CN105039384A - 一种绒山羊的dcn基因过表达载体的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种绒山羊的DCN基因过表达载体的构建方法，该方法包括以下步骤：(1)DCN基因克隆；(2)过表达载体pEGFP-Cl/DCN的构建。该方法在克隆绒山羊DCN基因cDNA序列的基础上，构建过表达载体pEGFP-Cl/DCN，为后续研究绒山羊DCN基因功能奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种绒山羊的DCN基因过表达载体的构建方法。
背景技术
饰胶原蛋白(decorin，DCN)为一种蛋白聚糖(proteoglycan，PG)，是一种多效性分子，因最初发现其结合“修饰”胶原而得名。在调节细胞粘附、迁徙、增殖、胶原纤维形成及调节TGF-β活性中起重要作用。目前，还没有一种绒山羊的DCN基因过表达载体的构建方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的存在的缺陷，提供一种绒山羊的DCN基因过表达载体的构建方法。该方法在克隆绒山羊DCN基因cDNA序列的基础上，构建过表达载体pEGFP-CI/DCN，为后续研究绒山羊DCN基因功能奠定基础。
其具体技术方案为：
一种绒山羊的DCN基因过表达载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)DCN基因克隆
绒山羊皮肤总RNA提取，cDNA第一条链的合成，设计引物DCN-F、DCN-R，以cDNA为模板，使用引物DCN-F、DCN-R和Phusion高保真DNA聚合酶，按常规方法进行PCR扩增；反应条件为：98℃5min；98℃30s、59℃2min、72℃2min，30个循环；72℃10min；PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定；
(2)过表达载体pEGFP-CI/DCN的构建
利用限制性内切酶BamHI和EcoRI对纯化后的目的基因与真核表达载体pEGFP-CI同时进行双酶切，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；回收后的目的基因片段和经同样双酶切的表达载体pEGFP-CI进行连接；反应体系为：T4DNA连接酶1μL、pEGFP-CI纯化产物1μL、PCR产物3μL、dH2O3μL、10×buffer1μL，16℃过夜连接；将连接产物加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，立即移入冰中静置5min，之后加入500μL37℃预温的无抗性LB培养基，37℃摇床培养1h，最后将菌液均匀涂布含有Kanamycin的LB固体培养基上，放入37℃生化培养箱内过夜培养，筛选阳性菌落；随机挑取15株单克隆菌落，用PCR法鉴定阳性克隆菌落；按照天根公司的质粒小提试剂盒说明书提取重组质粒；用PCR法、单双酶切鉴定连接后将菌液送到Invitrogen公司测序；所得到的重组真核表达质粒命名为pEGFP-CI/DCN。
本发明的有益效果是：
本发明通过构建DCN基因的过表达载体pEGFP-CI/DCN。后续开展过表达DCN基因对成纤维细胞、角质化细胞生长发育影响的研究，进而探索该基因在毛囊生长发育中的作用机制。
附图说明
图1为DCN基因的扩增；1.DNAMarker(DL5000)；2.PCR产物；
图2为重组质粒单双酶切鉴定，1.DNAMarker(DL5000)；2.PCR产物t；3.BamHI酶切pEGFP-CI/DCN产物；4.BamHI和EcoRI双酶切pEGFP-CI/DCN产物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1材料与方法
1.1材料：绒山羊皮肤样品采自内蒙古白绒山羊种羊场成年母羊群体。
1.2方法
1.2.1DCN基因克隆
绒山羊皮肤总RNA提取，cDNA第一条链的合成，设计引物(DCN-F、DCN-R)，以cDNA为模板，使用引物DCN-F、DCN-R和Phusion高保真DNA聚合酶，按常规方法进行PCR扩增。反应条件为：98℃5min；98℃30s、59℃2min、72℃2min，30个循环；72℃10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。DCN-F的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，DCN-R的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示.
1.2.2过表达载体pEGFP-CI/DCN的构建
利用限制性内切酶BamHI和EcoRI对纯化后的目的基因与真核表达载体pEGFP-CI同时进行双酶切，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收。回收后的目的基因片段和经同样双酶切的表达载体pEGFP-CI进行连接。反应体系为：T4DNA连接酶1μL、pEGFP-CI纯化产物1μL、PCR产物3μL、dH2O3μL、10×buffer1μL，16℃过夜连接。将连接产物加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，立即移入冰中静置5min，之后加入500μL37℃预温的无抗性LB培养基，37℃摇床培养1h，最后将菌液均匀涂布含有Kanamycin的LB固体培养基上，放入37℃生化培养箱内过夜培养，筛选阳性菌落。随机挑取15株单克隆菌落，用PCR法鉴定阳性克隆菌落。按照天根公司的质粒小提试剂盒说明书提取重组质粒。用PCR法、单双酶切鉴定连接后将菌液送到Invitrogen公司测序。所得到的重组真核表达质粒命名为pEGFP-CI/DCN。
2结果与分析如图1-图2所示。
2.1DCN基因克隆；
2.2过表达载体pEGFP-CI/DCN的构建；
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
Claims (1)
1.一种绒山羊的DCN基因过表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)DCN基因克隆
绒山羊皮肤总RNA提取，cDNA第一条链的合成，设计引物DCN-F、DCN-R，以cDNA为模板，使用引物DCN-F、DCN-R和Phusion高保真DNA聚合酶，按常规方法进行PCR扩增；反应条件为：98℃5min；98℃30s、59℃2min、72℃2min，30个循环；72℃10min；PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定；
(2)过表达载体pEGFP-Cl/DCN的构建
利用限制性内切酶BamHI和EcoRI对纯化后的目的基因与真核表达载体pEGFP-Cl同时进行双酶切，经1.0％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收；回收后的目的基因片段和经同样双酶切的表达载体pEGFP-Cl进行连接；反应体系为：T4DNA连接酶1μL、pEGFP-Cl纯化产物1μL、PCR产物3μL、dH2O3μL、10×buffer1μL，16℃过夜连接；将连接产物加入100μL大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，立即移入冰中静置5min，之后加入500μL37℃预温的无抗性LB培养基，37℃摇床培养1h，最后将菌液均匀涂布含有Kanamycin的LB固体培养基上，放入37℃生化培养箱内过夜培养，筛选阳性菌落；随机挑取15株单克隆菌落，用PCR法鉴定阳性克隆菌落；按照天根公司的质粒小提试剂盒说明书提取重组质粒；用PCR法、单双酶切鉴定连接后将菌液送到Invitrogen公司测序；所得到的重组真核表达质粒命名为pEGFP-Cl/DCN。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN106636149A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-10 | 内蒙古农业大学 | 斯氏副柔线虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Pj_STPK基因克隆、原核表达方法及应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1804041A (zh) * | 2005-12-22 | 2006-07-19 | 华中科技大学同济医学院附属同济医院 | 表达人类核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒及其制备方法 |
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2015
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1804041A (zh) * | 2005-12-22 | 2006-07-19 | 华中科技大学同济医学院附属同济医院 | 表达人类核心蛋白聚糖的重组腺相关病毒及其制备方法 |
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| CN106636149A (zh) * | 2017-01-03 | 2017-05-10 | 内蒙古农业大学 | 斯氏副柔线虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Pj_STPK基因克隆、原核表达方法及应用 |
| CN106636149B (zh) * | 2017-01-03 | 2019-10-25 | 内蒙古农业大学 | 斯氏副柔线虫丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Pj_STPK基因克隆、原核表达方法及应用 |
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