CN105051060A - 用于增强蛋白质表达的融合肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及重组蛋白质生产领域。提供了源自血型糖蛋白的细胞外区的新的肽，当所关注的蛋白质或肽与所述新的肽一起作为融合蛋白质表达时，所述新的肽增强所关注的蛋白质或肽的表达速率。

Description

用于增强蛋白质表达的融合肽
发明领域
本发明涉及新的肽，其能够被用于增强所关注的蛋白质的产量。所述肽源自血型糖蛋白的细胞外结构域，并被用作与所关注的蛋白质融合的蛋白质的一部分。本发明特别提供表达盒，其包含这样的肽作为开放阅读框的一部分。
发明背景
重组蛋白质的生产是当今生物技术产业的一个主要方面。由于在市场上增加了许多需要大量优质蛋白质的应用，这正变得越来越重要。食品生产和特别是药学是对重组蛋白质的需求稳定增加的两个主要领域。获得商业上可行的工艺需要最终产品更高的生产效率和因此更低的成本。
但同时，高产品质量和与人应用的相容性是必不可少的。越来越多的应用需要在真核细胞(特别是高等真核细胞)中重组生产蛋白质。当将它们表达于原核细胞系统(如大肠杆菌)或真核细胞系统(如特别是人细胞系)时，特别是携带翻译后修饰的蛋白质(如糖基化(糖蛋白))显著不同。在许多情况下，这些不同显著影响所产生的蛋白质的生物活性以及免疫原性。但是，使用高等真核细胞系的许多表达系统受所期望的蛋白质的相当低的表达速率的影响，导致重组蛋白质的低产量和高成本。
因此，现有技术中存在提供(特别是使用真核表达细胞系时)用于增加重组蛋白质生产的产量的新手段和方法的需要。
发明概述
本发明人能够证实，当不同蛋白作为与血型糖蛋白的细胞外区或其部分融合的融合蛋白质表达时，它们的产量和生产速率得到显著增加。与使用相同的表达载体在相同的条件下单独表达所关注的蛋白质相比，所述融合蛋白质的表达速率提高了高达10倍。对于所关注的蛋白质的后续应用，可以作为融合蛋白质使用它或可以使用构建于两个融合伙伴之间的蛋白酶识别位点将所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分从所关注的蛋白质裂解掉。
鉴于上述情况，本发明在第一个方面提供表达盒，其包含启动子区、表达元件和任选地转录终止子区，其中所述表达元件包含编码血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列，并且其中所述表达盒不包含编码整个血型糖蛋白的核酸序列。特别地，所述表达盒的所述表达元件还包含编码所关注的肽的核酸序列，其中，当表达所述表达元件时，所述所关注的肽和所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分形成融合肽。
在更多的方面，本发明提供包含根据第一个方面的表达盒的载体和包含所述表达盒或所述载体的宿主细胞。
在另一个方面，本发明提供用于生产所关注的肽的方法，其包括以下步骤
(a)提供包含根据第一个方面的包括编码所述所关注的肽的核酸序列的表达盒的宿主细胞；
(b)在所述宿主细胞表达包含所述所关注的肽和所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的融合肽的条件下培养所述宿主细胞；
(c)获得所述所关注的肽，任选地以所述融合肽的形式。
此外，本发明提供包含血型糖蛋白的细胞外区或其部分和所关注的肽的融合肽，其可通过根据本发明的用于生产所关注的肽的方法获得。
在另一个方面，本发明提供用于增加所关注的肽在重组生产中的产量的方法，其包括作为融合肽的部分表达所述所关注的肽的步骤，所述融合肽还包含血型糖蛋白的细胞外区或其部分。此外，本发明也提供血型糖蛋白的细胞外区或其部分与所关注的肽一起以融合肽的形式用于增加所述所关注的肽在重组生产中的产量的用途。
上述方面可以进行组合。从以下描述和所附的权利要求书，对于本领域技术人员来说，本发明的其它目的、特征、优点和方面将变得明显。但是，应当理解的是，以下描述、所附的权利要求书和具体的实施例(其表示本发明的优选实施方案)仅以说明的方式给出。在阅读以下内容之后，对于本领域技术人员来说，所公开的发明的精神和范围内的各种变化和修改将容易变得明显。
定义
除了在使用它们的上下文中另有说明之外，以下表述通常旨在优选具有如下所述的意义。
如本文中所使用的表述“包含”除了其字面意义也包括并具体指表述“基本上由……组成”和“由……组成”。因此，表述“包含”是指其中“包含”具体列出的要素的主题不包含更多的要素的实施方案以及“包含”具体列出的要素的主题可以和/或实际上包括更多的要素的实施方案。同样，表述“具有”应当被理解为表述“包含”，也包括并具体指表述“基本上由……组成”和“由……组成”。
“表达盒”是用能够在与这些序列相容的宿主中实现结构基因表达的核酸元件产生或合成的核酸构建体。表达盒包括至少启动子和任选地转录终止子信号。典型地，所述表达盒包括待转录的核酸和启动子。也可以如本文所述使用有助于实现表达的另外的因子。例如，表达盒也可以包括编码指导表达的蛋白质从所述宿主细胞分泌的信号序列的核苷酸序列。表达盒优选为表达载体的一部分。将应当被用于表达待转录的核酸的宿主细胞用所述表达载体进行转化或转染。为了允许选择包含所述构建体的转化细胞，可以将可选择标记物基因便利地包含于所述表达载体中。本领域技术人员将会认识到可以在基本上不影响其功能的情况下修饰该载体组分。
表述“功能上彼此连接”是指表达盒的所述元件以这样的方式彼此连接：它们的功能是协调的并允许编码序列(例如所述表达元件)的表达。举例来说，当启动子能够确保编码序列的表达时，它是功能上连接至所述编码序列的。可以使用本领域技术人员众所周知的技术进行根据本发明的表达盒的构建和其各种元件的装配，特别是在Sambrook等(1989,MolecularCloning:ALaboratoryManual,NolanC.ed.,NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress)中所描述的那些技术。
靶核酸序列或氨基酸序列的“同源物”与所述靶核酸序列或氨基酸序列享有至少75％、更优选至少80％、至少85％、至少90％、至少93％、至少95％或至少97％的同源性或同一性。氨基酸序列或核苷酸序列的“同源性”或“同一性”优选在所述靶序列的整个长度上或在所述靶序列的指定部分的整个长度上根据本发明进行确定。
如本文中所使用的“肽”是指包含至少5个氨基酸的多肽链。肽优选包含至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个或至少35个氨基酸。如本文中所使用的术语“肽”也指蛋白质，包括翻译后被修饰过的肽和蛋白质。特别地，术语肽包括糖基化肽和糖蛋白。
肽或蛋白质的一部分优选包含所述肽或蛋白质的至少3个连续氨基酸，优选所述蛋白质的至少5个、至少10个、至少15个或至少20个连续氨基酸。
术语“药物组合物”和类似的术语特别是指适于施用于人的组合物，即含有药学可接受的组分的组合物。优选地，药物组合物包含活性化合物或其盐或前药以及载体、稀释剂或药物赋形剂(如缓冲剂、防腐剂和张力调节剂)。
发明详述
本发明涉及表达盒，其包含启动子区、表达元件和任选地转录终止子区，其中所述表达元件包含编码血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列。所述表达盒被设计用于在宿主细胞中表达所关注的肽。编码所述所关注的肽的核酸序列可以已经存在于根据本发明的表达盒的表达元件中或可以被克隆进入所述表达元件。所述所关注的肽和所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分在表达元件中功能上彼此连接，使得它们被表达为融合肽。
但是，所述所关注的肽不是所述血型糖蛋白的剩余部分并且所述表达盒不包含编码整个血型糖蛋白的核酸序列。特别地，所述表达盒不包含编码所述糖蛋白的跨膜区和/或细胞质区的核酸序列。
血型糖蛋白的细胞外区或其部分
所述血型糖蛋白可以是血型糖蛋白家族的任何成员。优选地，所述血型糖蛋白是哺乳动物或啮齿动物血型糖蛋白，更优选人血型糖蛋白。所述血型糖蛋白特别选自由血型糖蛋白A、血型糖蛋白B、血型糖蛋白C和血型糖蛋白E组成的组，并优选为血型糖蛋白A。在特别优选的实施方案中，所述血型糖蛋白是具有SEQIDNO:1的氨基酸序列的人血型糖蛋白A。人血型糖蛋白A也被称为MN唾液酸糖蛋白、PAS-2、唾液酸糖蛋白α和CD235a。
血型糖蛋白由N-末端细胞外区、跨膜区和C-末端细胞质区组成。此外，所述血型糖蛋白表达有N-末端定位信号肽，其在表达之后被切除，从而形成成熟血型糖蛋白。除非另外指明，否则如本文中所使用的术语“血型糖蛋白”是指不包含定位信号肽的成熟血型糖蛋白。成熟血型糖蛋白不包含所述定位信号肽。该定位信号肽不形成所述血型糖蛋白的细胞外区的一部分。因此，血型糖蛋白的细胞外区开始于成熟血型糖蛋白的N-末端并终止于直接位于跨膜区N-末端的氨基酸。任何蛋白质的跨膜区，特别是任何血型糖蛋白的跨膜区能够被本领域技术人员例如使用合适的序列分析工具容易地鉴定。对于已知血型糖蛋白，所述跨膜结构域也被示于通常可获得的蛋白质数据库中(参见例如UniProtconsortium的UniProtKB蛋白质数据库，www.uniprot.org)。例如，人血型糖蛋白A的跨膜结构域由SEQIDNO:1的氨基酸73至95组成。因此，人血型糖蛋白A的细胞外区由SEQIDNO:1的氨基酸1至72组成。
如本文中所使用的血型糖蛋白的细胞外区的部分是指包含如本文中所定义的血型糖蛋白的细胞外区的至少10个连续氨基酸的肽。优选地，所述细胞外区的部分包含血型糖蛋白的细胞外区的至少15个、更优选至少20个、至少25个、至少30个或至少35个连续氨基酸。在优选的实施方案中，所述细胞外区的部分包括位于所述细胞外区的N-末端区的氨基酸。特别地，所述细胞外区的部分包含所述细胞外区的头40个氨基酸的至少10个、优选至少15个、更优选至少20个、至少25个、至少30个或至少35个连续氨基酸。在人血型糖蛋白A的情况下，这意味着所述人血型糖蛋白A的细胞外区的部分包含SEQIDNO:1的位置1至40的氨基酸序列的至少10个、优选至少15个、更优选至少20个、至少25个、至少30个或至少35个连续氨基酸。
在某些实施方案中，术语“血型糖蛋白的细胞外区”也包括其同源物。所述同源物与所述血型糖蛋白的细胞外区具有至少70％的氨基酸序列同一性。优选地，所述序列同一性为至少75％、更优选至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。在所述血型糖蛋白的整个细胞外区上确定所述序列同一性。在具体的实施方案中，那么所述血型糖蛋白的细胞外区也包括人血型糖蛋白A的细胞外区的同源物，其中所述同源物与SEQIDNO:1的位置1至72的氨基酸序列具有至少70％、优选至少75％、更优选至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。同样，在某些实施方案中的血型糖蛋白的细胞外区的部分也指血型糖蛋白的细胞外区的同源物的部分。在优选的实施方案中，在如上所述的同源物和细胞外区之间的序列同一性也适用于所述细胞外区的部分。因此，细胞外区的同源物的部分与所述血型糖蛋白的细胞外区的相应部分具有至少70％、优选至少75％、更优选至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的氨基酸序列同一性。
在特别优选的实施方案中，所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分包含并特别是由SEQIDNO:1的氨基酸1至38或SEQIDNO:1的氨基酸2至38组成。
如果将所关注的肽与所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分一起作为融合肽表达，特别是在本文所述的宿主细胞中表达，所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分优选能够增加所述所关注的肽的生产速率和产量。
表达元件
根据本发明的表达盒的表达元件包含待通过所述表达盒进行表达的核酸序列。所述表达元件的核酸序列的表达通过启动子区进行调控。当所述表达盒(任选地存在于载体中)被引入合适的宿主细胞时，所述宿主细胞产生由所述表达元件的核酸序列所编码的肽。
根据本发明的表达盒的表达元件优选含有克隆位点或编码所关注的肽的核酸序列。所述克隆位点或所述编码所关注的肽的核酸序列在转录方向上可以位于编码所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列之前或之后。编码所述所关注的肽的核酸序列在表达元件中以与编码所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列保持相同的阅读框(inframe)的形式存在。编码所述所关注的蛋白质的核酸序列的三-核苷酸阅读框与编码所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列的三-核苷酸阅读框相同。在翻译这些核酸序列的过程中，产生一条包含所述所关注的肽和所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的多肽链。当表达所述表达元件时，所述所关注的肽和血型糖蛋白的细胞外区或其部分形成融合肽。在所述融合肽中，所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分可以位于所述所关注的肽的N-末端或C-末端。
所关注的肽可以是任何肽，包括蛋白质。所述肽可以是任何起源，包括哺乳动物-和人-来源的肽以及人工肽。优选地，所述肽包含一个或多个糖基化位点并且特别是糖基化肽(如糖蛋白)。
在所述表达元件中存在的克隆位点适于将编码所关注的肽的核酸引入所述表达元件。所述克隆位点被特别设计为能够以这样的方式引入编码所关注的肽的核酸：编码所述所关注的肽的核酸序列和编码所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列保持如上所述相同的阅读框。用于将核酸片段引入其它核酸分子(如表达盒或载体)的合适的克隆位点和方法是本领域公知的。所述克隆位点优选包含至少一个、优选至少两个、至少三个、至少四个或至少五个限制性酶识别序列。合适的限制性酶和它们的识别序列是本领域已知的。示例性的限制性酶为EcoRI、EcoRV、HindIII、BamHI、XbaI和PvuI。
在某些实施方案中，所述表达元件还包含编码信号肽的核酸序列，所述信号肽优选包含细胞外定位信号。所述信号肽特别诱导由所述表达元件编码的融合肽的分泌表达。所述信号肽优选在表达过程中被从剩余的融合肽裂解掉。所述信号肽优选在转录方向上位于包含于所述表达元件中的其它编码核酸序列之前，特别是在所述表达元件的开始处。此外，编码所述信号肽的核酸序列优选与包含于所述表达元件中的其它编码核酸序列位于相同的阅读框内。
在更多的实施方案中，所述表达元件还包含编码蛋白酶识别位点的核酸序列。所述编码蛋白酶识别位点的核酸序列优选位于
(i)编码所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列
和
(ii)所述克隆位点或编码所关注的肽的核酸序列
之间。
编码所述蛋白酶识别位点的核酸序列与编码所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列和任选地也与编码所述所关注的肽的核酸序列位于相同的阅读框内，如上所述。当表达所述表达元件时，所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分、所述蛋白酶识别位点和任选地所述所关注的肽形成融合肽。当将这样的融合肽与相应蛋白酶接触时，所述蛋白酶在所述识别位点裂解所述融合肽，形成包含所述所关注的肽的融合肽一部分和包含所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的融合肽另一部分。合适的蛋白酶和它们的识别位点是本领域已知的。优选地，所述蛋白酶为内肽酶。示例性的蛋白酶是凝血酶和因子Xa。
包含于所述表达元件中的核酸序列优选在转录方向上以下面的顺序功能上彼此连接：
(i)任选地编码信号肽的核酸序列；
(ii)所述克隆位点或编码所关注的肽的核酸序列；
(iii)任选地编码蛋白酶识别位点的核酸序列；
(iv)编码所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列。
备选地，包含于所述表达元件中的核酸序列优选在转录方向上以下面的顺序功能上彼此连接：
(i)任选地编码信号肽的核酸序列；
(ii)编码所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列；
(iii)任选地编码蛋白酶识别位点的核酸序列；
(iv)所述克隆位点或编码所关注的肽的核酸序列。
当表达所述表达元件时，如果所述元件(i)至(iv)存在的话，它们优选形成融合肽。
所述表达元件的元件，特别是编码所述信号肽的核酸序列，编码所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列，编码所述蛋白酶识别位点的核酸序列和编码所述所关注的肽的核酸序列都一起形成一个开放阅读框。那特别意味着这些元件彼此都在相同的编码框内，并且在所述编码框中所述元件之间没有终止密码子。优选地，所述表达元件的第一个密码子是编码甲硫氨酸的起始密码子并且所述表达元件的最后一个密码子是终止密码子。
在特别优选的实施方案中，所述表达元件包含编码所关注的肽的核酸序列。
表达盒的进一步元件
除了所述表达元件以外，根据本发明的表达盒至少还包含能够引发所述表达元件的转录的启动子区。所述启动子区包括RNA聚合酶结合位点、转录起始位点和转录因子结合位点。所述启动子任选地还可以包含调控所述表达元件的转录的调控元件。优选地，所述启动子选自由SV40启动子、CMV启动子、EF-1α启动子、RSV启动子、BROAD3启动子、鼠rosa26启动子、pCEFL启动子和β-肌动蛋白启动子组成的组。
此外，根据本发明的表达盒优选包含转录终止子区，其为标记基因转录的结束的一段基因序列。所述转录终止子区特别终止所述RNA聚合酶并导致它从DNA链解离。
在优选的实施方案中，根据本发明的表达盒还包含选自由5'增强子区、5'非翻译区、多聚腺苷酸化信号、3'非翻译区和3'增强子区组成的组的一个或多个元件。特别地，根据本发明的表达盒在转录方向上包含功能上彼此连接的：
(i)任选地5'增强子区，
(ii)启动子区
(iii)任选地5'非翻译区，
(iv)表达元件
(v)任选地3'非翻译区，
(vi)任选地多聚腺苷酸化位点，
(vii)任选地转录终止子区，以及
(viii)任选地3'增强子区。
所述增强子区为能够增强所述表达元件的转录水平的DNA短区域。所述增强子区可被激活子蛋白(反式作用因子)结合，其募集RNA聚合酶和通用转录因子，其然后引发转录基因。增强子区可以位于启动子-表达元件复合体的上游(5'增强子区)或下游(3'增强子区)。
所述5'非翻译区(5'UTR)位于所述启动子区和所述表达元件之间，并优选含有经由调控元件用于控制基因表达的元件。例如，所述5'UTR可以包含促进或抑制翻译起始的序列和针对可以影响mRNA的稳定性或翻译的蛋白质的结合位点。
所述3'非翻译区(3'UTR)位于所述表达元件和所述多聚腺苷酸化位点之间，并可以含有针对可以影响细胞中mRNA的稳定性或定位的蛋白质的结合位点。5'UTR和3'UTR均与所述表达元件一起被转录并形成所产生的mRNA的一部分。
所述多聚腺苷酸化位点是引发在所转录的RNA合成多聚(A)尾的序列动因。所述多聚腺苷酸化位点可以位于3'UTR的末端或其内部。
所述表达盒优选适于在真核细胞、优选哺乳动物细胞、更优选人细胞中的表达。
包含表达盒的载体
在一个方面，本发明涉及包含根据本发明的表达盒的载体。所述载体可以是适于将所述表达盒转移进入宿主细胞的任何载体。相应的载体是本领域已知的。特别地，所述载体适于转移进入真核细胞、优选哺乳动物细胞、更优选人细胞。
除了所述表达元件以外，根据本发明的载体可以包含更多的元件。例如，所述载体可以包含一个或多个选择标记物。优选地，所述选择标记物中的至少一个适于针对不包含所述载体的宿主细胞选择包含该载体的宿主细胞、特别是真核宿主细胞、优选哺乳动物宿主细胞、更优选人宿主细胞。所述选择标记物的合适的例子是提供针对抗生素化合物的抗性的基因。此外，所述载体可以包含适于将其在原核宿主细胞(如大肠杆菌细胞)中扩增的元件。例如，这样的元件包括复制起点(如ColE1Ori)和原核选择标记物(如提供针对杀细菌剂(例如氨苄青霉素)的抗性的基因)。
优选地，所述载体是环状或线性双链DNA，特别是环状双链DNA。
在某些优选实施方案中，所述载体包含具有表达元件的表达盒，所述表达元件包含编码所关注的肽的核酸序列。
包含表达盒或载体的宿主细胞
在又一个方面，本发明提供包含根据本发明的表达盒或根据本发明的载体的宿主细胞。所述宿主细胞可以是适于用所述表达盒或载体转染并且特别是适于生产所述所关注的肽的任何细胞。优选地，所述宿主细胞源自建立的表达细胞系。所述宿主细胞优选真核细胞、更优选哺乳动物细胞、最优选人细胞。在优选的实施方案中，所述宿主细胞源自人髓样白血病细胞。宿主细胞的具体例子为K562、NM-F9、NM-D4、NM-H9D8、NM-H9D8-E6、NMH9D8-E6Q12、GT-2X、GT-5s和源自任意一种所述宿主细胞的细胞。K562是存在于美国典型培养物保藏中心中的人髓样白血病细胞(ATCCCCL-243)。剩余的细胞系源自K562细胞并已经针对具体的糖基化特征进行过选择。源自K562的细胞系可以在适合K562的众所周知的条件下进行培养和维持。除K562细胞外的所有这些细胞系均根据布达佩斯条约进行保藏。可在本说明书的结尾处发现关于所述保藏的信息。
例如，示例性的宿主细胞也被描述于WO2008/028686中。在优选的实施方案中，所述宿主细胞被优化用于表达具有特定糖基化模式的糖蛋白。优选地，所述表达元件中的密码子使用和/或所述表达盒或载体的启动子和其它元件与所使用的宿主类型相容，更优选地针对所使用的宿主类型进行优化。
在某些实施方案中，所述宿主细胞是分离的宿主细胞。优选地，所述宿主细胞不存在于人或动物身体中。
在某些优选的实施方案中，所述宿主细胞被用包含表达盒的载体进行转染，所述表达盒具有包含编码所关注的肽的核酸序列的表达元件。
生产方法
本发明提供用于生产所关注的肽的方法，其包括以下步骤
(a)提供根据本发明的宿主细胞；
(b)在所述宿主细胞表达包含所述所关注的肽和所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的融合肽的条件下培养所述宿主细胞；
(c)获得所述所关注的肽，任选地以所述融合肽的形式。
在该方法中所使用的宿主细胞特别地被根据本发明的载体或表达盒所转染，其中其表达元件包含编码所述所关注的肽的核酸序列。适合用于培养所述宿主细胞和表达所述融合蛋白质的条件取决于在该方法中所使用的具体的宿主细胞、载体和表达盒。本领域技术人员可以容易地确定合适的条件，并且对于众多宿主细胞而言这样的条件也已经是已知的。在优选的实施方案中，所述融合肽由所述宿主细胞分泌进入培养基。在这些实施方案中，所述表达元件优选包含编码包含细胞外定位信号的信号肽的核酸序列。
用于生产所关注的肽的方法优选还包括以下步骤
(d)分离所述所关注的肽，任选地以所述融合肽的形式。
步骤(d)优选在步骤(b)和步骤(c)之间进行。
所关注的肽的分离特别指将所述所关注的肽与细胞培养物的剩余组分分离开。例如，在所述所关注的肽由所述宿主细胞分泌的情况下，所述所关注的肽的分离包括将细胞培养基与宿主细胞分开(例如通过离心)和将所述所关注的肽与所述培养基的一些或大部分组分分离(例如通过色谱法)。适用于分离所述所关注的肽的方法和手段是本领域已知的，并可以容易地由本领域技术人员进行应用。
在优选的实施方案中，在根据本发明的方法中所使用的宿主细胞被用根据本发明的载体或表达盒转染，其中其表达元件包含编码所述所关注的肽的核酸序列和编码蛋白酶识别位点的核酸序列，所述蛋白酶识别位点位于编码所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列和编码所述所关注的肽的核酸序列之间。在这些实施方案中，所述方法优选还包括以下步骤
(e)用能够识别所述蛋白酶识别位点的蛋白酶处理所述融合肽，其中所述融合肽被裂解为作为所述所关注的肽的第一部分和包含所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的第二部分；以及
(f)将所述所关注的肽与所述融合肽的第二部分分离。
步骤(e)和(f)优选在步骤(b)和步骤(c)之间进行，更优选在步骤(d)和步骤(c)之间进行。在这些实施方案中优选作为单个肽而不作为融合肽获得所述所关注的肽。
合适的蛋白酶被描述于本文的上文中。适于蛋白酶消化的条件取决于所使用的具体的蛋白酶并且所述条件是本领域已知的。可以通过已知方法将所述所关注的肽与所述融合肽的第二部分分离，例如通过色谱法或体积排阻过滤。
在更多的实施方案中，用于生产所关注的肽的方法优选还包括以下步骤
(g)将所述所关注的肽、任选地为所述融合肽的形式配制为药物组合物。
步骤(g)优选在步骤(c)之后进行，特别是作为该方法的最后的步骤。
将所述所关注的肽配制为药物组合物优选包括交换包含所述所关注的肽的组合物的缓冲溶液或缓冲溶液组分。此外，配制步骤可以包括所述所关注的肽的冻干。特别地，将所述所关注的肽转入仅包含药学可接受的成分的组合物。
本发明还提供包含血型糖蛋白的细胞外区或其部分和所关注的肽的融合肽，其可通过根据本发明的方法获得。此外，本发明提供包含融合肽的药物组合物，所述融合肽包含血型糖蛋白的细胞外区或其部分和所关注的肽，其可通过根据本发明的方法获得。
产量的提高
在又一个方面，本发明提供用于增加所关注的肽在重组生产中的产量的方法，其包括作为融合肽的部分表达所述所关注的肽的步骤，所述融合肽还包含血型糖蛋白的细胞外区或其部分。对于所述所关注的肽作为这样的融合肽的表达，优选使用根据本发明的表达盒、载体、宿主细胞和/或生产方法。
此外，本发明提供血型糖蛋白的细胞外区或其部分与所关注的肽一起以融合肽的形式用于增加所述所关注的肽在重组生产中的产量的用途。对于所述所关注的肽作为这样的融合肽的重组生产，优选使用根据本发明的表达盒、载体、宿主细胞和/或生产方法。
上述的所有实施方案和特征也同样适用于根据本发明的方法和用途。
本文中所描述的数字范围包括限定该范围的数字。本文所提供的标题并不限制可以由参考本说明书作为一个整体所阅读出的本发明的各个方面或实施方案。根据一个实施方案，本文所述的包含某些步骤的主题(在方法的情况下)或者包含某些成分的主题(在组合物的情况下)是指由相应步骤或成分组成的主题。优选选择和组合本文所述的优选的方面和实施方案，并且由优选的实施方案的各自组合所产生的具体的主题也属于本发明公开的内容。
实施例
实施例1：红细胞生成素单独表达或作为融合蛋白质表达的比较
在该测定中，测试了与血型糖蛋白A细胞外区的一部分融合对模型蛋白质人红细胞生成素(EPO)的表达的作用。将编码EPO的核酸序列克隆入用于真核表达的标准载体，所述载体包含EF-1α启动子和作为选择标记物的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因。存在IgK或GM-CSF的前导序列(细胞外表达信号)用于所述EPO的分泌表达。此外，将编码成熟人血型糖蛋白A的氨基酸1至38的核酸序列(GYPAex.reg.)以相同的阅读框克隆入所述载体，在细胞外表达信号和所述EPO之间或所述EPO之后。在对照载体中，没有插入所述血型糖蛋白构建体，而是仅编码所述细胞外表达信号和所述EPO。在该测定中所使用的构建体如下：
对照1：IgK前导序列-EPO
对照2：GM-CSF前导序列-EPO
ETag1.1：IgK前导序列-EPO-GYPAex.reg.
ETag1.2：IgK前导序列-GYPAex.reg.-EPO
ETag1.3：GM-CSF前导序列-GYPAex.reg.-EPO
将这些不同的载体分别转染进入两个不同的人白血病来源的宿主细胞系。使用甲氨蝶呤对细胞选择阳性转染子，并针对细胞生长和EPO生产力筛选所得到的转染细胞。针对两个不同浓度的甲氨蝶呤选择剂确定这些细胞的皮克EPO/细胞/天(pcd)形式的生产速率。没有进一步分析带有对照2构建体的细胞，因为它们的EPO生产力在最初的筛选中非常低。不同表达细胞的最大生产速率被概括于下表中。
表1
这些数据证实了引入血型糖蛋白A的细胞外区片段显著提高所关注的蛋白质(即EPO)的生产速率。生产速率的这种提高独立于所述血型糖蛋白片段的位置。N-末端和C-末端融合提供了可媲美的高生产速率。甚至当忽视针对两个设置所使用的不同甲氨蝶呤浓度时，使用血型糖蛋白片段融合构建体获得了生产速率的几乎10倍提高。在200mM甲氨蝶呤浓度的组内，即针对带有多拷贝载体的转染细胞具有更高的选择压力，证实有高达20倍至几乎40倍的提高。此外，根据本发明的融合构建体也显示出提高的生产速率独立于所使用的表达细胞系。
实施例2：因子VII单独表达或作为融合蛋白质表达的比较
还分析了血型糖蛋白细胞外区片段对又一个靶蛋白质因子VII的生产的作用。如在实施例1中所述设计构建体并进行测定，只是血型糖蛋白细胞外区标签由成熟人血型糖蛋白A的氨基酸2至38。因子VII的前导序列用作信号肽。血红蛋白标签(HB-标签)被融合至因子VII的N-末端作为又一个对照。使用以下构建体：
对照1：前导序列-因子VII
对照2：前导序列-HB-标签-因子VII
ETag2.1：前导序列-GYPAex.reg.-因子VII
ETag2.2：前导序列-因子VII-GYPAex.reg.
在该测定中获得的平均生产速率被列于下表中：
表2
这些数据再次证实了引入血型糖蛋白A的细胞外区片段显著提高了所关注的不同蛋白质的生产速率。与对照构建体相比，因子VII的平均生产速率被提高了高达65％。同样地，两个构建体中生产速率均有提高，而与所述血型糖蛋白片段的位置无关。N-末端和C-末端融合提供了可媲美的高生产。但是，源自血红蛋白的对照融合标签没有显示出提高的生产，而是导致生产速率大大降低。
应当注意的是，对于因子VII，确定了所有挑取的克隆的平均生产速率，而对于EPO(实施例1)，指示的是各克隆的不同生产速率的范围。因此，上述EPO产量的高得多的增加是指用不同构建体所获得的最大可能的生产速率，而对于因子VII，仅比较了所有克隆的平均生产速率。由于在进一步的生产工艺中是选用具有最高生产力的克隆，因此比较所述最高生产力的克隆更可能反映了产量的实际增加。
保藏的生物材料的标识
细胞系DSMACC2606和DSMACC2605被NemodBiotherapeuticsGmbH&Co.KG,Robert-10,13125Berlin(DE)保藏于DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,MascheroderWeg1b,38124Braunschweig(DE)。Glycotope有权提及这些生物材料，因为这些生物材料被同时从NemodBiotherapeuticsGmbH&Co.KG转让给GlycotopeGmbH。
细胞系DSMACC2806、DSMACC2807、DSMACC2856、DSMACC2858和DSMACC3078被GlycotopeGmbH,Robert--Str.10,13125Berlin(DE)保藏于DSMZ-DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,Inhoffenstraβe7B,38124Braunschweig(DE)。
细胞系的名称 登录号 保藏者 保藏日期
NM-F9 DSM ACC 2606 Nemod Biotherapeutics 2003年8月14日
NM-D4 DSM ACC 2605 Nemod Biotherapeutics 2003年8月14日
NM-H9D8 DSM ACC 2806 Glycotope GmbH 2006年9月15日
NM-H9D8-E6 DSM ACC 2807 Glycotope GmbH 2006年10月5日
NM-H9D8-E6Q12 DSM ACC 2856 Glycotope GmbH 2007年8月8日
GT-2x DSM ACC 2858 Glycotope GmbH 2007年9月7日
GT-5s DSM ACC 3078 Glycotope GmbH 2010年7月28日

Claims (30)

1.表达盒，其包含启动子区、表达元件和任选地转录终止子区，其中所述表达元件包含编码血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列，并且其中所述表达盒不包含编码整个血型糖蛋白的核酸序列。
2.根据权利要求1所述的表达盒，其不包含所述血型糖蛋白的的跨膜区和/或细胞质区的核酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的表达盒，其中所述血型糖蛋白是哺乳动物血型糖蛋白，优选人血型糖蛋白。
4.根据权利要求1至3任一项所述的表达盒，其中所述血型糖蛋白是血型糖蛋白A，优选人血型糖蛋白A。
5.根据权利要求1至4任一项所述的表达盒，其中所述血型糖蛋白的细胞外区具有SEQIDNO:1的位置1至72的氨基酸序列或其同源物。
6.根据权利要求5所述的表达盒，其中所述血型糖蛋白的细胞外区的一部分包含SEQIDNO:1的位置1至40的氨基酸序列的至少20个连续氨基酸或其同源物。
7.根据权利要求1至6任一项所述的表达盒，其中所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分包含并特别是由SEQIDNO:1的氨基酸2至38组成。
8.根据权利要求1至7任一项所述的表达盒，其还包含选自由5'增强子区、5'非翻译区、多聚腺苷酸化信号、3'非翻译区和3'增强子区组成的组的一个或多个元件。
9.根据权利要求8所述的表达盒，其在转录方向上包含功能上彼此连接的：
(i)任选地5'增强子区，
(ii)启动子区
(iii)任选地5'非翻译区，
(iv)表达元件
(v)任选地3'非翻译区，
(vi)任选地多聚腺苷酸化位点，
(vii)任选地转录终止子区，以及
(viii)任选地3'增强子区。
10.根据权利要求1至9任一项所述的表达盒，其中所述表达元件还包含编码信号肽的核酸序列，所述信号肽优选包含细胞外定位信号。
11.根据权利要求1至10任一项所述的表达盒，其中所述表达元件还包含克隆位点。
12.根据权利要求1至11任一项所述的表达盒，其中所述表达元件还包含编码所关注的肽的核酸序列，其中，当表达所述表达元件时，所述所关注的肽和所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分形成融合肽。
13.根据权利要求12所述的表达盒，其中所述所关注的肽为血型糖蛋白或其部分。
14.根据权利要求11至13任一项所述的表达盒，其中所述表达元件还包含编码蛋白酶识别位点的核酸序列，其优选位于
(i)编码所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列
和
(ii)所述克隆位点或编码所关注的肽的核酸序列
之间；
其中，当表达所述表达元件时，所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分、所述蛋白酶识别位点和任选地所述所关注的肽形成融合肽。
15.根据权利要求1至14任一项所述的表达盒，其中包含于所述表达元件中的核酸序列在转录方向上以下面的顺序功能上彼此连接：
(i)任选地编码信号肽的核酸序列；
(ii)所述克隆位点或编码所关注的肽的核酸序列；
(iii)任选地编码蛋白酶识别位点的核酸序列；
(iv)编码所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列；
其中，如果所述元件(i)至(iv)存在的话，当表达所述表达元件时，所述元件(i)至(iv)形成融合肽。
16.根据权利要求1至14任一项所述的表达盒，其中包含于所述表达元件中的核酸序列在转录方向上以下面的顺序功能上彼此连接：
(i)任选地编码信号肽的核酸序列；
(ii)编码所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列；
(iii)任选地编码蛋白酶识别位点的核酸序列；
(iv)所述克隆位点或编码所关注的肽的核酸序列；
其中，如果所述元件(i)至(iv)存在的话，当表达所述表达元件时，所述元件(i)至(iv)形成融合肽。
17.根据权利要求15或16所述的表达盒，其中所述表达元件包含编码所关注的肽的核酸序列。
18.根据权利要求1至17任一项所述的表达盒，其适于在真核细胞、优选哺乳动物细胞、更优选人细胞中的表达。
19.载体，其包含根据权利要求1至18任一项所述的表达盒。
20.载体，其包含根据权利要求17所述的表达盒。
21.宿主细胞，其包含根据权利要求1至18任一项所述的表达盒或根据权利要求19或20所述的载体。
22.宿主细胞，其包含根据权利要求17所述的表达盒或根据权利要求20所述的载体。
23.根据权利要求21或22所述的宿主细胞，其为真核细胞，优选人细胞。
24.用于生产所关注的肽的方法，其包括以下步骤
(a)提供根据权利要求22的宿主细胞；
(b)在所述宿主细胞表达包含所述所关注的肽和所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的融合肽的条件下培养所述宿主细胞；
(c)获得所述所关注的肽，任选地以所述融合肽的形式。
25.根据权利要求24所述的方法，其还包括在步骤(b)和步骤(c)之间的以下步骤
(d)分离所述所关注的肽，任选地以所述融合肽的形式。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中所述表达元件包含编码蛋白酶识别位点的核酸序列，其位于编码所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的核酸序列和编码所述所关注的肽的核酸序列之间；以及
其中所述方法还包括在步骤(b)和步骤(c)之间、优选步骤(d)和步骤(c)之间的以下步骤
(e)用能够识别所述蛋白酶识别位点的蛋白酶处理所述融合肽，其中所述融合肽被裂解为包含所述所关注的肽的第一部分和包含所述血型糖蛋白的细胞外区或其部分的第二部分；以及
(f)将所述所关注的肽与所述融合肽的第二部分分离开。
27.根据权利要求24至26任一项所述的方法，其还包括在步骤(c)之后的步骤
(g)将所述所关注的肽、任选地以所述融合肽的形式配制为药物组合物。
28.包含血型糖蛋白的细胞外区或其部分和所关注的肽的融合肽，其可通过根据权利要求24至27任一项所述的方法获得。
29.用于增加所关注的肽在重组生产中的产量的方法，其包括将所述所关注的肽表达为融合肽的部分的步骤，所述融合肽还包含血型糖蛋白的细胞外区或其部分。
30.血型糖蛋白的细胞外区或其部分与所关注的肽一起以融合肽的形式用于增加所述所关注的肽在重组生产中的产量的用途。
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