癌的EGFR T790M 抑制剂与EGFR 抑制剂的组合
技术领域
本发明涉及一种通过给予与低剂量panHER抑制剂组合的EGFRT790M抑制剂的组合来治疗非小细胞肺癌的方法。本发明亦涉及一种通过给予与EGFR抑制剂组合的不可逆EGFRT790M抑制剂的组合来治疗非小细胞肺癌的方法。
背景
非小细胞肺癌为全世界癌症死亡的首要原因，每年诊断出的新病例估计有140万。在肺腺癌(最常见的非小细胞肺癌形式)中，隐藏表皮生长因子受体(EGFR)突变的患者构成整个群体的10-30％之间。EGFR抑制剂，诸如厄洛替尼(erlotinib)或吉非替尼(gefitinib)可能最有效的就是对这部分患者(Paez等人的Science2004；Lynch等人的NEJM2004；Pao等人的PNAS2004)。与这些抑制剂的良好反应相关联的最常见的活化突变为外显子19内的缺失(例如，E746-A750)及活化环中的点突变(外显子21，特别为L858R)。迄今而仍以较低程度鉴定的额外的体细胞突变包括点突变：在外显子20中的G719S、G719C、G719A、L861和小插入(Shigematsu等人的JNCI2005；Fukuoka等人的JCO2003；Kris等人的JAMA2003；及Shepherd等人的NEJM2004)。
虽然这些物质可能是EGFR突变子群的有效治疗，但最初有反应的患者大部分发展出抗性。在约50％的患者中观察到的抗性的主要机制归因于第二突变(T790M)，此突变发生在看门基因苏氨酸残基上(Kosaka等人的CCR2006；Balak等人的CCR2006；及Engelman等人的Science2007)。
治疗非小细胞肺癌的改进疗法包含许多未满足的医学要求且需要鉴定新颖的组合方案以改进治疗结果。
发明概述
下文所述的每个实施方案可与本申请中所述的与所组合的实施方案不一致的任何其他实施方案组合。此外，本申请中所述的每个实施方案于其范围内预见本申请中所述的化合物的药学上可接受的盐。因此，短语“或其或它们的药学上可接受的盐”隐含在本申请中所述的所有化合物的说明中。
本申请中所述的一些实施方案涉及一种治疗非小细胞肺癌的方法，其包括将有效量的不可逆EGFRT790M抑制剂与有效量的EGFR抑制剂组合给予有此需要的患者。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述不可逆EGFRT790M抑制剂为1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的一些实施方案中，所述不可逆EGFRT790M抑制剂为N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-5-(吡啶-2-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)环丁基]丙-2-烯酰胺或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的特定实施方案中，所述不可逆EGFRT790M抑制剂为N-[反式-3-({5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氨基)环丁基]-N-甲基丙-2-烯酰胺或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述不可逆EGFRT790M抑制剂为1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(3-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的实施方案中，所述EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼(icotinib)、凡德他尼(vandetanib)、拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib)、阿法替尼(afatinib)、培利替尼(pelitinib)、达克替尼(dacomitinib)、卡纳替尼(canertinib)、西妥昔单抗(cetuximab)和帕尼单抗(panitumumab)，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、凡德他尼、拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的一些实施方案中，所述EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼和达克替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的特定实施方案中，所述EGFR抑制剂为吉非替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的一些实施方案中，所述EGFR抑制剂为厄洛替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的实施方案中，所述EGFR抑制剂为阿法替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的一些实施方案中，所述EGFR抑制剂为达克替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述EGFR抑制剂为可逆的EGFR抑制剂。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述可逆的EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、凡德他尼和拉帕替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的实施方案中，所述可逆的EGFR抑制剂为吉非替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述可逆的EGFR抑制剂为厄洛替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的额外实施方案中，所述EGFR抑制剂为不可逆EGFR抑制剂。
在本发明该方法的实施方案中，所述不可逆EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述不可逆EGFR抑制剂为阿法替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的一些实施方案中，所述不可逆EGFR抑制剂为达克替尼或其药学上可接受的盐。
本发明的一些实施方案涉及一种治疗非小细胞肺癌的方法，其包括将有效量的EGFRT790M抑制剂与panHER抑制剂组合给予有此需要的患者，其中所述panHER抑制剂系根据非标准临床给药方案给予。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述非标准临床给药方案为非标准临床剂量或非标准给药时程。
在本发明该方法的一些实施方案中，所述非标准临床给药方案为低剂量的panHER抑制剂。
在本发明该方法的实施方案中，所述非标准临床给药方案为间歇性给药方案。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述EGFRT790M抑制剂选自由下列物质组成的组：Go6976、PKC412、AP26113、HM61713、WZ4002、CO-1686和TAS-2913，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述EGFRT790M抑制剂为1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的实施方案中，所述EGFRT790M抑制剂为N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-5-(吡啶-2-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)环丁基]丙-2-烯酰胺或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的额外实施方案中，所述EGFRT790M抑制剂为N-[反式-3-({5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氨基)环丁基]-N-甲基丙-2-烯酰胺或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述EGFRT790M抑制剂为1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(3-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的一些实施方案中，所述panHER抑制剂选自由下列物质组成的组：拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的特定实施方案中，所述panHER抑制剂选自由下列物质组成的组：拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述panHER抑制剂为阿法替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的实施方案中，所述panHER抑制剂为达克替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述panHER抑制剂为不可逆EGFR抑制剂。
在本发明该方法的特定实施方案中，所述不可逆panHER抑制剂选自由下列物质组成的组：来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的实施方案中，所述不可逆panHER抑制剂为阿法替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的一些实施方案中，所述不可逆panHER抑制剂为达克替尼或其药学上可接受的盐。
本发明的特定实施方案涉及一种治疗非小细胞肺癌的方法，其包括将协同作用量的EGFRT790M抑制剂与EGFR抑制剂组合给予有此需要的患者。
在本发明该方法的一些实施方案中，所述EGFRT790M抑制剂选自由下列物质组成的组：Go6976、PKC412、AP26113、HM61713、WZ4002、CO-1686和TAS-2913，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述EGFRT790M抑制剂为1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的实施方案中，所述EGFRT790M抑制剂为N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-5-(吡啶-2-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)环丁基]丙-2-烯酰胺或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的特定实施方案中，所述EGFRT790M抑制剂为N-[反式-3-({5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氨基)环丁基]-N-甲基丙-2-烯酰胺或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的一些实施方案中，所述EGFRT790M抑制剂为1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(3-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、凡德他尼、拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼、卡纳替尼、西妥昔单抗和帕尼单抗，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的一些实施方案中，所述EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、凡德他尼、拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的特定实施方案中，所述EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼和达克替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的一些实施方案中，所述EGFR抑制剂为吉非替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的实施方案中，所述EGFR抑制剂为厄洛替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的一些实施方案中，所述EGFR抑制剂为panHER抑制剂。
在本发明该方法的进一步实施方案中，所述panHER抑制剂选自由下列物质组成的组：拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的实施方案中，所述panHER抑制剂选自由下列物质组成的组：拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的一些实施方案中，所述panHER抑制剂为阿法替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的额外实施方案中，所述panHER抑制剂为达克替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的额外实施方案中，所述panHER抑制剂为不可逆EGFR抑制剂。
在本发明该方法的一些实施方案中，所述不可逆panHER抑制剂选自由下列物质组成的组：来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该方法的实施方案中，所述不可逆panHER抑制剂为阿法替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该方法的特定实施方案中，所述不可逆panHER抑制剂为达克替尼或其药学上可接受的盐。
本发明的一些实施方案涉及(a)EGFRT790M抑制剂及(b)EGFR抑制剂的协同组合，其中组分(a)及组分(b)具有协同作用。
在本发明该组合的一些实施方案中，所述EGFRT790M抑制剂选自由下列物质组成的组：Go6976、PKC412、AP26113、HM61713、WZ4002、CO-1686和TAS-2913，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该组合的进一步实施方案中，所述EGFRT790M抑制剂为1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮或其药学上可接受的盐。
在本发明该组合的实施方案中，所述EGFRT790M抑制剂为N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-5-(吡啶-2-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)环丁基]丙-2-烯酰胺或其药学上可接受的盐。
在本发明该组合的额外实施方案中，所述EGFRT790M抑制剂为N-[反式-3-({5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氨基)环丁基]-N-甲基丙-2-烯酰胺或其药学上可接受的盐。
在本发明该组合的一些实施方案中，所述EGFRT790M抑制剂为1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(3-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮或其药学上可接受的盐。
在本发明该组合的一些实施方案中，所述EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、凡德他尼、拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼、卡纳替尼、西妥昔单抗和帕尼单抗，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该组合的实施方案中，所述EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、凡德他尼、拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该组合的实施方案中，所述EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼和达克替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该组合的特定实施方案中，所述EGFR抑制剂为吉非替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该组合的进一步实施方案中，所述EGFR抑制剂为厄洛替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该组合的一些实施方案中，所述EGFR抑制剂为panHER抑制剂。
在本发明该组合的进一步实施方案中，所述panHER抑制剂选自由下列物质组成的组：拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该组合的额外实施方案中，所述panHER抑制剂选自由下列物质组成的组：拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该组合的实施方案中，所述panHER抑制剂为阿法替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该组合的一些实施方案中，所述panHER抑制剂为达克替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该组合的实施方案中，所述panHER抑制剂为不可逆EGFR抑制剂。
在本发明该组合的额外实施方案中，所述不可逆panHER抑制剂选自由下列物质组成的组：来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼，或它们的药学上可接受的盐。
在本发明该组合的一些实施方案中，所述不可逆panHER抑制剂为阿法替尼或其药学上可接受的盐。
在本发明该组合的实施方案中，所述不可逆panHER抑制剂为达克替尼或其药学上可接受的盐。
附图简要说明
图1显示在RPC9克隆3和克隆6中经Sanger测序鉴定的C>TEGFRT790M突变，所示的百分比表示相对于总EGFR等位基因的经castPCR定量的EGFRT790M等位基因。
图2显示以不同浓度的达克替尼(图2A)或厄洛替尼(图2B)处理的PC9及RPC9克隆3和6在细胞生存力测定法中的剂量反应曲线。
图3显示在RPC9克隆6细胞生存力测定法中的剂量反应曲线。图3A显示单独及组合的化合物A(“compdA”)及达克替尼(“daco”)的剂量反应曲线。图3B显示单独及组合的化合物A及厄洛替尼(“erlo”)的剂量反应曲线。图3C显示作为单一药剂及与达克替尼和厄洛替尼组合的化合物A在选择的浓度下的抑制百分比。
图4显示在RPC9克隆6细胞生存力测定法中的剂量反应曲线。图4A显示单独及组合的化合物B(“compdB”)及达克替尼(“daco”)的剂量反应曲线。图4B显示单独及组合的化合物B及厄洛替尼(“erlo”)的剂量反应曲线。图4C显示作为单一药剂及与达克替尼和厄洛替尼组合的化合物B在选择的浓度下的抑制百分比。
图5显示在RPC9克隆6细胞生存力测定法中的剂量反应曲线。图5A显示单独及与达克替尼(“daco”)组合的化合物A(“compdA”)的剂量反应曲线。图5B显示单独及与吉非替尼(“gefi”)组合的化合物A的剂量反应曲线。图5C显示单独及与阿法替尼(“afat”)组合的化合物A的剂量反应曲线。图5D显示作为单一药剂及与达克替尼、吉非替尼和阿法替尼组合的化合物A在选择的浓度下的抑制百分比。
图6显示在RPC9克隆6细胞生存力测定法中的剂量反应曲线。图6A显示单独及与达克替尼(“daco”)组合的化合物B(“compdB”)的剂量反应曲线。图6B显示单独及与吉非替尼(“gefi”)组合的化合物B的剂量反应曲线。图6C显示单独及与阿法替尼(“afat”)组合的化合物B的剂量反应曲线。图4D显示作为单一药剂及与达克替尼、吉非替尼和阿法替尼组合的化合物B在选择的浓度下的抑制百分比。
图7显示在RPC9克隆6细胞中的EGFR、AKT和ERK的磷酸化程度的蛋白质免疫印迹法(Westernimmunoblot)。包括GAPDH作为蛋白加载对照物。图7A显示以DMSO、达克替尼、化合物A或达克替尼+化合物A(“compdA”)的组合处理的RPC9克隆6细胞。图7B显示以DMSO、厄洛替尼、化合物A或厄洛替尼+化合物A(“compdA”)的组合处理的RPC9克隆6细胞。
图8显示对以DMSO、达克替尼、化合物A或达克替尼(“daco”)+化合物A(“compdA”)的组合处理的RPC9克隆6细胞的蛋白质免疫印迹法的谱带(图7A)的光密度测定法结果。pEGFRY1068(图8A)、pAKTS473(图8B)及pERKT202/Y204(图8C)的抑制系通过与DMSO对照物比较而测定。
图9显示对以DMSO、厄洛替尼、化合物A或厄洛替尼(“erlo”)+化合物A(“compdA”)的组合处理的RPC9克隆6细胞的蛋白质免疫印迹法的谱带(图7B)的光密度测定法结果。pEGFRY1068(图9A)、pAKTS473(图9B)及pERKT202/Y204(图9C)的抑制系通过与DMSO对照物比较而测定。
图10显示在RPC9克隆6细胞中的EGFR、AKT和ERK的磷酸化程度的蛋白质免疫印迹法。包括GAPDH作为蛋白加载对照物。图10A显示以DMSO、达克替尼、化合物B或达克替尼+化合物B(“化合物B”)的组合处理的RPC9克隆6细胞。图10B显示以DMSO、厄洛替尼、化合物B或厄洛替尼+化合物B(“化合物B”)的组合处理的RPC9克隆6细胞。
图11显示对以DMSO、达克替尼、化合物B或达克替尼(“daco”)+化合物B(“化合物B”)的组合处理的RPC9克隆6细胞的蛋白质免疫印迹法的谱带(图10A)的光密度测定法结果。pEGFRY1068(图11A)、pAKTS473(图11B)及pERKT202/Y204(图11C)的抑制系通过与DMSO对照物比较而测定。
图12显示对以DMSO、厄洛替尼、化合物B或厄洛替尼(“erlo”)+化合物B(“化合物B”)的组合处理的RPC9克隆6细胞的蛋白质免疫印迹法的谱带(图10B)的光密度测定法结果。pEGFRY1068(图12A)、pAKTS473(图12B)及pERKT202/Y204(图12C)的抑制系通过与DMSO对照物比较而测定。
图13图示带有RPC9克隆6肿瘤的SCID小鼠的异种移植模式的结果，将所述小鼠随机化，每日且经口以介质、达克替尼、化合物A或达克替尼(“daco”)+化合物A(“compdA”)处理。图13A图示肿瘤体积，其每周测量3次且以平均值及该平均值的标准误差图示。图13B图示每组体重，其每日记录且百分比变化以平均值及该平均值的标准误差图示。
图14图示带有RPC9克隆6肿瘤的SCID小鼠的异种移植模式的结果，将所述小鼠随机化，每日且经口以介质、达克替尼、化合物B或达克替尼(“daco”)+化合物B(“化合物B”)处理。图14A图示肿瘤体积，其每周测量3次且以平均值及该平均值的标准误差图示。图14B图示每组体重，其每日记录且百分比变化以平均值及该平均值的标准误差图示。
图15图示带有RPC9克隆6肿瘤的SCID小鼠的异种移植模式的结果，将所述小鼠随机化，每日且经口以介质、达克替尼、化合物B或达克替尼(“daco”)+化合物B(“化合物B”)处理。图15A图示单一药剂处理组的肿瘤体积。图15B图示组合处理组的肿瘤体积。
图16图示带有RPC9克隆6肿瘤的SCID小鼠的异种移植模式的结果，将所述小鼠随机化，每日且经口以介质、厄洛替尼、化合物A或厄洛替尼(“erlo”)+化合物A(“compdA”)处理。图16A图示肿瘤体积，其每周测量3次且以平均值及该平均值的标准误差图示。图16B图示每组体重，其每日记录且百分比变化以平均值及该平均值的标准误差图示。
本发明的详细说明
人类表皮生长因子受体/表皮生长因子受体(HER/EGFR)家族受体的成员包括EGFR/HER-1、HER2/neu/erbB-2、HER3/erbB-3及HER4/erbB-4。
EGFR抑制剂有效地抑制EGFR的常见活化突变(L858R和delE746-A750)。常见的活化突变亦称为单突变体或单突变形式。EGFR抑制剂的实例包括吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、凡德他尼、拉帕替尼、来那替尼，阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼。EGFR的单克隆抗体抑制剂亦为本发明中所定义的EGFR抑制剂，诸如西妥昔单抗和帕尼单抗。
EGFR抑制剂可为可逆抑制剂或不可逆抑制剂。EFGR分子的酪氨酸激酶结构域的可逆抑制剂附着至受体且定期自受体脱离。吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、凡德他尼和拉帕替尼为可逆的EGFR抑制剂的实例。EFGR分子的酪氨酸激酶结构域的不可逆抑制剂不可逆地结合至EGFR。来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼为不可逆的EGFR抑制剂的实例。
EGFR抑制剂为HER家族的至少一个成员的抑制剂。吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼和凡德他尼为选择性EGFR/HER-1酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。西妥昔单抗和帕尼单抗为专一于EGFR/HER-1的单克隆抗体。
pan-HER抑制剂为阻断HER家族的多个成员的物质。拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼为pan-HER抑制剂的实例。拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼和培利替尼抑制HER家族的EGFR和HER2成员。达克替尼和卡纳替尼抑制HER家族的EGFR、HER2和HER4成员。
EGFRT790M抑制剂有效地抑制常见的活化突变(L858R和delE746-A750)及看门基因突变(T790M)。本发明的EGFRT790M抑制剂优先抑制EGFR的双突变形式(L858R/T790M和delE746-A750/T790M)更胜于单突变体(L858R和delE746-A750)。EGFRT790M抑制剂的实例包括Go6976、PKC412、AP26113、HM61713、WZ4002、CO-1686和TAS-2913。
EGFRT790M抑制剂可以为可逆抑制剂或不可逆抑制剂。Go6976、PKC412和AP26113为可逆的EGFRT790M抑制剂的实例。HM61713、WZ4002、CO-1686和TAS-2913为不可逆的EGFRT790M抑制剂的实例。
本发明的EGFRT790M抑制剂亦包括1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮(“化合物A”)、N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-5-(吡啶-2-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)环丁基]丙-2-烯酰胺(“化合物B”)、N-[反式-3-({5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氨基)环丁基]-N-甲基丙-2-烯酰胺(“化合物C”)；及1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(3-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮(“化合物D”)，或它们的药学上可接受的盐。化合物A、化合物B、化合物C及化合物D为不可逆的EGFRT790M抑制剂的实例。
在本文中可能使用了以下缩写：Ac(乙酰基)；APCI(原子压力化学电离)；Boc(叔丁氧基羰基)；Boc2O(二碳酸二叔丁酯)；BrettPhos钯环(氯[2-(二环己膦基)-3,6-二甲氧基-2’,4’,6’-三异丙基-1,1’-联苯][2-(2-氨基乙基)苯基]钯(II))；DCC(1,3-二环己基碳二亚胺)；DCM(二氯甲烷)；(三氟化双(2-甲氧基乙基)氨基硫)；DIAD(偶氮二羧酸二异丙酯)；DIEA(二异丙基乙胺)；DIPEA(N,N-二异丙基乙胺)；DMAP(4-二甲基氨基吡啶)；DMEM(杜贝可氏改良的伊格尔氏培养基(Dulbecco’smodifiedEagle’smedium))；DMF(二甲基甲酰胺)；DMSO(二甲亚砜)；DPPA(叠氮磷酸二苯酯(diphenylphosphorazidate))；EGTA([亚乙基双(氧基亚乙基次氨基)]四乙酸)；eq(当量)；Et(乙基)；EtOH(乙醇)；EtOAc(乙酸乙酯)；Et2O(二乙醚)；FBS(胎牛血清)；HATU(六氟磷酸2-(7-氮杂-1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓)；HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)；HMDS(双(三甲基硅基)胺，其亦称为六甲基二硅氮烷或六甲基二硅氧烷)；HOAc(乙酸)；HPLC(高效液相色谱法)；iPr(异丙基)；iPrMgCl(氯化异丙基镁)；iPrOH(异丙醇)；KHMDS(双(三甲基硅基)氨化钾)；LAH(氢化锂铝)；LCMS(液相色谱法-质谱法)；LiHMDS(双(三甲基硅基)氨化锂)；Me(甲基)；MeOH(甲醇)；MeCN(乙腈)；MTBE(甲基叔丁基醚)；N(标准)；N/A(未取得)；NaHMDS(双(三甲基硅基)氨化钠)；N/D(未测定)；NIS(N-碘琥珀酰亚胺)；NMM(N-甲基吗啉)；NMR(核磁共振)；Pd2(dba)3(三(二亚苯甲基丙酮)二钯(0))；PG(保护基)；Ph(苯基)；PhI(OAc)2(二乙酸碘苯)；PMSF(苯基甲基磺酰氟)；psi(磅/平方英吋)；Rf(保留因子)；RPMI(罗斯威尔帕克纪念研究所(RoswellParkMemorialInstitute))；rt(室温)；sat.(饱和)；SCX(强阳离子交换)；SEM(2-(三甲基硅基)乙氧基甲基)；SEM-Cl(2-(三甲基硅基)乙氧基甲基氯)；SFC(超临界流体色谱法)；TBAF(氟化四丁基铵)；TBDPS(叔丁基二苯基硅基)；TBS(叔丁基二甲基硅基)；t-BuXPhos钯环(氯[2-(二-叔丁膦基)-2’,4’,6’-三异丙基-1,1’-联苯][2-(2-氨基乙基)苯基)]钯(II)；TFA(三氟乙酸盐)；THF(四氢呋喃)；TLC(薄层色谱法)；甲苯(甲基苯)；甲苯磺酰基(对甲苯磺酰基)；及Xantphos(4,5-双(二苯膦基)-9,9-二甲基呫吨)。
一些实施方案涉及本申请中所述的化合物的药学上可接受的盐。本申请中所述的化合物的药学上可接受的盐包括其酸加成盐及碱加成盐。
一些实施方案亦涉及本申请中所述的化合物的药学上可接受的酸加成盐。适合的酸加成盐由形成无毒性盐的酸形成。适合的酸加成盐(亦即含有药理学上可接受的阴离子的盐)的非限制实例包括但不限于乙酸盐、酸柠檬酸盐、己二酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、碳酸氢盐/碳酸盐、硫酸氢盐/硫酸盐、酒石酸氢盐、硼酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环己胺磺酸盐、乙二磺酸盐、乙磺酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、六氟磷酸盐、海苯酸盐(hibenzate)、盐酸盐/氯化物、氢溴酸盐/溴化物、氢碘酸盐/碘化物、羟乙磺酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、甲烷磺酸盐、甲基硫酸盐、萘酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、乳清酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、磷酸盐/磷酸氢盐/磷酸二氢盐、焦谷氨酸盐、葡糖二酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、丹宁酸盐、酒石酸盐、对甲苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、三氟乙酸盐和昔萘酸盐。
额外的实施方案涉及本申请中所述的化合物的碱加成盐。适合的碱加成盐由形成无毒性盐的碱形成。适合的碱盐的非限制实例包括铝、精氨酸、二苄基乙二胺、钙、胆碱、二乙胺、二乙醇胺、甘氨酸、赖氨酸、镁、葡甲胺、乙醇胺、钾、钠、氨基丁三醇和锌盐。
属性上为碱性的本申请中所述的化合物能够与各种无机酸及有机酸形成广泛多种盐。可用于制备本申请中所述的这类碱性化合物的药学上可接受的酸加成盐的酸为那些形成无毒性酸加成盐的酸，例如含有药理学可接受的阴离子的盐，诸如盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乙酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、葡糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲烷磺酸盐、乙烷磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐及双羟萘酸盐[亦即1,1’-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸)]盐。包括碱性部分(诸如氨基)的本申请中所述的化合物可与除了上述酸以外的各种氨基酸形成药学上可接受的盐。
可用作为试剂以制备本申请中所述的化合物在属性上为酸性的那些化合物的药学上可接受的碱盐的化学碱为那些与这类化合物形成无毒性碱盐的碱。这类无毒性碱盐包括但不限于那些由这类药理学上可接受的阳离子(诸如碱金属阳离子(例如，钾和钠)及碱土金属阳离子(例如，钙和镁))衍生的盐、铵或水溶性胺加成盐(诸如N-甲基葡糖胺-(葡甲胺)和低级烷醇铵)以及药学上可接受的有机胺的其他碱盐。
本申请中所述实施方案的化合物包括本申请中所述的化合物的所有立体异构体(例如，顺式和反式异构体)及所有光学异构体(例如，R和S对映异构体)，以及这类异构体的外消旋混合物、非对映异构体混合物及其他混合物。虽然将所有的立体异构体涵盖在我们的权利要求的范围内，但是本领域技术人员将认知特定的立体异构体可能是优选的。
在一些实施方案中，本申请中所述的化合物可以数种互变异构体形式存在，包括烯醇与亚胺形式，及酮与烯胺形式，及其几何异构体和混合物。所有的这类互变异构形式皆包括在本发明实施方案的范围内。互变异构体以互变异构体组于溶液中的混合物存在。在固体形式中，通常一种互变异构体占优势。即使可能说明一种互变异构体，但是本发明的实施方案包括本发明化合物的所有互变异构体。
本发明的实施方案亦包括本申请中所述的化合物的阻转异构体。阻转异构体是指可分离成旋转受阻的异构体的化合物。
亦可形成酸及碱的半盐，例如半硫酸盐和半钙盐。
关于适合的盐的综述，见Stahl和Wermuth的HandbookofPharmaceuticalSalts：Properties，Selection,andUse(Wiley-VCH,2002)。用于制造本申请中所述的化合物的药学上可接受的盐的方法为本领域技术人员所知。
本文中使用术语“溶剂合物”说明一种包含本申请中所述的化合物及一种或多种药学上可接受的溶剂分子(例如，乙醇)的分子复合物。
本申请中所述的化合物亦可以非溶剂化及溶剂化形式存在。因此，一些实施方案涉及本申请中所述的化合物的水合物及溶剂合物。
含有一个或多个不对称碳原子的本申请中所述的化合物可以两种或更多种立体异构体存在。在本申请中所述的化合物含有烯基或亚烯基时，顺式/反式(或Z/E)几何异构体是可能的。在结构异构体可经由低能阻碍互相转换时，可发生互变异构现象(“互变异构现象”)。这在含有例如亚氨基、酮基或肟基的本申请中所述的化合物中可以质子互变异构现象的形式呈现，或在含有芳族部分的化合物中可以又称为价互变异构现象的形式呈现。单一化合物可能展现多于一种类型的异构现象。
在本发明的实施方案的范围内包括本申请中所述的化合物(包括展现多于一种类型的异构现象的化合物)的所有立体异构体、几何异构体及互变异构体形式，及其一种或多种混合物。亦包括其中相对离子具有光学活性的酸加成盐或碱盐，例如d-乳酸盐或l-赖氨酸；或为外消旋物，例如dl-酒石酸盐或dl-精氨酸。
顺式/反式异构体可通过那些本领域技术人员所熟知的常规技术来分离，例如以色谱法及分级结晶法。
用于制备/分离个别的对映异构体的常规技术包括由适合的光学纯前体的手性合成或使用例如手性高压液相色谱法(HPLC)进行外消旋物(或盐或衍生物的消旋物)的拆分。
可替代地，可将外消旋物(或外消旋前体)与适合的光学活性化合物(例如，醇，或，在本申请中所述的化合物含有酸性或碱性部分的情况下，碱或酸，诸如1-苯乙胺或酒石酸)反应。所得非对映异构混合物可通过色谱法及/或分级结晶法来分离，及非对映异构体中的一个或二个以本领域技术人员所熟知的方式转换成对应的纯对映异构体。
除非另有其他说明，本申请中所使用的术语“治疗(treating)”意指逆转、减轻、抑制此术语适用的病症或病状或这类病症或病状的一种或多种症状的进展，或预防病症或病状或这类病症或病状的一种或多种症状。除非另有其他说明，本申请中所使用的术语“治疗(treatment)”是指如上文刚定义的“治疗(treating)”的治疗的行为。
欲根据本发明进行治疗的患者包括任何温血动物，诸如但不限于人类、猴或其他低等灵长类动物、马、狗、兔、豚鼠或小鼠。例如，所述患者为人类。医学领域的技术人员能够轻易地鉴定受非小细胞肺癌折磨及需要治疗的个体患者。
术语“相加性”意指两种化合物或靶向药剂的组合结果为单独各药剂的总和。所使用的术语“协同性”或“协同作用的”意指两种药剂的组合结果大于各药剂一起的总和。“协同作用量”为导致协同效果的两种药剂的组合的量。
所述效果的最佳范围及该效果的各组分的绝对剂量范围可通过将不同的w/w比率范围及剂量的组分给予需要治疗的患者而明确地测量，以测定一种或两种组分之间的协同交互作用。对人类患者进行临床研究的复杂性及成本使得以此测试形式用作为协同性的主要模式变得不切实际。然而，体外模式或活体内模式的协同性观察可预测在人类及其他物种中的效果，且如本申请中所述，存在测量协同效果的体外模式或活体内模式，并且亦可使用这类研究的结果以通过药物动力学/药效学的方法来预测有效剂量与血浆浓度比率范围，及在人类及其他物种中必需的绝对剂量与血浆浓度。
在一个实施方案中，本发明方法涉及一种治疗非小细胞肺癌的方法，其包括将有效量的EGFRT790M抑制剂与panHER抑制剂的组合给予有此需要的患者，其中所述panHER抑制剂系根据非标准临床给药方案给予，其量足以达成协同效果。在此实施方案中，本发明方法涉及靶向的治疗剂的协同组合，所述治疗剂尤其为EGFRT790M抑制剂与panHER抑制剂。
在一个实施方案中，本发明方法涉及一种治疗非小细胞肺癌的方法，其包括将有效量的EGFRT790M抑制剂与低剂量panHER抑制剂的组合给予有此需要的患者，其量足以达成协同效果。在此实施方案中，本发明方法涉及靶向的治疗剂的协同组合，所述治疗剂尤其为EGFRT790M抑制剂与panHER抑制剂。
在另一实施方案中，本发明方法涉及一种治疗非小细胞肺癌的方法，其包括将有效量的不可逆EGFRT790M抑制剂与有效量的EGFR抑制剂组合给予有此需要的患者，其量足以达成协同效果。在此实施方案中，本发明方法涉及靶向的治疗剂的协同组合，所述治疗剂尤其为不可逆EGFRT790M抑制剂与EGFR抑制剂。
本申请中所使用的“有效”量是指在本发明的组合中足以预防或抑制肿瘤细胞生长或癌症转移进展的物质、药剂、化合物或组合物的量。剂量及给予方案的治疗或药理有效性亦可以表征为在经历特定肿瘤的患者中诱发、增强、维持或延长缓解的能力。
本申请中所使用的“非标准临床给药方案”是指给予有效抑制EGFR的单突变形式(L858R和delE746-A750)的物质、药剂、化合物或组合物的方案，但是其不同于典型地用于临床环境中的量或剂量。“非标准临床给药方案”包括“非标准临床剂量”或“非标准给药时程”。
本申请中所使用的“低剂量”是指有效抑制EGFR的单突变形式(L858R和delE746-A750)的物质、药剂、化合物或组合物的量或剂量，但是其为比典型地用于临床环境中的量或剂量更低的量或剂量。
本领域技术人员能够根据已知的方法测定在本发明的组合中所使用的各化合物给予患者的适当量或剂量，该测定考虑以下因素：诸如年龄、重量、一般健康、所给予的化合物、给予途径、需要治疗的非小细胞肺癌的性质和进展、及其他药剂的存在。
本发明方法的实施可经由各种给予方案来完成。可将本发明的组合的化合物间歇、同时或依序给予。若必要时，可进行重复的给予方案以达成所欲的癌细胞减少或缩减。在一个实施方案中，可将本发明的组合的化合物以间歇性给药方案给予。
本发明的组合的化合物的给予可以用能够递送化合物至作用位置的任何方法来实现。这些方法包括经口途径、十二指肠内途径、肠胃外注射(包括静脉内、皮下、肌肉内、血管内或输注)、局部及直肠给予。
本发明的方法或组合的化合物可在给予前进行配制。制剂优选地适合于特别的给予模式。这些化合物可以用本领域中已知的药学上可接受的载体配制且可以用本领域中已知的广泛多种的剂型给予。在制造本发明的药物组合物时，通常将活性成分与药学上可接受的载体混合，或以载体稀释，或包封在载体内。这类载体包括但不限于固体稀释剂或填充剂、赋形剂、无菌水性介质及各种无毒性有机溶剂。单位剂型或药物组合物包括片剂、胶囊(诸如明胶胶囊)、丸剂、散剂、粒剂、水性和非水性口服溶液和悬浮液、菱形锭、口含锭、硬糖锭、喷雾剂、霜剂、油膏、栓剂、果冻胶剂、凝胶剂、糊剂、乳液、软膏、可注射溶液、酏剂、糖浆及包装在适合于细分成个体剂量的容器中的肠胃外溶液。
肠胃外用制剂包括药学上可接受的含水或不含水的溶液、分散体、悬浮液、乳剂及用于其制备的无菌粉末。载体的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇)、植物油及可注射有机酯(诸如油酸乙酯)。流动性可通过使用包衣(诸如卵磷脂)、表面活性剂或维持适当的粒子大小来维持。例示的肠胃外给予形式包括本发明化合物在无菌水溶液(例如，水性丙二醇或右旋糖水溶液)中的溶液或悬浮液。若必要时，可将这类剂量形式适当地缓冲。
另外，为制片目的而常使用润滑剂，诸如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石。类似类型的固体组合物亦可用于软质及硬质填充的明胶胶囊中。因此，优选的材料包括乳糖及高分子量聚乙二醇。当希望以水性悬浮液及酏剂经口给予时，可将其中的活性化合物与各种甜味剂或调味剂、着色物质或染料及必要时的乳化剂或悬浮剂一起与稀释剂(诸如水、乙醇、丙二醇、甘油或其组合)组合。
制备各种具有特定量的活性化合物的药物组合物的方法为本领域技术人员所知或显而易见。例如，见Easter,Pa.的MackPublishingCompany的第15版Remington'sPharmaceuticalSciences(1975)。
本发明亦涉及一种药剂盒，其包含本发明的组合的治疗剂及给予该治疗剂的书面用法说明。在一个实施方案中，书面用法说明拟定及限定治疗剂的给予模式，例如同时或依序给予本发明的治疗剂。
以下提供的实施例及制备例进一步举例说明及例示本申请中所述的化合物及制备该化合物的方法。本申请中所述的实施方案的范围不以任何方式受到以下实施例及制备例的限制。除非另有其他注释，在以下的实施例中，具有单一手性中心的分子以外消旋混合物存在。除非另有其他注释，具有二个或更多个手性中心的那些分子以非对映异构体的外消旋混合物存在。单一对映异构体/非对映异构体可通过本领域技术人员已知的方法获得。
在所示的实施例中，盐形式在基于HPLC的色谱纯化期间由于流动相添加剂而偶尔分离。在这些例子中，将盐(诸如甲酸盐、三氟乙酸盐和乙酸盐)分离且不进一步处理而测试。应认知本领域普通技术人员能够以标准的方法(诸如使用离子交换柱，或使用温和的碱水溶液进行简单的碱性萃取)实现游离碱形式。
本申请中所述的化合物通常可以化学技术中已知的方法制备，特别是依照本申请中所含的说明。提供用于制造本申请中所述的化合物的特定方法，作为实施方案的进一步特性，且在下文提供的反应流程及实验章节中予以举例说明。
实施例
实施例1：1-{(3R,4R)-3-[5-氯-2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧甲基]-4-甲氧基-吡咯烷-1-基}丙烯酮三氟乙酸盐(亦称为“1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮三氟乙酸盐”及“1-((3R,4R)-3-(((5-氯-2-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)-4-甲氧基吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮三氟乙酸盐”)(“化合物A”的三氟乙酸盐)的制备
步骤1：(3S,4R)-1-苯甲基-4-甲氧基-吡咯烷-3-羧酸甲酯的制备
将N-(甲氧基甲基)-N-(三甲基硅基甲基)-苯甲胺(204克，2当量)逐滴添加至0℃在2-Me-THF(600毫升)及TFA(6.7毫升)中的(E)-3-甲氧基-丙烯酸甲酯(50克，430.6毫摩尔)的溶液中。在添加之后，容许反应温热至室温且搅拌2小时。将反应转移至分液漏斗中且以饱和NaHCO3、饱和NaCl清洗，接着经Na2SO4干燥且除去溶剂，留下成为黄色油的粗制外消旋产物，将其在SiO2上(10％-35％EtOAc/庚烷)纯化，得到成为黄色油的外消旋反式产物(82.7克)。以手性-SFC(ChiralpakAD-H4.6×250毫米柱，具有0.1％二乙胺的4％MeOH，140巴，3.0毫升/分钟)分离对映异构体，得到期望的单一异构体产物，通过与已知的标准物比较对其进行验证(34克，31.7％的收率)。比旋光[α]D 27＝+23.8°(C＝1.3，MeOH)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm2.55-2.63(m，2H)2.69(dd，J＝9.95，6.42Hz，1H)2.82-2.88(m，1H)2.90-2.96(m，1H)3.23(s，3H)3.51-3.63(m，2H)3.66(s，3H)4.07-4.12(m，1H)7.22-7.39(m，5H)。(C14H19NO3)的m/z(APCI+)为250.0(M+H)+。
步骤2：(3S,4R)-4-甲氧基-吡咯烷-1,3-二羧酸1-叔丁酯3-甲酯的制备
将乙醇(500毫升)中的(3S,4R)-1-苯甲基-4-甲氧基-吡咯烷-3-羧酸甲酯(35克，140.4毫摩尔)的溶液以氮气冲洗，接着添加Pd(OH)2(2克，0.1当量)且将混合物在约15psi下于氢气氛围下(经由氢气球)搅拌过夜。接着将反应经由硅藻土过滤且将二碳酸二叔丁酯(30.9克，1当量)在搅拌下缓慢地添加至所得滤液中。在1小时之后，将反应浓缩且将粗制物质通过短二氧化硅柱纯化，以2体积的10％EtOAc/庚烷及接着以1：1的EtOAc/庚烷洗脱，直到产物完全洗脱为止。将产物级分合并且浓缩，得到成为透明油的标题化合物(35.81克，98％的收率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm1.39(s，9H)3.17(br.s.，1H)3.23-3.28(m，4H)3.35-3.53(m，3H)3.65(s，3H)4.06(d，J＝4.78Hz，1H)。减去Boc的产物(C7H13NO3)的m/z(APCI+)为160.1(M+H)+。比旋光：[a]D＝-12.5度(C＝0.87，MeOH)。
步骤3：(3R,4R)-3-羟甲基-4-甲氧基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯的制备
将硼氢化锂(12.7克，4当量)分批添加至THF(600毫升)中的(3S,4R)-4-甲氧基-吡咯烷-1,3-二羧酸1-叔丁酯3-甲酯(35.81克，138.1毫摩尔)的溶液中，接着将反应加热至60℃持续4小时。用0℃水将反应淬灭且以EtOAc萃取。将有机层以饱和NaCl清洗且经Na2SO4干燥。除去溶剂且将残余物经由SiO2塞管(3：1的EtOAc/庚烷)纯化，得到成为透明油的标题化合物(29.35克，92％的收率)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm1.46(s，9H)2.37-2.47(m，1H)3.19(dd，J＝11.08，5.29Hz，1H)3.33(d，J＝4.03Hz，4H)3.50-3.66(m，4H)3.77-3.83(m，1H)。减去Boc的产物(C6H13NO2)的m/z(APCI+)为132.2(M+H)+。比旋光：[a]D＝+9.3度(C＝0.86，MeOH)。
步骤4：(3R,4R)-3-[5-氯-2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧甲基]-4-甲氧基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯的制备
方法A：(使用微波加热)
将叔戊醇钾(25％w/w于甲苯中，1.6毫升，3.5毫摩尔)添加至微波小瓶中在1,4-二烷(15毫升)中的2,4,5-三氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(904毫克，4.1毫摩尔)及(3R,4R)-3-羟甲基-4-甲氧基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(940毫克，4.1毫摩尔)的溶液中。将所得溶液在环境温度下搅拌15分钟。LCMS显示定量形成(3R,4R)-3-(2,5-二氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧甲基)-4-甲氧基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。将1-甲基-1H-吡唑-4-基胺(474毫克，4.9毫摩尔)及t-BuXPhos钯环(110毫克，0.04摩尔当量)添加至此所得反应溶液中。将反应混合物搅拌且使用正常吸收等级的微波加热至100℃持续45分钟。将反应混合物经由硅藻土过滤且将滤液蒸发，得到深色残余物。将粗制物质经由以庚烷中的0％-100％EtOAc的梯度洗脱的急骤色谱法纯化，得到标题化合物(1.78克，76％的收率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm11.50(br.s.，1H)9.06(s，1H)7.85(s，1H)7.52(s，1H)7.05(d，J＝2.27Hz，1H)4.30-4.53(m，2H)3.86-3.96(m，1H)3.80(s，3H)3.55-3.68(m，1H)3.43-3.53(m，1H)3.24-3.31(m，3H)2.71(br.s.，1H)1.39(br.s.，9H)。减去Boc的产物C16H20ClN7O2的m/z(APCI+)为378.1(M+H)+，具有Cl同位素图案。
方法B：使用热加热
将叔戊醇钾(25％w/w于甲苯中，80毫升，167毫摩尔)添加至圆底烧瓶中在1,4-二烷(100毫升)中的2,4,5-三氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(9.28克，41.7毫摩尔)及(3R,4R)-3-羟甲基-4-甲氧基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(9.65克，41.7毫摩尔)的溶液中。将所得反应溶液在环境温度下搅拌30分钟。LCMS显示定量形成(3R,4R)-3-(2,5-二氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧甲基)-4-甲氧基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。将1-甲基-1H-吡唑-4-基胺(4.86克，50.1毫摩尔)及t-BuXPhos钯环(1.1克，1.67毫摩尔，0.04摩尔当量)添加至所得反应溶液中。将反应混合物搅拌且在油浴中加热至90℃持续1小时。接着将反应混合物经由硅藻土过滤且将滤液蒸发，以除去挥发物，得到深色胶，接着将其溶解在乙酸乙酯(300毫升)中且经由硅胶塞管过滤。将滤液蒸发且将残余物经由以庚烷中的0％-100％EtOAc的梯度洗脱的急骤色谱法纯化，得到标题化合物(12.4克，62％的收率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm11.51(br.s.，1H)9.07(s，1H)7.86(s，1H)7.52(s，1H)7.06(d，J＝2.20Hz，1H)4.31-4.54(m，2H)3.92(br.s.，1H)3.80(s，3H)3.55-3.68(m，1H)3.44-3.55(m，1H)3.30(d，J＝18.34Hz，3H)2.72(br.s.，1H)1.39(br.s.，9H)。C21H28ClN7O4的m/z(APCI+)为378.2(M+H)+，具有Cl同位素图案。
步骤5：[5-氯-4-((3R,4R)-4-甲氧基-吡咯烷-3-基甲氧基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基]-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-胺三氟乙酸盐的制备
将TFA(10.1毫升，208毫摩尔)添加至0℃在DCM(60毫升)中的(3R,4R)-3-[5-氯-2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧甲基]-4-甲氧基-吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(12.40克，26毫摩尔)的溶液中且将所得溶液在环境温度下搅拌2.5小时。除去挥发物且将乙醚(150毫升)添加至残余物中。将所得悬浮液搅拌2小时，接着过滤，得到浅粉红色固体。将其以乙醚(30毫升)清洗且干燥，得到成为TFA盐的标题化合物(15.69克，定量)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm11.56(br.s.，1H)9.09(s，3H)7.85(s，1H)7.54(s，1H)7.09(d，J＝2.32Hz，1H)4.48(d，J＝6.48Hz，2H)4.11(br.s.，1H)3.81(s，3H)3.46-3.60(m，1H)3.35-3.45(m，2H)3.32(s，3H)3.15(dq，J＝12.01，6.02Hz，1H)2.88(m，J＝6.42，6.42Hz，1H)。母体分子C16H20ClN7O2的m/z(APCI+)为378.2(M+H)+，具有Cl同位素图案。
步骤6：1-{(3R,4R)-3-[5-氯-2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧甲基]-4-甲氧基-吡咯烷-1-基}丙烯酮三氟乙酸盐的制备
将[5-氯-4-((3R,4R)-4-甲氧基-吡咯烷-3-基甲氧基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-基]-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-胺(15.0克(2TFA盐)，24.7毫摩尔)、乙酸乙酯(200毫升)与饱和NaHCO3水溶液(100毫升)的混合物在0℃搅拌10分钟。逐滴添加丙烯酰氯(2.3毫升，29毫摩尔，1.1摩尔当量)且将所得混合物在环境温度下搅拌30分钟。添加乙酸乙酯(150毫升)且将有机层分离。将水层以乙酸乙酯(150毫升)萃取，将合并的有机层经Na2SO4干燥且蒸发，得到固体，将其以SFC(ZymorSPHERHAP5μ21.2×150毫米柱，以CO2中的35％EtOH洗脱，在120巴下，64毫升/分钟的流速)纯化，得到成为灰白色固体的标题化合物(8.3克，78％的收率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm11.51(s，1H)9.07(s，1H)7.86(s，1H)7.52(s，1H)7.05(s，1H)6.59(ddd，J＝16.75，10.27，1.34Hz，1H)6.14(dd，J＝16.75，2.32Hz，1H)5.68(dt，J＝10.27，2.32Hz，1H)4.44(d，J＝6.24Hz，2H)3.82-4.09(m，2H)3.80(s，3H)3.57-3.76(m，2H)3.47-3.54(m，1H)3.31(d，J＝4.65Hz，3H)2.67-2.92(m，1H)。母体分子C19H22ClN7O3的m/z(APCI+)为431.9(M+H)+，具有Cl同位素图案。
替代性实施例1：1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮(亦称为“1-((3R,4R)-3-(((5-氯-2-((1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基)甲基)-4-甲氧基吡咯烷-1-基)丙-2-烯-1-酮”)(“化合物A”)的制备
步骤1：(3,4-反式)-1-苯甲基-4-甲氧基吡咯烷-3-羧酸甲酯的制备
将反式-3-甲氧基丙烯酸甲酯(500毫升，540克，4.65摩尔)与苯甲基甲氧基甲基三甲基硅基胺(595毫升，552.1克，2.3摩尔)在氮气氛围下以磁搅拌混合。将TFA(2.7毫升，4.14克，36.3毫摩尔)添加至此混合物中，其导致在30秒内放热至约95℃。接着将所得混合物在回流下加热1小时(注意：在开始时，回流温度为约104℃，并在1小时之后，其下降至约90℃)。以此规模进行三批加上另一批使用325毫升苯甲基甲氧基甲基三甲基硅基胺化合物。将这些批次中的二批合并且倒入2NHCl(5升)中。将混合物以EtOAc(3升和2升)萃取。在冰上冷却，水层通过添加50％NaOH(水溶液)达到pH9。将水层以EtOAc(2.5升，1.5升和1升)萃取。将合并的有机层以盐水(3升)清洗且经Na2SO4干燥。剩余的批次进行相同的后处理。将所有的有机层过滤且将滤液在真空中浓缩，得到粗制标题化合物(外消旋-反式，1640克)。在以减压(bulb-to-bulb)蒸馏(0.1毫巴，100℃-145℃)分批纯化之后，分离出成为黄色油的标题化合物(69％的总收率)。
步骤2：(3,4-反式)-4-甲氧基吡咯烷-3-羧酸甲酯的制备
将(3,4-反式)-1-苯甲基-4-甲氧基吡咯烷-3-羧酸甲酯(463.3克，1858毫摩尔)溶解在iPrOH(2升)中。将20％Pd(OH)2/C(50克，37％水分，Aldrich)添加至此溶液中且将混合物剧烈搅拌。施加11.8巴的H2压力且进行数次再填充，直到1H-NMR显示完全转化为止。将混合物经由硅藻土过滤且将硅藻土以iPrOH冲洗。将滤液在真空中浓缩，得到成为深黄色液体的标题化合物(266克，90％的收率)。以原样子用于下一步骤中。
步骤3：(2R,3R)-2,3-双(苯甲氧基)-3-羧基丙酸(3R,4S)-3-甲氧基-4-(甲氧基羰基)吡咯烷的制备
将乙醇(1升)中的(3,4-反式)-4-甲氧基吡咯烷-3-羧酸甲酯(480克，2.84摩尔)的溶液添加至乙醇(5升)中的O,O-二苯甲酰基-L-酒石酸(1千克，2.79摩尔)的温溶液中。在澄清溶液中加入晶种且容许结晶过夜。将所得固体分离且以乙醇清洗。将此富含的材料自乙醇再结晶5次(2次5升，4升，3.5升和3升)，得到216克(15％的收率)盐，其具有98％的对映异构体过量(使用以下条件，Rt12.18分钟)。
手性纯度测定：
样品制备：将5毫克盐与DCM(1.5毫升)及2NNaOH(0.2毫升)混合。将DCM层干燥且以气相色谱法分析。
柱：AgilentCyclosilB；30米×250厘米×0.25厘米
温度：90℃(0分钟)至5℃/分钟至180℃(4分钟)。总运作时间22分钟。
注射温度：250℃
检测器：250℃；FID
注射体积：1.0微升
分流比：25：1
柱流速：2.2毫升/分钟(H2)
步骤4：(3S,4R)-4-甲氧基吡咯烷-1,3-二羧酸1-叔丁基3-甲酯的制备
将DCM及饱和NaHCO3中的(2R,3R)-2,3-双(苯甲氧基)-3-羧基丙酸(3R,4S)-3-甲氧基-4-(甲氧基羰基)吡咯烷(216克，420毫摩尔)的混合物以机械搅拌且分批添加Boc2O(119克，546毫摩尔)。将混合物在室温下搅拌过夜且将层分离。将水相以DCM萃取且将合并的有机层以盐水清洗，干燥且浓缩。该步骤得到与33％Boc2O混合的138克粗制标题产物(85％的收率)。直接用于下一步骤中。
步骤5：(3R,4R)-3-(羟甲基)-4-甲氧基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯的制备
将(3S,4R)-4-甲氧基吡咯烷-1,3-二羧酸1-叔丁基3-甲酯(138克，含有Boc2O，约2：1，～0.35摩尔)溶解在2升THF中。将溶液以机械搅拌且冷却至-78℃。经30分钟逐滴添加氢化锂铝溶液(在THF中的2.4M，200毫升，0.5摩尔)，维持温度低于-70℃。接着容许温度上升至-30℃。缓慢地添加酒石酸钠钾四水合物饱和溶液(水溶液，100毫升)，以淬灭。将固体材料经由Na2SO4床滤出。将滤液在真空中浓缩，得到成为几乎无色浆液的标题化合物(66克，0.28摩尔，～80％的收率)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：ppm3.80(q，J＝5.1Hz，1H)，3.62(d，J＝6.2Hz，2H)，3.56(m，1H)，3.52(d，J＝7.4Hz，1H)，3.40-3.30(m，1H)，3.36(s，3H)，2.42(m，1H)，1.46(s，9H)。C11H21NO4的m/z(GCMS)为231.2(M)+。C11H21NO4的m/z(APCI+)为132.0(M+H)+。比旋光：[a]D＝+11.6度(c0.77，MeOH)。手性纯度测定方法：ChiralpakAD-H21.2×250mm5u柱，其以12％MeOH：88％CO2的流动相洗脱，在35℃下且保持至120巴。62毫升/分钟的流速。3.36分钟的Rt。
步骤6：(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯的制备
将叔戊醇钾(25％w/w于甲苯中，80毫升，167毫摩尔)添加至圆底烧瓶中的1,4-二烷(100毫升)中的2,4,5-三氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(9.28克，41.7毫摩尔)及(3R,4R)-3-(羟甲基)-4-甲氧基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(9.65克，41.7毫摩尔)的溶液中。将所得反应溶液在环境温度下搅拌30分钟。LCMS显示定量形成中间物(3R,4R)-3-{[(2,5-二氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基]甲基}-4-甲氧基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。将1-甲基-1H-吡唑-4-基胺(4.86克，50.1毫摩尔)、t-BuXPhos钯环(1.1克，1.67毫摩尔，0.04摩尔当量)添加至上述反应溶液中，且将反应混合物在油浴中搅拌及加热至90℃持续1小时。LCMS显示反应完成。将反应混合物经由硅藻土过滤且将硅藻土以乙酸乙酯(200毫升)清洗。将合并的滤液蒸发，以除去挥发物，得到深色残余物。将此残余物溶解在乙酸乙酯(300毫升)中且经由硅胶塞管过滤。将滤液蒸发且将残余物经由以庚烷中的0-100％EtOAc的梯度洗脱的急骤色谱法纯化，得到标题化合物(12.4克，62％的收率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm11.51(br.s.，1H)9.07(s，1H)7.86(s，1H)7.52(s，1H)7.06(d，J＝2.20Hz，1H)4.31-4.54(m，2H)3.92(br.s.，1H)3.80(s，3H)3.55-3.68(m，1H)3.44-3.55(m，1H)3.30(d，J＝18.34Hz，3H)2.72(br.s.，1H)1.39(br.s.，9H)。C21H28ClN7O4的m/z(APCI+)为378.2(M+H)+，具有Cl同位素图案。旋亮度：[a]d＝-8.3度(c＝0.24，MeOH)。
步骤7：(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷三氟乙酸盐的制备
将TFA(10.1毫升，208毫摩尔)添加至水浴中在DCM(60毫升)中的(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(12.40克，26毫摩尔)的溶液中且将所得溶液在环境温度下搅拌2.5小时。除去挥发物，得到残余物，将乙醚(150毫升)添加至其中。将所得悬浮液搅拌2小时且以过滤收集浅粉红色固体，以乙醚(30毫升)清洗且干燥，得到标题产物(15.69克，100％的收率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm11.56(br.s.，1H)9.09(s，3H)7.85(s，1H)7.54(s，1H)7.09(d，J＝2.32Hz，1H)4.48(d，J＝6.48Hz，2H)4.11(br.s.，1H)3.81(s，3H)3.46-3.60(m，1H)3.35-3.45(m，2H)3.32(s，3H)3.15(dq，J＝12.01，6.02Hz，1H)2.88(m，J＝6.42，6.42Hz，1H)。母体分子C16H20ClN7O2的m/z(APCI+)为378.2(M+H)+，具有Cl同位素图案。旋亮度：[a]d＝-4.1度(c＝0.24，MeOH)。
步骤8：1-{(3R,4R)-3-[5-氯-2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基氧甲基]-4-甲氧基-吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮的制备
将(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷三氟乙酸盐(15.0克，24.7毫摩尔)、乙酸乙酯(200毫升)与饱和NaHCO3水溶液(100毫升)的混合物在0℃搅拌10分钟。逐滴添加丙烯酰氯(2.3毫升，29毫摩尔，1.1摩尔当量)且将所得混合物在环境温度下搅拌30分钟。添加乙酸乙酯(150毫升)且将有机层分离；将水层以乙酸乙酯(150毫升)萃取，将合并的有机层经Na2SO4干燥且蒸发，得到固体，将其经由以乙酸乙酯中的0-50％乙醇的梯度洗脱的急骤色谱法纯化，得到白色固体。接着将此固体以使用热胶的光加热而自乙醇(1克粗制物以10毫升乙醇)再结晶且以晶种接种。在冷却时，以过滤收集白色晶体且以乙醇(1克粗制物以3毫升乙醇)清洗，得到成为白色固体的标题化合物(7.47克，70％)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm11.50(br.s.，1H)9.06(s，1H)7.85(s，1H)7.51(s，1H)7.04(d，J＝2.32Hz，1H)6.58(ddd，J＝16.78，10.30，1.16Hz，1H)6.13(dd，J＝16.81，2.38Hz，1H)5.67(dt，J＝10.33，2.23Hz，1H)4.43(d，J＝6.24Hz，2H)3.95-4.05(m，1H)3.68-3.85(m，4H)3.56-3.66(m，2H)3.44-3.53(m，1H)3.30(d，J＝4.65Hz，3H)2.68-2.90(m，1H)。母体分子C19H22ClN7O3的m/z(APCI+)为432.1(M+H)+，具有Cl同位素图案。手性纯度测定：Whelk-O1(R,R)4.6×250毫米柱，30％EtOH，在140巴，3毫升/分钟。Rt＝～8.8分钟，峰1，>99％ee。旋亮度：[a]D22＝-3.1度(c0.14，EtOH)。元素分析：理论值：C，52.84；H，5.13；Cl，8.21；N，22.70。实测值：C，52.45；H，5.38；Cl，7.91；N，22.02。
实施例2：N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-5-(吡啶-2-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)环丁基]丙-2-烯酰胺(“化合物B”)的制备
步骤1：2,4-二氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶的制备
将N-碘琥珀酰亚胺(62.8克，279毫摩尔，1.05当量)以使得内部温度维持在低于50℃的速率添加至DMF(266毫升，1.0M)中的2,4-二氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(50.0克，266毫摩尔，1.00当量)的溶液中。将反应混合物剧烈搅拌且在环境温度浴中经1.5小时冷却。将反应混合物以冰水(1.5升)稀释且将所得沉淀物以过滤分离。将沉淀物以冰水(2×500毫升)清洗且在真空中于45℃下经36小时干燥，得到成为灰白色固体的标题化合物(81.5克，98％的收率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm13.09(br.s.，1H)，7.95(s，1H)。C6H2Cl2IN3的m/z(APCI+)为313.9(M+H)+。
步骤2：2,4-二氯-5-碘-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶的制备
将2-(三甲基硅基)乙氧基甲基氯(59.5毫升，337毫摩尔，1.30当量)以逐滴方式经5分钟添加至THF(600毫升)中的2,4-二氯-5-碘-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(81.4克，259毫摩尔，1.00当量)及二异丙基乙胺(105毫升，596毫摩尔，2.30当量)的冷却(0℃)溶液中。容许反应混合物在0℃搅拌3小时。在此时将反应混合物过滤且将滤液在真空中浓缩。将所得浓油以EtOAc(400毫升)稀释，依序以饱和NH4Cl水溶液(2×200毫升)及盐水(2×200毫升)清洗，经Na2SO4干燥且在真空中浓缩。将所得材料溶解在最少量的DCM(50毫升)中且以庚烷(200毫升)稀释。将此溶液浓缩至150毫升总体积，其促进标题化合物湿磨。将此混合物过滤，得到标题化合物(84.1克)，将滤液浓缩且经由以庚烷中的0-15％EtOAc的梯度洗脱的急骤色谱法进一步纯化，以提供额外部分的标题化合物(26.5克)。将该两部分合并，得到成为灰白色固体的所欲产物(110.6克)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δppm7.50(s，1H)，5.57(s，2H)，3.61(t，J＝8.0Hz，2H)，0.95(t，J＝8.0Hz，2H)，0.01(s，9H)。C12H16Cl2IN3OSi的m/z(APCI+)为444.0(M+H)+。
步骤3：2,4-二氯-5-(吡啶-2-基)-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶的制备
将i-PrMgCl溶液(47.3毫升，94.6毫摩尔，1.40当量，1.00MTHF)以逐滴方式经4分钟添加至THF(350毫升)中的2,4-二氯-5-碘-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(30.0克，68.0毫摩尔，1.00当量)的冷却(-78℃)溶液中。将反应混合物在-78℃下搅拌2小时且接着以THF(100毫升)中的ZnBr2(24.7克，110毫摩尔，1.62当量，在130℃下干燥)的新鲜制备溶液以逐滴方式处理15分钟。将混合物在-78℃下再搅拌1小时，接着温热至环境温度且再搅拌0.5小时。在此时将反应混合物以Pd(PPh3)4(3.94克，3.38毫摩尔，0.05当量)及2-碘吡啶(10.8毫升，101摩尔，1.50当量)处理且加热至65℃持续10小时。在冷却至环境温度时，将反应混合物浓缩至～200毫升体积，以水(600毫升)、饱和酒石酸钠钾水溶液(100毫升)和EtOAc(400毫升)稀释。将层分离且将水层以EtOAc(4×300毫升)萃取。将合并的有机物以盐水(300毫升)清洗，干燥(Na2SO4)且在真空中浓缩。将所得油经由以庚烷中的0-30％EtOAc的梯度洗脱的急骤色谱法纯化，以提供成为油的标题化合物(23.5克，87％的收率)，其在静置时转化成浅褐色固体。1HNMR(400MHz，CDCl3)δppm8.76-8.63(m，1H)，7.83-7.77(m，1H)，7.74(s，1H)，7.67(d，J＝7.8Hz，1H)，7.35-7.29(m，1H)，5.68(s，2H)，3.61(dd，J＝7.6，8.9Hz，2H)，1.03-0.92(m，2H)，-0.01(s，9H)。C17H20Cl2N4OSi的m/z(APCI+)为395.1(M+H)+。
步骤4：(反式-3-{[叔丁基(二甲基)硅基]氧基}环丁基)-氨基甲酸叔丁酯的制备
将THF(1.0升)中的(顺式-3-羟基环丁基)氨基甲酸叔丁酯(62.0克，330毫摩尔，1.00当量)及4-硝基苯甲酸(60.8克，360毫摩尔，1.10当量)的冷却(0℃)溶液依序以PPh3(130克，490摩尔，1.48当量)及偶氮二羧酸二乙酯(86.3克，490毫摩尔，1.48当量)处理。在添加之后，将反应混合物回流4天，冷却至环境温度且在真空中浓缩。将残余物自i-PrOH再结晶，得到白色固体(63克)。
将K2CO3(51.6克，370毫摩尔)添加至MeOH(1.0升)及H2O(200毫升)中的上述所获得的4-硝基苯甲酸酯(63克)的溶液中。将所得混合物回流2小时，冷却至环境温度且过滤。将滤液在真空中浓缩且分配在EtOAc与水性10％Na2CO3之间。将所得有机层以盐水清洗且浓缩，得到白色固体(31.0克)。
将TBSCl(91.0克，600毫摩尔，1.50当量)添加至吡啶(1.0升)中的上述所获得的醇(75.0克，400毫摩尔，1.00当量)的溶液中。将反应混合物在环境温度下搅拌2小时且接着在真空中浓缩。将所得残余物经由以石油醚中的0-10％EtOAc的梯度洗脱的急骤色谱法纯化，以提供成为白色固体的标题化合物(111克，92％的收率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm7.13(d，1H)4.38-4.47(m，1H)3.90(br.s.，1H)2.00-2.16(m，4H)1.36(s，9H)0.81-0.89(m，9H)-0.01-0.01(m，6H)。C10H23NOSi的m/z(APCI+)为202.1(M-Boc+H)+。
步骤5：(反式-3-{[叔丁基(二甲基)硅基]氧基}环丁基)-甲基氨基甲酸叔丁酯的制备
将NaH(在油中的60％分散体，22.2克，550毫摩尔，1.50当量)分批添加至THF(1.0升)中的(反式-3-{[叔丁基(二甲基)硅基]氧基}环丁基)氨基甲酸叔丁酯(111克，370毫摩尔，1.00当量)的溶液中。在添加之后，将反应混合物再搅拌0.5小时，冷却(0℃)且以甲基碘(38.2毫升，615毫摩尔，1.66当量)以逐滴方式处理。在环境温度下再5小时之后，将反应混合物在真空中浓缩且将所得残余物经由以石油醚中的10％EtOAc洗脱的急骤色谱法纯化，以提供成为油的标题化合物(97.5克，84％的收率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm4.64(br.s.，1H)4.29-4.37(m，1H)2.73(s，3H)2.31-2.43(m，2H)1.97-2.08(m，2H)1.37(s，9H)0.86(s，9H)-0.01-0.05(m，6H)。C11H25NOSi的m/z(APCI+)为216.2(M-Boc+H)+。
步骤6：(反式-3-羟基环丁基)甲基氨基甲酸叔丁酯的制备
将TBAF(930毫升，930毫摩尔，1.55当量，在THF中的1M)添加至THF(1.0升)中的(反式-3-{[叔丁基(二甲基)硅基]氧基}环丁基)甲基氨基甲酸叔丁酯(195克，600毫摩尔，1.00当量)的溶液中。将反应混合物在环境温度下搅拌3小时且接着在真空中浓缩。将所得残余物分配在EtOAc(1.0升)与饱和NH4Cl水溶液(500毫升)之间。将所得有机层在真空中浓缩且将所得残余物经由以石油醚中的10％EtOAc洗脱的急骤色谱法纯化，以提供成为白色固体的标题化合物(88克，76％的收率)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δppm4.78(s，1H)，4.41-4.38(m，1H)，2.82(s，3H)，2.41-2.38(m，2H)，2.23-2.20(m，2H)，1.47(s，9H)。C10H18NO3的m/z(ESI+)为146.1(M-tBu+H)+。
步骤7：甲基{反式-3-[(2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-5-(吡啶-2-基)-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基]环丁基}氨基甲酸叔丁酯的制备
将双(三甲基硅基)氨化钾(12.4克，62.3毫摩尔，1.12当量)分三批添加至THF(100毫升)中的(反式-3-羟基环丁基)甲基氨基甲酸叔丁酯(12.9克，64.0毫摩尔，1.15当量)的冷却溶液中。在添加之后，容许烷醇化物溶液经0.5小时温热至环境温度。将2,4-二氯-5-(吡啶-2-基)-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(22.0克，55.6毫摩尔，1.00当量)及THF(300毫升)装入另一烧瓶中且冷却(0℃)。将此溶液以经由导管的烷醇化物溶液处理5分钟且接着在0℃再搅拌0.5小时。接着将反应混合物以盐水(100毫升)、水(200毫升)和EtOAc(600毫升)稀释。将层分离且将水层以EtOAc(4×200毫升)萃取。接着将合并的有机层以盐水(200毫升)清洗，干燥(Na2SO4)且在真空中浓缩。以未进一步纯化的所得黏性油(31.0克)用于下一步骤中。
将1-甲基-1H-吡唑-4-胺(7.57克，77.9毫摩尔，1.40当量)、Pd2dba3(2.68克，2.78毫摩尔，0.05当量)、4,5-双(二苯膦基)-9,9-二甲基呫吨(3.25克，5.56毫摩尔，0.10当量)及Cs2CO3(45.8克，139毫摩尔，2.5当量)添加至1,4-二烷(300毫升)中的上述所获得的油(31.0克)的溶液中。接着将反应混合物以氮气流冲洗20分钟且在105℃下以剧烈搅拌加热10小时。在冷却至环境温度时，将反应混合物以EtOAc(500毫升)稀释，经由硅藻土过滤且在真空中浓缩。将所得残余物经由以庚烷中的0-80％EtOAc的梯度洗脱的急骤色谱法纯化，以提供成为橘色泡沫的标题化合物(25.6克，74％的收率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm9.17(s，1H)，8.56(d，J＝4.3Hz，1H)，8.14(d，J＝7.9Hz，1H)，7.93(br.s.，1H)，7.87-7.79(m，1H)，7.69(s，1H)，7.55(s，1H)，7.23(dd，J＝5.0，7.2Hz，1H)，5.57(br.s.，2H)，5.47(br.s.，1H)，4.84-4.66(m，1H)，3.82(s，3H)，3.63-3.53(m，2H)，2.84(s，3H)，2.75-2.62(m，2H)，2.47-2.34(m，2H)，1.38(s，9H)，0.86(t，J＝8.0Hz，2H)，-0.11(s，9H)。C31H44N8O4Si的m/z(APCI+)为621.3(M+H)+。
步骤8：3-氯-N-甲基-N-{反式-3-[(2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-5-(吡啶-2-基)-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基]环丁基}丙酰胺的制备
将TFA(70.0毫升，914毫摩尔，22.7当量)以逐滴方式添加至MeCN(600毫升)中的甲基{反式-3-[(2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-5-(吡啶-2-基)-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基]环丁基}氨基甲酸叔丁酯(25.0克，40.3毫摩尔，1.00当量)的冷却(0℃)溶液中。将反应混合物在0℃搅拌且接着容许温热至环境温度过夜。接着将反应混合物冷却(0℃)，以NaOH水溶液调整至pH＝8且将相分离。将水相以EtOAc(3×300毫升)萃取且将合并的有机相以盐水(2×200毫升)清洗，干燥(Na2SO4)且在真空中浓缩。将所得残余物经由以DCM中的2-7％MeOH的梯度洗脱的急骤色谱法部分纯化，以提供成为黄色胶的4-{[反式-3-(甲基氨基)环丁基]氧基}-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-吡啶-2-基-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-胺，将其直接用于下一步骤中。
将3-氯丙酰氯(8.25毫升，86.4毫摩尔，1.51当量)以逐滴方式添加至DCM(500毫升)中的4-{[反式-3-(甲基氨基)环丁基]氧基}-N-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-吡啶-2-基-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-胺及DIPEA(16.0毫升，91.9毫摩尔，1.61当量)的溶液中且接着在环境温度下搅拌1小时。接着将反应混合物以H2O(2×100毫升)和盐水(100毫升)清洗，干燥(Na2SO4)且在真空中浓缩。将所得胶以MTBE(250毫升)湿磨，将固体过滤且在真空中干燥，得到成为黄色固体的标题化合物(24.0克，68.9％的收率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm9.10-9.25(m，1H)8.51-8.61(m，1H)8.10-8.25(m，1H)7.92-8.05(m，1H)7.82-7.91(m，1H)7.67-7.76(m，1H)7.47-7.60(m，1H)7.17-7.30(m，1H)5.55-5.64(m，2H)5.40-5.54(m，1H)4.63-5.31(m，1H)3.83(s，3H)3.74-3.81(m，2H)3.53-3.66(m，2H)2.92-3.08(m，3H)2.81-2.89(m，2H)2.58-2.79(m，2H)2.29-2.46(m，2H)0.75-0.93(m，2H)-0.10(s，9H)。C29H39ClN8O3Si的m/z(APCI+)为611.2(M+H)+。
步骤9：N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-5-(吡啶-2-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)环丁基]丙-2-烯酰胺的制备
将HCl溶液(250毫升，4M于1,4-二烷中)添加至DCM/iPrOH(9：1，250毫升)中的3-氯-N-甲基-N-{反式-3-[(2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-5-(吡啶-2-基)-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氧基]环丁基}丙酰胺(24.0克，39.2毫摩尔，1.00当量)的溶液中。将反应混合物在环境温度下搅拌过夜，在真空中浓缩，得到3-氯-N-[反式-3-({7-(羟甲基)-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-5-吡啶-2-基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)环丁基]-N-甲基丙酰胺，在未进一步纯化的情况下将其用于下一步骤中。
将来自先前步骤的中间物溶解在1,4-二烷(80毫升)及浓NH4OH水溶液(50毫升)中。将反应混合物在环境温度下搅拌3小时且接着在真空中浓缩。将残余物以MTBE(100毫升)湿磨，将固体过滤且在真空中干燥，得到成为黄色固体的3-氯-N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-5-吡啶-2-基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)环丁基]丙酰胺，在未进一步纯化的情况下将其用于下一步骤中。
将K2CO3(21.4克，155毫摩尔，3.95当量)添加至EtOH(400毫升)中的3-氯-N-甲基-N-[反式-3-({2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-5-吡啶-2-基-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)环丁基]丙酰胺的溶液中且将反应混合物在环境温度下搅拌过夜。将反应混合物过滤，以除去无机盐，在真空中浓缩且溶解在EtOAc(100毫升)中。添加MTBE(200毫升)，以沉淀粗制产物，以过滤收集。将滤液浓缩且经由以DCM中的2-7％MeOH的梯度洗脱的急骤色谱法纯化，以提供额外部分的粗制产物。将合并的粗制物质经由使用以H2O(0.225％HCOOH)中的5％MeCN至H2O(0.225％HCOOH)中的25％MeCN的梯度洗脱的YMC-ActusTriactC18(150毫米×30毫米×5微米)柱的反相色谱法纯化，得到成为黄色固体的标题化合物的甲酸盐(7.14克，经3个步骤的37％)。
将饱和NaHCO3水溶液(100毫升)及EtOAc(200毫升)依序添加至H2O(200毫升)中的标题化合物的甲酸盐(5.14克)的溶液中。将层分离且将水层以EtOAc(8×100毫升)萃取。将合并的有机物干燥(Na2SO4)且在真空中浓缩，得到成为非晶形固体的标题化合物。将一部分的此非晶形固体(～3克)溶解在最少量的EtOH/EtOAc(～1：1，～120毫升)中，在真空中浓缩至～10毫升体积且以EtOAc(40毫升)稀释。将此溶液以～5毫克结晶产物接种且容许在环境温度下搅拌过夜。将结晶瓶冷却(0℃)1小时，以促使进一步结晶。以过滤收集产物且在真空中干燥，得到含有EtOAc(0.038当量)及EtOH(0.03当量)的成为白色结晶材料的标题化合物(2.63克)。mp＝204.9℃。1HNMR(400MHz，DMSO-d6，30℃)δppm11.65(s，1H)，8.93(s，1H)，8.54(d，J＝3.9Hz，1H)，8.14(d，J＝8.1Hz，1H)，7.86(s，1H)，7.82(t，J＝7.3Hz，1H)，7.53(s，1H)，7.52(s，1H)，7.20(ddd，J＝1.0，4.9，7.4Hz，1H)，6.71(br.s.，1H)，6.08(br.s.，1H)，5.66(br.s.，1H)，5.53(br.s.，1H)，5.31-4.79(m，1H)，3.82(s，3H)，3.15-2.93(m，3H)，2.76(br.s.，2H)，2.46(br.s.，2H)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6，80℃)δppm11.41(br.s.，1H)，8.59(s，1H)，8.55-8.52(m，1H)，8.13(d，J＝8.1Hz，1H)，7.84(s，1H)，7.80(dt，J＝1.9,7.7Hz，1H)，7.55(s，1H)，7.50(s，1H)，7.18(ddd，J＝1.0，4.8，7.4Hz，1H)，6.66(dd，J＝10.6，16.8Hz，1H)，6.05(dd，J＝2.3，16.8Hz，1H)，5.63(dd，J＝2.3，10.5Hz，1H)，5.59-5.53(m，1H)，5.00(t，J＝8.0Hz，1H)，3.82(s，3H)，3.04(s，3H)，2.82-2.71(m，2H)，2.55-2.45(m，2H)。C23H24N8O2的m/z(APCI+)为445.2(M+H)+。元素分析：实测值：C，61.96；H，5.50；N，24.93。C23H24N8O2+0.038EtOAc+0.030当量EtOH需要C，62.06；H，5.49；N，24.95。
实施例3：N-[反式-3-({5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氨基)环丁基]-N-甲基丙-2-烯酰胺(“化合物C”)
步骤1：甲基{顺式-3-[1-甲基-1-(三甲基硅基)乙氧基]环丁基}氨基甲酸叔丁酯的制备
将TBSCl(12.7克，84毫摩尔，1.50当量)添加至吡啶(150毫升)中的(顺式-3-羟基环丁基)氨基甲酸叔丁酯(10.5克，56毫摩尔，1.00当量)的溶液中。在添加之后，将混合物在环境温度下搅拌3小时。TLC(石油醚/EtOAc＝3/1)显示原料完全消耗。将反应混合物浓缩且将残余物以EtOAc(3×100毫升)萃取。将合并的有机层浓缩，得到成为油的粗制物{顺式-3-[1-甲基-1-(三甲基硅基)乙氧基]环丁基}氨基甲酸叔丁酯，在未进一步纯化的情况下将其用于下一步骤中。
将粗制物{顺式-3-[1-甲基-1-(三甲基硅基)乙氧基]环丁基}氨基甲酸叔丁酯在THF(300毫升)中稀释，以NaH(60％，3.36克，84毫摩尔，1.50当量)分批处理且在室温下搅拌30分钟。将混合物冷却至0℃且以甲基碘(23.9克，168毫摩尔，3.0当量)以逐滴方式处理。在添加之后，将反应混合物在环境温度下搅拌5小时。TLC(石油醚/EtOAc＝10/1)显示原料已完全消耗。将反应混合物浓缩且经由硅胶色谱法(石油醚/EtOAc＝10/1)纯化，得到成为油的标题化合物(18克，100％)。
步骤2：(顺式-3-羟基环丁基)甲基氨基甲酸叔丁酯的制备
将TBAF(22.0克，84毫摩尔，1.50当量)分批添加至THF(200毫升)中的甲基{顺式-3-[1-甲基-1-(三甲基硅基)乙氧基]环丁基}氨基甲酸叔丁酯(18克，56毫摩尔，1.0当量)的溶液中。在添加之后，将混合物在环境温度下搅拌3小时。TLC(石油醚：EtOAc＝2：1)显示原料完全消耗。将反应混合物浓缩且将残余物以柱色谱法(石油醚：EtOAc＝2：1)纯化，得到成为白色固体的标题化合物(8.9克，79％的收率)。
步骤3：(反式-3-氨基环丁基)甲基氨基甲酸叔丁酯的制备
将MsCl(14.1克，0.123摩尔，1.38当量)以逐滴方式经30分钟添加至DCM(300毫升)中的(顺式-3-羟基环丁基)甲基氨基甲酸叔丁酯(18.0克，0.089摩尔，1.0当量)及三乙胺(37毫升，0.267摩尔，3.0当量)的剧烈搅拌的冷却(-30℃)溶液中。接着容许反应混合物温热至环境温度且搅拌1小时。将反应混合物以水(100毫升)和DCM(200毫升)稀释。将有机相分离，以水(2×100毫升)、饱和NH4Cl水溶液(3×100毫升)和盐水(100毫升)清洗，经无水Na2SO4干燥且浓缩，得到成为黄色固体的粗制物顺式-甲烷磺酸-3-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]环丁酯，在未进一步纯化的情况下将其用于下一步骤中。
将上述所获得的粗制物顺式-甲烷磺酸-3-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]环丁酯溶解在DMF(250毫升)中且以NaN3(28.77克，0.44摩尔，5当量)处理。接着将所得混合物加热至70℃且搅拌过夜。在冷却之后，将水(1500毫升)及EtOAc(300毫升)添加至反应混合物中。将相分离且将水层以EtOAc(3×300毫升)萃取。将合并的有机相以饱和NaHCO3水溶液(2×100毫升)、水(2×200毫升)和盐水(100毫升)清洗，经无水Na2SO4干燥且蒸发，得到粗制物(反式-3-叠氮基环丁基)甲基氨基甲酸叔丁酯，将其直接用于下一步骤中。
将MeOH中的饱和NH3(200毫升)经由注射器添加至氢气氛围下在MeOH(100毫升)中的上述粗制物(反式-3-叠氮基环丁基)甲基氨基甲酸叔丁酯与Pd/C(2.5克)的混合物中。将所得混合物在环境温度下搅拌36小时。将反应混合物过滤且将滤液在减压下浓缩。将此粗制物质以从1/10至1/1的EtOAc/石油醚的柱色谱法纯化，得到成为黄色液体的标题化合物(13.6克，经3个步骤的76.4％的收率)。
步骤4：2,4,5-三氯-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶的制备
将N-氯琥珀酰亚胺(44.5克，332毫摩尔，1.05当量)在环境温度添加至DMF(1800毫升)中的如实施例2，步骤1中所制备的2,4-二氯-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(100.0克，316毫摩尔，1.0当量)的溶液中。接着将所得混合物在80℃下搅拌3小时。接着将反应混合物冷却至环境温度且倒入冰水(3升)中。收集所形成的白色沉淀物且在真空中干燥，得到成为灰色固体的标题化合物(99.7克，90％的收率)。1HNMR(400MHz，CDCl3)δppm＝7.35(s，1H)，5.58(s，2H)，3.60-3.49(m，2H)，1.00-0.89(m，2H)，-0.02(s，9H)。C12H16Cl3N3OSi的m/z(APCI+)为352.0(M+H)+。
步骤5：1,3-二甲基-1H-吡唑-4-胺的制备
将MeOH(15毫升)中的1,3-二甲基-1H-吡唑-4-胺盐酸盐(800毫克)的溶液以氢氧化物树脂(BioRadAG1-X2树脂，目录#143-1255)处理，直到获得pH～8为止。将混合物搅拌15分钟。将树脂滤除且以数份MeOH清洗。将滤液在减压下浓缩，得到标题化合物(615.3毫克，94％的收率)。此材料系以未进一步纯化而使用。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm＝6.89(s，1H)3.57(s，3H)3.54(br.s.，2H)1.96(s，3H)。C5H9N3的m/z(APCI+)为112.1(M+H)+。
步骤6：{反式-3-[(2,5-二氯-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]环丁基}甲基氨基甲酸叔丁酯的制备
将MeCN(21.0毫升，0.2M)中的(反式-3-氨基环丁基)甲基氨基甲酸叔丁酯(1020毫克，5.1毫摩尔，1.2当量)、2,4,5-三氯-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(1500毫克，4.253毫摩尔，1.0当量)与DIPEA(2.12毫升，12.8毫摩尔，3.0当量)的混合物在80℃下加热5.5小时。将反应混合物以水稀释且以EtOAc萃取。将有机层经Na2SO4干燥且浓缩。将残余物经由急骤色谱法(在庚烷中的10至30％EtOAc)纯化，得到成为透明胶的标题化合物(2.22克，100％的收率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm＝7.54(s，1H)7.05(d，J＝5.99Hz，1H)5.40(s，2H)4.74(br.s.，1H)4.41-4.54(m，1H)3.45-3.54(m，2H)2.83(s，3H)2.52-2.63(m，2H)2.28-2.42(m，2H)1.40(s，9H)0.78-0.89(m，2H)-0.08(s，9H)。C22H35Cl2N5O3Si的m/z(APCI+)为516.2(M+H)+。
步骤7：{反式-3-[(5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]环丁基}甲基氨基甲酸叔丁酯的制备
将Pd2(dba)3(393毫克，0.425毫摩尔，0.1当量)、Xantphos(259毫克，0.425毫摩尔，0.1当量)及Cs2CO3(4160毫克，12.8毫摩尔，3.0当量)装入含有1,3-二甲基-1H-吡唑-4-胺(567毫克，5.10毫摩尔，1.2当量)及{反式-3-[(2,5-二氯-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]环丁基}甲基氨基甲酸叔丁酯(2197毫克，4.253毫摩尔，1.00当量)的烧瓶中。添加1,4-二烷(42毫升，0.1M)且将混合物加热至105℃经18小时。将反应冷却至室温且经由硅藻土垫过滤。将滤液浓缩且将残余物经由急骤色谱法(在庚烷中的40-60％EtOAc)纯化，得到成为泡沫的标题化合物(1950毫克，78％的收率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δppm＝8.03(s，1H)7.87(s，1H)7.10(s，1H)6.33(d，J＝6.24Hz，1H)5.35(s，2H)4.67(br.s.，1H)4.55(br.s.，1H)3.68-3.75(m，3H)3.45-3.53(m，2H)2.85(s，3H)2.52-2.60(m，2H)2.29-2.38(m，2H)2.12(s，3H)1.40(s，9H)0.78-0.88(m，2H)-0.10(s，9H)。C27H43ClN8O3Si的m/z(APCI+)为591.3(M+H)+。
步骤8：N-[反式-3-({5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氨基)环丁基]-N-甲基丙-2-烯酰胺的制备
将TFA(31毫升)添加至DCM(42毫升)中的{反式-3-[(5-氯-2-[(1,3-二甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7-{[2-(三甲基硅基)乙氧基]甲基}-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)氨基]环丁基}甲基氨基甲酸叔丁酯(1950毫克，3.30毫摩尔，1.0当量)的冷却(0℃)溶液中。容许反应混合物来到室温且再搅拌16小时。接着将反应混合物以甲苯(30毫升)稀释且浓缩至干燥。将所得粗制残余物溶解在1,4-二烷(20毫升)和浓NH4OH水溶液(20毫升)中且在环境温度下搅拌3小时。接着将反应混合物蒸发至干燥。将所得粗制固体分配在EtOAc(140毫升)与饱和Na2CO3水溶液(140毫升)之间且以丙烯酰氯(0.420毫升，5.19毫摩尔，1.58当量)剧烈搅拌处理1小时。在此时将层分离且将水层以EtOAc(50毫升)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，以甲苯(30毫升)稀释且蒸发至干燥。将所得固体以使用ZymorSpherHAP150×21.2毫米柱，以20-40％EtOH4％/分钟，140巴，55毫升/分钟的SFC纯化，得到成为灰色粉末的标题化合物(950毫克，69％的收率)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6，26℃)δppm＝11.16(br.s.，1H)，7.80(br.s.，1H)，7.77(s，1H)，6.88(d，J＝2.4Hz，1H)，6.74(dd，J＝10.5，16.7Hz，1H)，6.32(br.s.，1H)，6.07(d，J＝15.9Hz，1H)，5.66(d，J＝10.4Hz，1H)，5.30-4.75(m，1H)，4.59(br.s.，1H)，3.71(s，3H)，3.15-2.88(m，3H)，2.62(br.s.，2H)，2.40(br.s.，2H)，2.08(s，3H)。1HNMR(400MHz，DMSO-d6，80℃)δppm＝10.93(br.s.，1H)，7.73(s，1H)，7.41(br.s.，1H)，6.82(d，J＝2.2Hz，1H)，6.68(dd，J＝10.5，16.9Hz，1H)，6.16(d，J＝5.9Hz，1H)，6.05(dd，J＝2.4,16.8Hz，1H)，5.63(dd，J＝2.4，10.5Hz，1H)，4.94(t，J＝8.0Hz，1H)，4.60(dd，J＝4.0，8.7Hz，1H)，3.72(s，3H)，3.04(s，3H)，
2.72-2.57(m，2H)，2.41(ddd，J＝4.5，8.9，13.6Hz，2H)，2.10(s，3H)。C19H23ClN8O3的m/z(APCI+)为415.1(M+H)+。
实施例4：1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(3-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮(“化合物D”)的制备
以类似于实施例1的方式制备，以3-甲氧基-1-甲基-1H-吡唑-4-胺替代1-甲基-1H-吡唑-4-胺及其他的非关键性替代。
关键中间物的实验程序
制备例1：3-(羟甲基)-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯的制备
步骤1：(2E)-4-{[叔丁基(二甲基)硅基]氧基}丁-2-烯酸乙酯的制备
将DIEA(2.75毫升，16.6毫摩尔)及LiCl(5.54克，129毫摩尔)添加至CH3CN(40毫升)中的叔丁基二甲基硅氧基乙醛(3.22克，18.5毫摩尔)及膦酰基乙酸二乙基甲酯(4.66克，22.2毫摩尔)的溶液中且将混合物在室温下搅拌24小时。将混合物以水(50毫升)淬灭且以EtOAc(50毫升)萃取。将有机层经MgSO4干燥且浓缩。将残余物经由以25％EtOAc/庚烷洗脱的急骤色谱法纯化，得到成为无色油的标题化合物(3.27克，72％的收率)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm6.91(dt，J＝15.42，3.49Hz，1H)6.01(dt，J＝15.61，2.27Hz，1H)4.25(dd，J＝3.27，2.27Hz，2H)4.12(q，J＝7.22Hz，2H)1.21(t，J＝7.18Hz，3H)0.84(s，9H)0.00(s，6H)。
步骤2：反式-1-苯甲基-4-({[叔丁基(二甲基)硅基]氧基}甲基)吡咯烷-3-羧酸乙酯的制备
将TFA(0.280毫升，3.64毫摩尔)在0℃下添加至CH2Cl2(30毫升)中的(2E)-4-{[叔丁基(二甲基)硅基]氧基}丁-2-烯酸乙酯(3.27克，13.4毫摩尔)及N-苯甲基-1-甲氧基-N-((三甲基硅基)甲基)甲胺(4.14克，17.5毫摩尔)的溶液中。将反应在室温下搅拌过夜。将混合物以水(50毫升)淬灭且以EtOAc(2×50毫升)萃取。将合并的有机层经MgSO4干燥且浓缩。将残余物经由以20％EtOAc/庚烷洗脱的急骤色谱法纯化，得到成为淡黄色油的标题化合物(2.61克，53％的收率)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm7.08-7.41(m，5H)，4.10(q，J＝7.13Hz，2H)，3.42-3.73(m，4H)，2.37-2.90(m，6H)，1.22(t，J＝7.05Hz，3H)，0.84(s，9H)，0.00(d，J＝1.26Hz，6H)。
步骤3：反式-3-乙基-4-({[叔丁基(二甲基)硅基]氧基}甲基)吡咯烷-1,3-二羧酸-1-叔丁酯的制备
将Pd(OH)2(300毫克)及Boc2O(1.90克，8.61毫摩尔)添加至EtOH(40毫升)中的反式-1-苯甲基-4-({[叔丁基(二甲基)硅基]氧基}甲基)吡咯烷-3-羧酸乙酯(反式混合物)(3.25克，8.61毫摩尔)的溶液中。将混合物在H2(50psi，50℃)下搅拌过夜。将混合物经由硅藻土过滤且将滤液浓缩。将残余物经由以5％-10％EtOAc/庚烷洗脱的急骤色谱法纯化，得到成为无色油的标题化合物(3.08克，92％的收率)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm4.13-4.25(m，2H)3.65(m，5H)3.14-3.29(m，1H)2.84-3.00(m，1H)2.47-2.70(m，1H)1.46(s，9H)1.27(td，J＝7.11，2.64Hz，3H)0.85-0.92(m，9H)0.05(s，6H)。
步骤4：反式-3-({[叔丁基(二甲基)硅基]氧基}甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯的制备
将LiBH4(911毫克，39.7毫摩尔)添加至THF(25毫升)中的反式-3-乙基-4-({[叔丁基(二甲基)硅基]氧基}甲基)吡咯烷-1,3-二羧酸-1-叔丁酯(3.08克，7.95毫摩尔)的溶液中。将混合物加热至回流经3小时。将反应混合物冷却至室温，接着以水(15毫升)淬灭且在室温下搅拌1小时。将混合物以水(60毫升)稀释且以乙酸乙酯(2×80毫升)萃取。将合并的有机层以盐水清洗，经Na2SO4干燥且在真空中浓缩，得到无色油。将粗制产物经由以30％EtOAc/庚烷洗脱的急骤色谱法纯化，得到成为无色油的标题化合物(2.34克，86％的收率)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm3.73(m，1H)，3.61(m，2H)，3.52(m，2H)，3.45(m，1H)，2.90-3.09(m，2H)，2.04-2.32(m，2H)，1.46(s，9H)，0.92(s，9H)，0.10(d，J＝1.01Hz，6H)。
步骤5：反式-3-({[叔丁基(二甲基)硅基]氧基}甲基)-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯的制备
将碘化四丁基铵(0.110克，0.28毫摩尔)、50％NaOH水溶液(20毫升)及硫酸二甲酯(0.325毫升，3.41毫摩尔)添加至CH2Cl2(20毫升)中的反式-3-({[叔丁基(二甲基)硅基]氧基}甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(0.982克，2.84毫摩尔)的溶液中。将反应在室温下搅拌过夜。TLC显示剩余一些原料，所以将额外的硫酸二甲酯(0.150毫升)添加至反应混合物中且在室温下搅拌3小时。将NH3OH水溶液(30毫升)添加至反应混合物中且在室温下搅拌1小时。将混合物以水(20毫升)稀释且以CH2Cl2(2×30毫升)萃取。将有机层经MgSO4干燥且浓缩。将残余物经由以10％EtOAc/庚烷洗脱的急骤色谱法纯化，得到成为无色油的标题化合物(451毫克，44％的收率)。1HNMR(400MHz，氯仿-d)δppm3.60-3.70(m，1H)，3.55(br.s.，2H)，3.37-3.48(m，1H)，3.34(m，4H)，3.05-3.23(m，2H)，2.22-2.40(m，1H)，2.07-2.21(m，1H)，1.43-1.49(m，9H)，0.89(s，9H)，0.05(s，6H)。
步骤6：反式-3-(羟甲基)-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯的制备
将TBAF(1.0M于THF中，2.45毫升，2.45毫摩尔)添加至THF(5毫升)中的反式-3-({[叔丁基(二甲基)硅基]氧基}甲基)-4-(甲氧基甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(290毫克，0.81毫摩尔)的溶液中。将混合物在室温下搅拌1小时。将混合物以水淬灭且以EtOAc萃取。将有机层经MgSO4干燥且浓缩。以未纯化的粗制产物用于后续步骤中。
制备例2：(反式-3-氨基环丁基)甲基氨基甲酸叔丁酯的制备
步骤1：3-亚甲基环丁烷羧酸的制备
将氢氧化钾(264克，4.7摩尔)添加至乙醇(500毫升)及水(500毫升)中的3-亚甲基环丁烷甲腈(110克，1.18摩尔)的溶液中且将所得混合物回流过夜。在减压下除去乙醇，接着将溶液冷却至低于10℃且以浓缩HCl酸化至pH1。将混合物以EtOAc(2×500毫升)萃取，将合并的有机萃取物经无水硫酸钠干燥且在真空下浓缩，得到成为黄色油的标题化合物(132克，100％的收率)。
步骤2：(3-亚甲基环丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将DPPA(574克，1.41摩尔)逐滴添加至叔丁醇(1升)中的3-亚甲基环丁烷羧酸(132克，1.17摩尔)及Et3N(178克，1.76摩尔)的溶液中且将所得混合物回流过夜。接着将混合物以水(100毫升)淬灭。在除去叔丁醇之后，将残余物以饱和NH4Cl(500毫升)处理且收集所得固体沉淀物，以饱和NH4Cl和饱和NaHCO3清洗，得到成为白色固体的标题化合物(165克，77％的收率)。
步骤3：(3-酮环丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将O3在-78℃下在CH2Cl2(1000毫升)及MeOH(1000毫升)中的(3-亚甲基环丁基)氨基甲酸叔丁酯(165克，0.91摩尔)的溶液中起泡，直到溶液转变成蓝色为止。TLC(石油醚：EtOAc＝10：1)显示原料完全消耗。接着将氮气通过反应起泡，以除去过量O3，接着将混合物以Me2S(200毫升)淬灭且搅拌1小时。将溶液浓缩，得到残余物，将其以饱和NaHCO3和水清洗，得到成为白色固体的标题化合物(118克，70％的收率)。
步骤4：(顺式-3-羟基环丁基)氨基甲酸叔丁酯的制备
将THF中的三仲丁基硼酸氢锂溶液(648毫升，1M)经1.5小时逐滴添加至-72℃下在THF(2000毫升)中的(3-酮环丁基)氨基甲酸叔丁酯(100克，54毫摩尔)的溶液中。容许所得溶液温热至室温且再搅拌1小时。TLC(石油醚：EtOAc＝2：1)显示原料完全消耗。将反应以NH4Cl水溶液淬灭。将水(1000毫升)及EtOAc(2000毫升)添加至混合物中。将有机层分离，经MgSO4干燥且浓缩，得到粗制物质，将其以从10：1至1：2的石油醚：EtOAc的柱色谱法纯化，得到成为白色固体的标题化合物(62克，61％的收率)。
步骤5：{顺式-3-[1-甲基-1-(三甲基硅基)乙氧基]环丁基}氨基甲酸叔丁酯的制备
将TBSCl(159克，1.056摩尔)添加至吡啶(1升)中的(顺式-3-羟基环丁基)氨基甲酸叔丁酯(62克，0.33摩尔)的溶液中。在添加之后，将混合物在环境温度下搅拌过夜。TLC(石油醚：EtOAc＝2：1)显示原料完全消耗。接着将反应浓缩，以EtOAc(1升)稀释，将有机层分离且以水(3×300毫升)和盐水(200毫升)清洗，经MgSO4干燥，过滤且浓缩至干燥，得到粗制标题化合物(108克)，其以未进一步纯化而直接用于下一步骤中。
步骤6：甲基{顺式-3-[1-甲基-1-(三甲基硅基)乙氧基]环丁基}氨基甲酸叔丁酯的制备
将NaH(60％于油中，39.6克，0.99摩尔)分批添加至THF(1升)中的粗制物{顺式-3-[1-甲基-1-(三甲基硅基)乙氧基]环丁基}氨基甲酸叔丁酯(108克)的溶液中且将所得混合物在室温下搅拌30分钟。接着将混合物冷却至0℃且逐滴添加碘甲烷(140.58克，0.99摩尔)。在添加之后，将混合物从0℃搅拌至室温过夜。将混合物以饱和NH4Cl淬灭，添加水(200毫升)且以EtOAc萃取。将有机层以盐水清洗，经Na2SO4干燥，接着蒸发，得到粗制产物，将其经由硅胶色谱法纯化，得到成为油的标题化合物(68.9克，87％的收率)。
步骤7：(顺式-3-羟基环丁基)甲基氨基甲酸叔丁酯的制备
将TBAF(62克，0.24摩尔)分批添加至吡啶(800毫升)中的甲基{顺式-3-[1-甲基-1-(三甲基硅基)乙氧基]环丁基}氨基甲酸叔丁酯(68.9克，0.217摩尔)的溶液中。在添加之后，将混合物在室温下搅拌2小时。将混合物蒸发至干燥，将残余物溶解在1000毫升乙酸乙酯中且以浓缩NH4Cl(3×200毫升)清洗。将有机层经Na2SO4干燥，过滤且浓缩，得到粗制产物，将其以从1/20至1/5的EtOAc/石油醚的柱色谱法纯化，得到成为白色固体的标题化合物(26.3克，60％的收率)。
步骤8：顺式-甲烷磺酸3-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]环丁酯的制备
将三乙胺(4.14毫升，29.79毫摩尔)添加至CH2Cl2(30毫升)中的(顺式-3-羟基环丁基)甲基氨基甲酸叔丁酯(2.0克，9.93毫摩尔)的溶液中且将所得混合物在剧烈搅拌时冷却至-30℃。经10分钟期间逐滴添加甲磺酰氯(1.36克，11.91毫摩尔)。接着容许混合物温热至室温且搅拌1小时，直到TLC分析(MeOH/CH2Cl2＝1/15)显示反应完成为止。接着将反应混合物以水(2×10毫升)、NH4Cl水溶液(10毫升)、盐水(10毫升)清洗，经无水Na2SO4干燥且浓缩，得到成为黄色固体的标题化合物(2.5克，91％的收率)，将其直接用于下一步骤中。
步骤9：(反式-3-叠氮基环丁基)甲基氨基甲酸叔丁酯的制备
将顺式甲烷磺酸-3-[(叔丁氧基羰基)(甲基)氨基]环丁酯(2.5克，8.94毫摩尔)溶解在DMF(25毫升)中且添加NaN3(2.84克，43.69毫摩尔)。接着将所得混合物加热至70℃且搅拌过夜。在冷却之后，添加水(150毫升)且将混合物以EtOAc(3×50毫升)萃取。将合并的有机相以水(3×20毫升)和盐水(20毫升)清洗，经无水Na2SO4干燥，接着在真空中浓缩，得到成为黄色液体的标题化合物(1.8克，89％的收率)，其以未进一步纯化而使用。
步骤10：(反式-3-氨基环丁基)甲基氨基甲酸叔丁酯的制备
将NH3(克)/MeOH(饱和，50毫升)经由注射器添加至氢气氛围(氢气球)下在MeOH(5毫升)中的(反式-3-叠氮基环丁基)甲基氨基甲酸叔丁酯(1.8克，7.95毫摩尔)与Pd/C(200毫克)的混合物中。将所得混合物在室温下搅拌3小时，直到TLC分析(EtOAc：石油醚＝1：2)显示反应完成为止。将Pd/C滤除，将所得溶液浓缩且在真空中干燥，得到粗制标题化合物(1.6克)，在未进一步纯化的情况下将其用于以下步骤中。
表1
生物学实施例
实施例5：pEGFRY1068ELISA测定法
为了表征EGFRT790M抑制剂在具有不同EGFR突变状况的细胞中的效果，在具有野生型EGFR或EGFR双突变体(L858R+T790M、EGFRdelE746-A750+T790M)的细胞中测定了Tyr1068处的EGFR的磷酸化抑制作用。Y1068处的EGFR的磷酸化通过磷酸化-EGF受体(Try1068)夹心式ELISA试剂盒(#7240,CellSignalingDanvers,MA)测量。磷酸化-EGF受体(Try1068)夹心式ELISA试剂盒为固相夹心式酶联免疫吸附测定法(ELISA)，其检测磷酸化-EGF受体(Tyr1068)蛋白的内源性含量。在此测定法中评估了以下细胞系：A549(EGFR野生型，内源)、NCI-H1975(EGFRL858R+T790M，内源)、NIH3T3/EGFR_野生型、NIH3T3/EGFRL858R+T790M和PC9-DRH(EGFRdelE746-A750+T790M)。NIH/3T3亲代细胞、A549及NCI-H1975细胞购自美国典型培养物保存中心(AmericanTypeCultureCollection)(Manassas,VA)。所有的细胞根据ATCC建议进行培养。使A549细胞在以10％FBS(Sigma,StLouis,MO)及1％Penn/Strep(Invitrogen)补充的RPMI培养基(Invitrogen，Carlsbad)中生长。使NCI-H1975细胞在以10％FBS(Sigma)及1％Penn/Strep(Invitrogen)补充的RPMI(Invitrogen)中生长。使NIH/3T3细胞在以10％新生小牛血清(Invitrogen)补充的DMEM(Invitrogen)中生长，并且使NIH3T3/EGFR突变细胞在具有5微克/毫升的嘌呤霉素(Invitrogen)的完全培养基中生长。PC9-DRH细胞如实施例6中所述方式产生及培养。具有各种EGFR构建体的质粒(pLPCX)由GenScript(Piscataway,NJ)制得，及表达这些构建体的NIH/3T3细胞的稳定池在辉瑞拉霍亚(PfizerLaJolla)制得。在经组织培养物处理的透明微量滴定板(#3595,CorningInc,Corning,NY)的底部上将细胞铺在完全培养基中(50微升/孔)且容许在37℃，5％CO2下过夜附着。将细胞以下列浓度接种：(A549：40,000/孔，NCI-H1975：40,000/孔，NIH3T3：20,000/孔，PC9-DRH：50,000/孔)。次日，在96孔透明V形底的0.5毫升聚丙烯阻断板(#3956,Corning,Inc)中准备化合物稀释板。不是对每个化合物都评估所有的细胞系。将所评估的各化合物制备成DMSO储备溶液(10mM)。各板上的化合物以11点连续稀释曲线(1：3稀释)双份重复测试。将化合物处理液(50微升)自化合物稀释板添加至细胞板中。化合物最高浓度为1或10μM(最终浓度)，具有0.3％的DMSO(#D-5879,Sigma)最终浓度。接着将板在37℃，5％CO2下培育2小时。关于NIH3T3/野生型测定法，在化合物处理之前，将细胞经24小时血清饥饿；细胞在所述的无血清培养基中进行处理，接着以EGF(100纳克/毫升，Calbiochem/EMDChemicals,Gibbstown,NJ)刺激10分钟。关于A549/野生型测定法，在化合物处理之前，将细胞覆盖在全血清(10％)培养基中24小时；细胞在所述的全血清培养基中处理，接着以EGF(40纳克/毫升/饥饿培养基，Invitrogen)刺激10分钟。在培育即将结束之前，制备冰冷的溶胞缓冲液(在纯水中的1x细胞溶解缓冲液(#9803,CellSignalingTechnology)、1mM原钒酸钠(Na3VO4,#96508,Sigma)、1mM苯基甲烷磺酰氟(PMSF,52332,CalBiochem/EMDChemicals)、完全小型无EDTA蛋白酶抑制剂混合物片剂(1个片剂/10毫升，#11836170001,Roche,Indianapolis,IN)及PhosSTOP磷酸酶抑制剂混合物片剂(1个片剂/10毫升，#04906837001,Roche))。在2小时结束时，轻轻抖掉培养基且将细胞以PBS中冰冷的1mMNa3VO4(100微升/孔，Invitrogen)清洗一次。接着轻轻抖掉清洗液且将冰冷的溶胞缓冲液(50微升/孔)添加至细胞中。将板在4℃下震荡20-30分钟，使细胞完全溶解。将样品稀释剂(50微升/孔)添加至ELISA板中，且将溶胞产物(50微升)稀释至ELISA板的各孔中的样品稀释剂中。将板密封且在4℃下以震荡培育过夜。次日，将孔以1x清洗缓冲液清洗四次；在最后清洗之后以无绒纸包裹板，随后将Add检测抗体(绿色，100微升/孔)添加至各孔中且在37℃培育1小时。在培育之后，将孔如所述方式清洗。将连结HRP的二次抗体(红色，100微升/孔)添加至各孔中且在37℃培育30分钟。在培育之后，将孔如所述方式清洗。将TMB底物(100微升/孔)添加至各孔中且将板在37℃培育10分钟或在最高的室温下培育30分钟。在培育结束时，将终止溶液(100微升/孔)添加至各孔中且将板温和震荡数秒钟。在添加终止溶液之后30分钟内，在检测吸光度的PerkinElmerEnVisionExciteMultilabelReaderMethod上或在检测吸光度的MolecularDevicesSpectraMax384Reader上读取在450纳米下的吸光度。使用MicrosoftExcel中的四参数拟合分析数据。
将所测试的化合物的pEGFRY1068ELISA测定法的结果列示于表2中。除非另有其他说明，在表2中所示的T790M_L858R的pEGFRELISAIC50数据为3T3细胞系的数据。
表2
实施例6：RPC9和PC9-DRH细胞的产生及表征
步骤1：自PC9细胞产生RPC9细胞
在亲代PC9细胞中，将EGFRdelE746-A750突变等位基因扩增且不可检测出野生型EGFR等位基因。利用亲代PC9细胞细胞产生RPC9细胞。将PC9细胞在以10％热失活的FBS补充的RPMI1640培养基中在37℃，5％CO2下培育。为了产生EGFR抑制剂抗性细胞系，将PC9细胞最初以0.5nM达克替尼处理。一旦细胞生长至90％的汇合度时，使细胞分裂且将药物浓度升高2倍。在以此处理6周之后，PC9细胞能够在2nM达克替尼中生长。产生单细胞克隆且选择10个用于进一步表征。将那些抗性细胞维持在含有2μM厄洛替尼的生长培养基中且将抗性PC9称为RPC9。
步骤2：CastPCR分析
使用QiagenDNA小型试剂盒依照制造商指示自RPC9细胞的克隆中萃取基因组DNA，且依照制造商(ABI)的方案使其经受castPCR(引物组：Hs00000106_wt和Hs00000105)。经由ABI突变检测器软件分析数据。
步骤3：细胞生存力IC50测定
将每孔3000个RPC9细胞接种在96孔板(Corning)的双份重复孔中的90微升生长培养基中。在24小时之后，将细胞以达克替尼或厄洛替尼在10微升生长培养基中以3倍稀释的11点滴定方式处理。最高的最终浓度为10μM。在处理72小时之后，依照制造商指示经由CTG测定法(Promega)分析细胞。
步骤4：带有EGFRT790M突变的RPC9细胞的表征
在步骤1中产生的10个克隆中，Sanger测序鉴定了在EGFR外显子20中的C>T突变，其对应于临床相关的T790M突变。将代表性克隆，RPC9克隆3和克隆6的序列显示于图1中。经由castPCR的进一步确认显示在RPC9克隆3和6中分别有10.2％及11.9％的带有EGFRT790M突变的EGFR等位基因(图1)。PC9细胞对达克替尼(图2A)非常敏感。即使最低浓度(0.17nM)的达克替尼亦抑制96％的PC9细胞生存力(图2A)。不能根据剂量反应曲线计算出IC50。RPC9克隆3和6更具有抗性，IC50为73和64nM(图2A)。当RPC9克隆3和6以厄洛替尼处理时，在细胞生存力测定法中，与PC9细胞相比，RPC9克隆3和6显示的IC50增加了超过200倍(图2B)。
因此，产生了带有EGFRT790M突变及对EGFR抑制剂(诸如达克替尼和厄洛替尼)具有抗性的RPC9细胞。RPC9细胞含有单突变体(EGFRdelE746-A750)及双突变体(EGFRdelE746-A750和T790M)EGFR等位基因二者的混合物，因为EGFRT790M等位基因占RPC9细胞中总EGFR等位基因的约10％。
步骤5：PC9-DRH细胞的产生及表征
除了RPC9细胞以外，亦产生了PC9-DRH细胞(DRH＝对达克替尼高抗性的T790M)。如步骤1中所述，对2nM达克替尼具有抗性的RPC9细胞池在8周内以浓度从2nM增加至2μM的达克替尼进一步攻击。如步骤1中所述，将PC9-DRH细胞维持在含有2μM达克替尼的生长培养基中。如步骤2、3和4中所述，分析PC9-DRH细胞。PC9-DRH细胞含有70％的彼等的EGFR等位基因成为双突变体EGFRdelE746-A750和T790M。与RPC9细胞相似，PC9-DRH细胞对达克替尼(IC50＝1,651nM)、厄洛替尼(IC50>10,000nM)及吉非替尼(IC50>10,000nM)具有抗性。当用于如实施例5中所述的pEGFRY1068ELISA测定法中时，自生长培养基中移出2μM达克替尼且容许细胞生长36小时，随后用于ELISA测定法中。
实施例7：利用单独或与达克替尼或厄洛替尼组合的EGFRT790M抑制剂的RPC9细胞生存力
将每孔3000个如实施例6所制备的RPC9细胞接种在96孔板(Corning)的双份重复孔中的90微升生长培养基中。在24小时之后，以EGFRT790M抑制剂之一，化合物A、化合物B、化合物C或化合物D，组合或不组合4nM达克替尼或300nM厄洛替尼，以3倍稀释的11点滴定方式，在10微升生长培养基中处理细胞。最高的最终浓度为10μM的化合物A、化合物B、化合物C或化合物D。在处理72小时之后，细胞依照制造商指示经由CTG测定法(Promega)进行分析。
达克替尼和厄洛替尼的标准临床给药方案的稳态时的游离血浆浓度分别为4nM和300nM。在这些浓度下，达克替尼和厄洛替尼完全抑制亲代PC9细胞生存力(图2A和2B)。没有任一药物在相同的浓度下显著地抑制RPC9细胞生存力(图2A和2B)。
以化合物A与达克替尼或厄洛替尼的组合使RPC9克隆6细胞中生存力的抑制作用增强(图3A和3B)。与4nM达克替尼组合时，化合物A的生存力IC50为17nM，与300nM厄洛替尼组合时为15nM(表3)。与单独的化合物A处理相比，组合的化合物A的生存力IC50降低超过11倍。同样地，当RPC9克隆6细胞以化合物B处理时，达克替尼和厄洛替尼亦使RPC9克隆6对化合物B敏感(图4A和4B)。与达克替尼组合时，化合物B的生存力IC50为4nM，与厄洛替尼组合时为5nM(表3)。与单独的化合物B处理相比，生存力IC50降低了9.5倍和7.6倍。重要的是，设计的对化合物A的人类暴露量为190nM，以此浓度的化合物A单独抑制约40％的细胞生存力。当与达克替尼或厄洛替尼组合时，相同浓度的化合物A达到最大的抑制(83％)(图3A和3B)。类似地，设计的对化合物B的人类暴露量为90nM，以此浓度的化合物B单独达到64％的抑制。组合可能进一步达到至多84％的抑制(图4A和4B)。因此，与达克替尼或厄洛替尼的组合提高了化合物A和化合物B的生存力效果。除了化合物A和化合物B以外，化合物C和化合物D与临床相关浓度的达克替尼和厄洛替尼亦具有协同效果(表3)。
表3.EGFRT790M抑制剂单独或与达克替尼或厄洛替尼组合在RPC9克隆6中的生存力IC50。
总之，在含有双突变形式及单突变形式二者的EGFR的临床相关模型中，特异性靶向单突变形式的EGFR的化合物(诸如达克替尼和厄洛替尼)在它们的临床相关浓度下使用时强化了优先抑制双突变形式的EGFR的化合物(诸如化合物A、化合物B、化合物C和化合物D)。
实施例8：利用单独或与达克替尼、吉非替尼或阿法替尼组合的EGFRT790M抑制剂的RPC9克隆6细胞生存力
使用实施例7的方法，以EGFRT790M抑制剂之一，化合物A或化合物B，组合或不组合4nM达克替尼、20nM吉非替尼或20nM阿法替尼处理细胞。
达克替尼的标准临床给药方案的稳态游离血浆浓度为4nM。吉非替尼和阿法替尼的标准临床给药方案的稳态游离血浆浓度为20nM。
以化合物A与达克替尼、吉非替尼或阿法替尼的组合使RPC9克隆6细胞中生存力的抑制作用增强(图5A、5B和5C)。类似地，当RPC9克隆6细胞以化合物B处理时，达克替尼、吉非替尼或阿法替尼亦使RPC9克隆6对化合物B敏感(图6A、6B和6C)。因此，化合物A和化合物B各自与临床相关浓度的达克替尼、吉非替尼和阿法替尼具有协同效果(图5和6)。与实施例7中的讨论相似，当与吉非替尼及阿法替尼组合时，化合物A的生存力IC50分别降低了19倍和14倍。当与吉非替尼及阿法替尼组合时，化合物B的IC50分别降低了10倍和8倍。
总之，在含有双突变形式及单突变形式二者的EGFR的临床相关模型中，特异性靶向单突变形式的EGFR的化合物(诸如达克替尼、吉非替尼或阿法替尼)在它们的临床相关浓度下使用时强化了优先抑制双突变形式的EGFR的化合物(诸如化合物A和化合物B)。
实施例9：在等位基因混合模型中的EGFRT790M抑制剂与达克替尼或厄洛替尼组合
方法
细胞培养物：如实施例6中所述产生及亚克隆RPC9克隆6细胞。将细胞在具有10％FBS的RPMI中培养且维持在选择的压力下(2nM达克替尼)。为了实验，除去选择性压力，将细胞铺在10厘米盘上且过夜培育(37℃，5％CO2)，以达到70-80％汇合率用于处理。
处理：将达克替尼、厄洛替尼、化合物A和化合物B溶解在100％DMSO中。达克替尼(4nM)和厄洛替尼(300nM)以它们的标准临床给药方案的游离血浆暴露量使用。化合物A和化合物B分别以从低于靶标调节IC50值开始及至多所预测的各化合物的临床游离血浆暴露量的范围使用。将细胞以达克替尼或厄洛替尼处理及/或以化合物A或化合物B的滴定处理，或以对照物(DMSO)处理。实施处理6小时；在培育期结束时，收集细胞沉淀物且冷冻，直到准备好用于分析为止。
免疫印迹：将细胞沉淀物以1mMNa3VO4、1mMPMSF、1mMNaF、1mMβ-甘油磷酸酯、蛋白酶抑制剂混合物(Roche,Indianapolis，IN)及磷酸酶抑制剂混合物(Roche)补充的溶胞缓冲液(150mMNaCl、1.5mMMgCl2、50mMHEPES、10％甘油、1mMEGTA、1％X-100、0.5％NP-40)处理。细胞溶解物的蛋白质浓度使用BCAProteinAssay(Pierce/ThermoFisherScientific，Rockford,IL)按照制造商指示来测定。将蛋白质(10微克)以SDS-PAGE分解且转移至硝化纤维素薄膜(Bio-RadCriterionTMSystem,Hercules,CA)上。斑点以初次抗体探测，以检测目的蛋白质。EGFR、pEGFRY1068、AKT、pAKTS473、ERK和pERKT202/204抗体购自CellSignalingTechnology,Inc(Danvers,MA)。GAPDH抗体购自SantaCruzBiotechnology(SantaCruz,CA)。在以二次抗体培育之后，将薄膜以化学发光(Pierce/ThermoFisherScientific)显现且在FluorChemQImagingSystem(ProteinSimple,SantaClara,CA)上进行光密度测定法。
结果
以达克替尼及化合物A二者处理的细胞在所述两个最低剂量下显示出pEGFR信号降低，其与组合相对于单一药剂疗法具有更大的效果是一致的(达克替尼的77％的抑制，10nM化合物A的24％的抑制相对于达克替尼+10nM化合物A的91％的抑制；30nM化合物A的21％的抑制相对于达克替尼+30nM化合物A的99％的抑制)(图7A，8A)。这些组合在所述最低剂量下显示出大于pERK信号的相加抑制作用(达克替尼的34％的抑制，10nM化合物A的27％的抑制相对于达克替尼+10nM化合物A的100％的抑制)；且在次最高剂量下显示出相加效果(达克替尼的34％的抑制，30nM化合物A的64％的抑制相对于达克替尼+30nM化合物A的99％的抑制)(图7A，8C)。使用单一药剂疗法越高剂量导致pEGFR和pERK信号的越大抑制；可加性计算受到测定法中所观察的最大抑制的限制。形成对比的是，在最低浓度的下pAKT的抑制看起来是相加性的(达克替尼的37％的抑制，10nM化合物A的22％的抑制相对于达克替尼+10nM化合物A的64％的抑制)；但是达不到大于60-65％的抑制，即使在较高的剂量下(图7A，8B)。
以厄洛替尼及化合物A二者处理的细胞在所述三个最低浓度的化合物A下显示出pEGFR信号降低，其大于单一药剂疗法的相加效果(厄洛替尼的61％的抑制，10nM化合物A的41％的抑制相对于厄洛替尼+10nM化合物A的86％的抑制；30nM化合物A的27％的抑制相对于厄洛替尼+30nM化合物A的91％的抑制；100nM化合物A的16％的抑制相对于厄洛替尼+100nM化合物A的95％的抑制)(图7B，9A)。这些处理在所述两个最低剂量下显示出大于pERK信号的相加抑制作用(厄洛替尼的31％的抑制，10nM化合物A的38％的抑制相对于厄洛替尼+10nM化合物A的100％的抑制；30nM化合物A的54％的抑制相对于厄洛替尼+30nM化合物A的100％的抑制；图7B，9C)。使用单一药剂疗法越高剂量导致pEGFR和pERK信号的越大抑制；可加性计算受到测定法中所观察的最大抑制的限制。形成对比的是，在最低浓度的化合物A下pAKT的抑制看起来大于相加值(厄洛替尼的18％的抑制，10nM化合物A的3％的抑制相对于厄洛替尼+10nM化合物A的48％的抑制；图7B，9B)；并且在次最高剂量下是相加性的(厄洛替尼的18％的抑制，以30nM化合物A的31％的抑制相对于厄洛替尼+30nM化合物A的49％的抑制；图7B，9B)，但是达不到大于50％的抑制，即使在较高的剂量下。
以达克替尼及化合物B二者处理的细胞在所述两个最低剂量的化合物B下显示出pEGFR信号降低，其大于单一药剂疗法的相加效果(达克替尼的54％的抑制，以3nM化合物B的46％的抑制相对于达克替尼+3nM化合物B的81％的抑制；10nM化合物B的17％的抑制相对于达克替尼+10nM化合物B的90％的抑制)，且在次最高剂量下显示出相加性(以达克替尼的54％的抑制，以30nM化合物B的33％的抑制相对于以达克替尼+30nM化合物B的90％的抑制)(图10A，11A)。这些相同的细胞在所述最低剂量下显示出pERK信号的相加抑制(达克替尼的57％的抑制，3nM化合物B的55％的抑制相对于达克替尼+3nM化合物B的100％的抑制；图10A，11C)。使用单一药剂疗法越高剂量导致pEGFR及pERK信号的越大抑制；可加性计算受到测定法中所观察的最大抑制的限制。形成对比的是，pAKT的抑制达不到大于72％的抑制，即使在较高的剂量下，且达不到部分或大于相加的结果(图10A，11B)。
以厄洛替尼及化合物B二者处理的细胞在所有浓度的化合物B下显示出pEGFR信号降低，其大于单一药剂疗法的相加效应(厄洛替尼的12％的抑制，3nM化合物B的2％的抑制相对于厄洛替尼+3nM化合物B的74％的抑制；10nM化合物B的8％的抑制相对于厄洛替尼+10nM化合物B的66％的抑制；30nM化合物B的22％的抑制相对于厄洛替尼+30nM化合物B的82％的抑制；100nM化合物B的60％的抑制相对于厄洛替尼+100nM化合物B的84％的抑制)(图10B，12A)。这些处理在所述最低剂量的化合物B下显示出大于pERK信号的相加抑制(厄洛替尼的41％的抑制，3nM化合物B的39％的抑制相对于厄洛替尼+3nM化合物B的99％的抑制；图10B，12C)。使用单一药剂疗法越高剂量导致pEGFR及pERK信号的越大抑制；可加性计算受到测定法中所观察的最大抑制的限制。形成对比的是，pAKT的抑制在最低浓度的化合物B下看起来大于相加值(厄洛替尼的29％的抑制，3nM化合物B的15％的抑制相对于以厄洛替尼+3nM化合物B的54％的抑制)；但是达不到大于62％的抑制，即使在较高的剂量下(图10B，12B)。
实施例10：在RPC9克隆6(达克替尼及厄洛替尼抗性)异种移植
模型中的EGFRT790M抑制剂与达克替尼或厄洛替尼的组合
背景：
RPC9克隆6细胞如实施例6中所述从亲代PC9细胞产生。亲代PC9细胞含有EGFRdelE746-A750且对达克替尼和厄洛替尼的处理敏感。RPC9克隆6细胞系为以达克替尼(“daco”)的剂量递增处理所产生的经选择的抗性克隆之一。RPC9克隆6细胞含有约10％的EGFRdelE746-A750和T790M及90％的EGFRdelE746-A750等位基因。因此，在体外测定法中，RPC9克隆6由于EGFRdelE746-A750及T790M等位基因而对达克替尼/埃罗替单一药剂处理具有抗性，以及由于EGFRdelE746-A750等位基因而对化合物A(“compdA”)和化合物B(“compdB”)单一药剂处理具有抗性。化合物A或化合物B与临床相关浓度的达克替尼或厄洛替尼的组合经由EGFR信号路径的协同抑制而对细胞生存力产生协同效果。因此，进行活体内动物研究以评估化合物A或化合物B与达克替尼或厄洛替尼的组合是否能在RPC9克隆6异种移植模型中产生协同抗肿瘤效果。
方法：
4周至6周龄的SCID米色雌性小鼠自CharlesRiver实验室获得且保存在辉瑞拉霍亚(PfizerLaJolla)动物设施的加压通风的笼具中。所有的研究经辉瑞机构动物护理及使用委员会(PfizerInstitutionalAnimalCareandUseCommittees)批准。通过皮下注射以重组的基底膜(Matrigel,BDBiosciences)经1：1(v/v)悬浮的5×106RPC9克隆6细胞而建立肿瘤。为了肿瘤生长抑制(TGI)研究，选择具有所建立的～300立方毫米的肿瘤的小鼠并将其随机化，接着以作为单一药剂或与达克替尼或厄洛替尼组合的EGFRT790M抑制剂使用指示的剂量及方案处理。肿瘤尺寸以游标卡尺测量及肿瘤体积使用π/6×较大直径×(较小直径)2的公式计算。肿瘤生长抑制百分比(TGI％)以100×(1-△T/△C)计算。肿瘤消退百分比以100×(1-△T/起始肿瘤大小)计算。
化合物A在0.5％Methocel/pH7.4的20mMTris缓冲液中配制成喷雾干燥的分散悬浮液。化合物B以0.5％Methocel当场配制成乳酸盐溶液。达克替尼配制成pH4.5的0.1M乳酸溶液。厄洛替尼配制成40％配制所有药物且它们以10毫升/千克的浓度给药。带有肿瘤的小鼠用指示的治疗经口且每日施用；每日记录体重及健康观察。
结果：
研究I：化合物A与达克替尼的组合
在此研究中，将带有RPC9克隆6肿瘤的小鼠随机化且以单一药剂化合物A或达克替尼，或化合物A与达克替尼的组合治疗。5毫克/千克的达克替尼在小鼠血浆中得到4nM的平均未结合药物浓度，其符合来自45毫克/千克/天的临床剂量的平均临床暴露量。体重变化百分比绘制于图13B中，且表明此研究的所有剂量组具有良好的耐受性，具有少于10％的体重损失。化合物A以500毫克/千克、200毫克/千克和50毫克/千克作为单一药剂或与5毫克/千克的达克替尼组合给药，如图13A所示。在研究的第39天，当介质组的肿瘤大小达到平均1200立方毫米时，达克替尼的单一药剂治疗产生肿瘤生长停滞，化合物A的单一药剂治疗产生剂量依赖性肿瘤生长抑制，如图13A和表4中所例证。所有剂量范围的化合物A与达克替尼的组合产生完全的肿瘤消退，如表4中所例证。
为了进一步评价对肿瘤消退的组合效果，使200毫克/千克和50毫克/千克的化合物A的单一治疗组及组合治疗组中的小鼠继续接受治疗，直到研究的第61天为止。计算肿瘤生长抑制和肿瘤消退且例证于表4中。结果表明(1)化合物A与达克替尼以二者的剂量范围的组合产生了完全的肿瘤消退，(2)在200毫克/千克和50毫克/千克的化合物A的单一药剂治疗组中的肿瘤以剂量依赖性方式进展，其模拟可能由EGFRdelE746-A750等位基因驱动的体外抗性，以及(3)在达克替尼的单一药剂治疗组中的肿瘤亦有进展，其模拟在此RPC9克隆6异种移植模型中可能由EGFRdelE746-A750和T790M等位基因驱动的体外抗性。
使治疗期进一步延伸以评价单一药剂治疗及组合治疗的活体内抗性。使达克替尼的单一药剂治疗组继续进行且在肿瘤大小到达1200立方毫米以上时的第74天终止。类似地，使200毫克/千克的化合物A的单一药剂治疗组继续进行且在肿瘤大小到达1400立方毫米以上时的第95天终止。因此，在达克替尼或化合物A单一药剂治疗组中的肿瘤继续进展且证明活体内抗性与体外特征相似。达克替尼与50毫克/千克组的化合物A的组合能够达到100％的TGI，而且达克替尼与200毫克/千克的化合物A的组合维持肿瘤消退，直到在第120天的研究结束为止，如图13A和表4中所示。
表4：研究I中的肿瘤生长抑制和消退
*：该研究组在第39天终止，因为组合组没有可检测的肿瘤，动物用于安全性终点。
a：该研究组在第53天终止，平均肿瘤体积大于1200mm3。
b：该研究组在第74天终止，平均肿瘤体积大于1200mm3。
c：该研究组在第95天终止，平均肿瘤体积大于1400mm3。
研究II：化合物B与达克替尼的组合
在此研究中，将带有RPC9克隆6肿瘤的小鼠随机化且以单一药剂化合物B或达克替尼，或化合物B与达克替尼的组合治疗。达克替尼以5毫克/千克和1.5毫克/千克给药。化合物B以50毫克/千克、15毫克/千克和5毫克/千克给药，如图14A中所示。体重变化百分比绘制于图14B中，且表明此研究的所有剂量组有良好的耐受性，具有少于10％的体重损失。在研究的第36天，当介质组的肿瘤大小达到平均1000立方毫米时，达克替尼单一药剂治疗产生剂量依赖性肿瘤生长抑制，如图15A中所例证。以5毫克/千克和15毫克/千克化合物B的单一药剂治疗由于极低的剂量而没有显著的有效性，而以50毫克/千克的化合物B单一药剂治疗得到47％的TGI，如图15A中所示。化合物B与达克替尼的组合产生剂量依赖性肿瘤消退，如图15B中所示。计算肿瘤生长抑制及消退且例证于表5中。
表5：研究II中的肿瘤生长抑制和消退
研究III：化合物A与厄洛替尼的组合
在此研究中，将带有RPC9克隆6肿瘤的小鼠随机化且以单一药剂化合物A或厄洛替尼，或化合物A与厄洛替尼的组合治疗。25毫克/千克的厄洛替尼在小鼠血浆中得到300nM的平均未结合药物浓度，其符合平均临床暴露量。体重变化百分比绘制于图16B中，且表明此研究的所有剂量组有良好的耐受性，具有少于10％的体重损失。化合物A以400毫克/千克、200毫克/千克和50毫克/千克作为单一药剂或与25毫克/千克的厄洛替尼组合给药，如图16A中所示。在研究的第45天，当介质组的肿瘤大小达到1500立方毫米以上时，厄洛替尼单一药剂治疗产生51％的肿瘤生长抑制，且化合物A单一药剂治疗产生剂量依赖性肿瘤生长抑制，如图16A和表6中所例证。所有剂量范围的化合物A与厄洛替尼的组合产生肿瘤消退，如表6中所例证。
为了进一步评价对肿瘤消退的组合效果，使200毫克/千克和50毫克/千克的化合物A的单一治疗及组合治疗组中的小鼠继续接受治疗，直到研究的第73天为止。计算肿瘤生长抑制和肿瘤消退且例证于表6中。类似于与达克替尼组合的研究I的结果，来自此研究的结果亦表明化合物A与厄洛替尼的组合以二者的剂量范围产生肿瘤消退，而化合物A或厄洛替尼的单一药剂治疗组中的肿瘤继续进展，这表明以del或del/T790M等位基因驱动活体内抗性。
因此，结论为化合物A与达克替尼或厄洛替尼的组合获得了协同抗肿瘤活性，以诱发抗性RPC9克隆6异种移植模型中的肿瘤消退。
表6：研究III中的肿瘤生长抑制和消退
*：这些组在第45天终止，因为组合组没有可检测的肿瘤，动物用于安全性终点。
a：该组在第52天终止，平均肿瘤体积大于1500mm3。
b：该组在第55天终止，平均肿瘤体积大于1500mm3。
结论：
当以化合物A、化合物B、达克替尼或厄洛替尼作为单一药剂疗法治疗时，带有EGFRdelE746-A750和EGFRdelE746-A750/T790M等位基因二者的RPC9克隆6异种移植模型显示出肿瘤进展。当以高剂量的化合物A与临床相关剂量的达克替尼或厄洛替尼作为组合疗法治疗时，该模型显示完全消退，以及当以低剂量的化合物B与达克替尼组合治疗时，该模型证明剂量依赖性肿瘤消退。因此，目前的临床前动物研究成功地证明，EGFRT790M选择性抑制剂与达克替尼或厄洛替尼的组合策略是一种以机制为基础以及潜在地临床上可转译的策略，以开发具有原发性及获得性EGFR突变二者的NSCLC患者中的EGFRT790M临床候选物。

Claims (27)

1.一种治疗非小细胞肺癌的方法，其包括对有此需要的患者给予与有效量的EGFR抑制剂组合的有效量的不可逆EGFRT790M抑制剂。
2.根据权利要求1的方法，其中所述不可逆EGFRT790M抑制剂为1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮或其药学上可接受的盐。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、凡德他尼、拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼、卡纳替尼、西妥昔单抗和帕尼单抗，或它们的药学上可接受的盐。
4.根据权利要求1或2的方法，其中所述EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼和达克替尼，或它们的药学上可接受的盐。
5.根据权利要求1或2的方法，其中所述EGFR抑制剂为厄洛替尼或其药学上可接受的盐。
6.根据权利要求1或2的方法，其中所述EGFR抑制剂为达克替尼或其药学上可接受的盐。
7.一种治疗非小细胞肺癌的方法，其包括对有此需要的患者给予与panHER抑制剂组合的有效量的EGFRT790M抑制剂，其中所述panHER抑制剂系根据非标准临床给药方案给予。
8.根据权利要求7的方法，其中所述非标准临床给药方案为非标准临床剂量或非标准给药时程。
9.根据权利要求7的方法，其中所述非标准临床给药方案为低剂量的panHER抑制剂。
10.根据权利要求7的方法，其中所述非标准临床给药方案为间歇性给药方案。
11.根据权利要求7～10中任一项的方法，其中所述EGFRT790M抑制剂选自由下列物质组成的组：Go6976、PKC412、AP26113、HM61713、WZ4002、CO-1686和TAS-2913，或它们的药学上可接受的盐。
12.根据权利要求7～10中任一项的方法，其中所述EGFRT790M抑制剂为1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮或其药学上可接受的盐。
13.根据权利要求7～10中任一项的方法，其中所述panHER抑制剂选自由下列物质组成的组：拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼和卡纳替尼，或它们的药学上可接受的盐。
14.根据权利要求7～10中任一项的方法，其中所述panHER抑制剂为阿法替尼或其药学上可接受的盐。
15.根据权利要求7～10中任一项的方法，其中所述panHER抑制剂为达克替尼或其药学上可接受的盐。
16.一种治疗非小细胞肺癌的方法，其包括对有此需要的患者给予与EGFR抑制剂组合的协同作用量的EGFRT790M抑制剂。
17.根据权利要求16的方法，其中所述EGFRT790M抑制剂选自由下列物质组成的组：Go6976、PKC412、AP26113、HM61713、WZ4002、CO-1686和TAS-2913，或它们的药学上可接受的盐。
18.根据权利要求16的方法，其中所述EGFRT790M抑制剂为1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮或其药学上可接受的盐。
19.根据权利要求16～18中任一项的方法，其中所述EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、凡德他尼、拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼、卡纳替尼、西妥昔单抗和帕尼单抗，或它们的药学上可接受的盐。
20.根据权利要求16～18中任一项的方法，其中所述EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼和达克替尼，或它们的药学上可接受的盐。
21.根据权利要求16～18中任一项的方法，其中所述EGFR抑制剂为厄洛替尼或其药学上可接受的盐。
22.(a)EGFRT790M抑制剂及(b)EGFR抑制剂的协同组合，其中组分(a)及组分(b)具有协同作用。
23.根据权利要求22的组合，其中所述EGFRT790M抑制剂选自由下列物质组成的组：Go6976、PKC412、AP26113、HM61713、WZ4002、CO-1686和TAS-2913，或它们的药学上可接受的盐。
24.根据权利要求22的组合，其中所述EGFRT790M抑制剂为1-{(3R,4R)-3-[({5-氯-2-[(1-甲基-1H-吡唑-4-基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基}氧基)甲基]-4-甲氧基吡咯烷-1-基}丙-2-烯-1-酮或其药学上可接受的盐。
25.根据权利要求22～24中任一项的组合，其中所述EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、凡德他尼、拉帕替尼、来那替尼、阿法替尼、培利替尼、达克替尼、卡纳替尼、西妥昔单抗和帕尼单抗，或它们的药学上可接受的盐。
26.根据权利要求22～24中任一项的组合，其中所述EGFR抑制剂选自由下列物质组成的组：吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼和达克替尼，或它们的药学上可接受的盐。
27.根据权利要求22～24中任一项的组合，其中所述EGFR抑制剂为厄洛替尼或其药学上可接受的盐。
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